趙正陽， 索 欣， 陳 玲， 劉雄洲， 胡 健， 尹淑霞*

(1.北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院， 北京 100083； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 江蘇 南京 210095)

匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)為禾本科(Poaceae)翦股穎屬(Agrostis) 多年生冷季型草坪草，具有較強(qiáng)的耐寒性、耐陰性，極耐低修剪，坪觀質(zhì)量好，被廣泛用作冷涼地帶高爾夫球場果嶺草坪等運(yùn)動場建植[1-3]。

幣斑病是匍匐翦股穎草坪的重要病害之一，該病由幣斑病菌為害引致[4-5]。最新的研究[6-7]將幣斑病菌歸在Clarireedia屬，分為Clarireediahomoeocarpa，Clarireediabennettii，Clarireediajacksonii，Clarireediamonteithiana和Clarireediapaspali5個種。研究表明，草坪修剪高度過低、修剪頻率過高都會加速該病原菌的侵染[8]。幣斑病發(fā)生后，如不及時處理將會嚴(yán)重影響草坪的觀賞和使用價值。

當(dāng)前翦股穎幣斑病主要依靠化學(xué)防治，而頻繁施用化學(xué)藥劑易使幣斑病菌產(chǎn)生抗藥性[9-10]。國內(nèi)外關(guān)于草坪幣斑病菌抗藥風(fēng)險的研究多集中在病原菌自身的抗性頻率與對不同藥劑的交互抗性等方面，例如通過田間采集抗藥性菌株，室內(nèi)對其進(jìn)行殺菌劑的敏感性測定，或者運(yùn)用分子生物學(xué)方法揭示抗藥性機(jī)理[11]。植物病原菌對殺菌劑的抗性風(fēng)險由病原菌自身與藥劑共同決定[12-13]。啶酰菌胺通過抑制琥珀酸脫氫酶的活性，抑制病原菌孢子萌發(fā)與菌絲生長，不易與其他類型殺菌劑產(chǎn)生交互抗性，國外早在2004年便使用啶酰菌胺對草坪幣斑病進(jìn)行有效防治[14-15]。但該殺菌劑在國內(nèi)草坪管理中尚未廣泛應(yīng)用，目前不僅缺乏病原菌對啶酰菌胺的抗性風(fēng)險評價研究，而且對于病原菌對啶酰菌胺敏感性降低后其致病性是否會變化亦沒有明確結(jié)論。本研究旨在通過對啶酰菌胺不同敏感性的幣斑病菌致病性等特性進(jìn)行研究，為啶酰菌胺的抗藥性風(fēng)險評定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采自天津3家高爾夫球場(龍海高爾夫俱樂部，濱海湖高爾夫俱樂部和濱海森林高爾夫俱樂部)的幣斑病菌菌株106株，98%啶酰菌胺(boscalid)原藥購自湖北薪和化工有限公司，匍匐翦股穎品種‘克羅米’(‘Kromi’)的種子來自本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1幣斑病菌對啶酰菌胺的敏感性測定 參照聶秀美[16]的方法對采自天津的幣斑病菌分離、純化。采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM)[17]測定幣斑病菌對啶酰菌胺的敏感性。將啶酰菌胺原藥用丙酮配置成終濃度為質(zhì)量濃度1，10，100，1 000 μg·mL-1的含藥平板。將菌株在MM培養(yǎng)基上,25℃黑暗條件培養(yǎng)3 d后，在邊緣打取5 mm菌餅，接種至各濃度藥板上，每濃度重復(fù)3次，同時在空白對照中加入等體積的丙酮。于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測量各處理菌落直徑計算菌絲生長抑制率，求出毒力回歸方程和抑制中濃度(EC50/μg·mL-1)。以Chang[18]報道的幣斑病菌對啶酰菌胺的敏感基線4.67 μg·mL-1為參照，計算菌株的抗性水平，對抗性進(jìn)行分級。

敏感菌株(SS)：R<10，低抗菌株(LR):10≤R≤50，高抗菌株(HR)：R≥100[19]。

1.2.2菌落形態(tài)與同源性比對分析 從每種抗性菌株中隨機(jī)挑選2株，分別命名為高抗株(HR1，HR2)，低抗株(LR1，LR2)和敏感株(SS1,SS2)。6株菌株置于25℃恒溫黑暗培養(yǎng)14 d，觀察菌落形態(tài)并拍照。

參考章武[5]的方法，合成rDNA-ITS區(qū)通用引物ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)(北京科百奧生物技術(shù)有限公司合成)，以6個幣斑病菌菌株的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物委托睿博興科(北京)有限公司進(jìn)行DNA測序。將測序返回的基因序列與Gen-Bank核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并用MEGA 7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和進(jìn)化樹構(gòu)建，用Neighbor-joining法構(gòu)建進(jìn)化樹，自展次數(shù)為1 000次。

1.2.3病菌生長速率和生物量測定 將菌株活化后，用直徑6 mm的打孔器打取菌餅，菌面朝上，分別放置在普通馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基和表面鋪有滅菌玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上，每個菌株接種3皿，于25℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測定菌落直徑，單位為mm，計算病菌生長速率；將長有菌絲的玻璃紙取出，刮下表面菌絲并稱重[20]。每皿重復(fù)3次。

1.2.4病菌草酸產(chǎn)量測定 菌株活化后，分別取3枚菌餅放置在25 mL錐形瓶中，瓶中加入15 mL無菌馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液，于25℃，180 rpm搖床上培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)好的菌液濾去菌絲后，10 000 r·min-1離心濾液10 min，吸取1.8 mL上清液，采用比色法測定草酸產(chǎn)量[21]。每個菌株接種3瓶，每瓶取3次菌液進(jìn)行草酸含量測定。

1.2.5匍匐翦股穎發(fā)病率及病情指數(shù)測定 在蔡文涌[22]方法的基礎(chǔ)上略有改動。在匍匐翦股穎播種45 d后，選取生長一致的盆栽匍匐翦股穎，分別接種6個菌株，每個菌株用打孔器選取4枚直徑為6 mm的菌餅，均勻放置于匍匐翦股穎葉片上，對照組放置6 mm空白PDA培養(yǎng)基塊。每個處理設(shè)3組重復(fù)，共21盆。接菌前按三分之一原則修剪匍匐剪股穎，接菌后用去離子水噴濕葉片，并套袋保濕。接種后96 h統(tǒng)計發(fā)病率，并計算病情指數(shù)[23]。

病情指數(shù)=

1.2.6匍匐翦股穎葉片丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定 MDA含量測定參考王軍的方法[24]。分別于匍匐翦股穎接菌前0 h，接菌后6 h，12 h，24 h，48 h和96 h取樣，進(jìn)行匍匐翦股穎葉片丙二醛測定，在對照組(CK)的處理中，用6 mm空白PDA培養(yǎng)基塊代替試驗(yàn)組中的菌餅。每盆取葉片0.10～0.15 g，每次取樣范圍涵蓋盆內(nèi)所有植株。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0軟件對所測數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用描述統(tǒng)計模塊進(jìn)行Shapiro-Wilk法(W法)正態(tài)性檢驗(yàn)，用t檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用Excel 2016制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 幣斑病菌對啶酰菌胺的敏感性

106株幣斑病菌株對啶酰菌胺的敏感性結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，天津地區(qū)草坪幣斑病菌對啶酰菌胺的敏感性差異較大，106株菌株中，EC50最小值為1.45 μg·mL-1，最大值為637.54 μg·mL-1。經(jīng)W法正態(tài)性檢驗(yàn)，106株菌株EC50值頻次分布，W=0.35，P<0.001，呈非連續(xù)性分布。其中，93株敏感菌株的EC50值介于1.45～9.24 μg·mL-1之間(表1)，呈連續(xù)性正態(tài)分布，W=0.98，P=0.27>0.05(圖2)；11株低抗菌株的EC50值介于53.64～89.57 μg·mL-1之間(表1)；2株高抗菌株的EC50值分別為496.87 μg·mL-1，637.54 μg·mL-1(表1)，抗性菌株的EC50值呈非連續(xù)性分布(圖1)。

2.2 菌落形態(tài)

6株菌株培養(yǎng)14 d的菌落形態(tài)如圖3所示。HR1，HR2號菌株菌絲稀疏，菌絲為白色絮狀，少見有直立向上的氣生菌絲，菌絲多為匍匐生長。LR1，LR2號菌株氣生菌絲較為發(fā)達(dá)，菌絲密度高，部分菌絲附著在培養(yǎng)皿上蓋，菌落邊緣有部分菌絲聚集。SS1，SS2號菌株菌絲致密，能明顯看到菌絲積聚成團(tuán)，成團(tuán)后菌絲塌陷，部分菌落表面由白色變?yōu)榈稚?/p>

圖1 106株供試菌株菌絲生長EC50值頻率分布Fig.1 Frequency distribution of EC50 values for the mycelial growth of 106 strains of Clarireedia

圖2 對啶酰菌胺敏感的93株菌株菌絲生長EC50值頻率分布Fig.2 Frequency distribution of EC50 values for the mycelial growth of 93 sensitive strains of Clarireedia

2.3 菌株同源性比對分析

利用NCBI網(wǎng)站中的BLAST軟件，對所測菌株的序列進(jìn)行同源性比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。6個菌株與幣斑病病原菌的同源性均達(dá)到97%以上。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，本研究中的6株幣斑病原菌和Clarireedia屬的幣斑病菌聚在同一分類單元，但6個菌株分別屬于兩個種，其中HR2和LR1號菌株為C.monteithiana，其余菌株為C.jacksonii種。

表1 幣斑病菌對啶酰菌胺的敏感性Table 1 Sensitivity of Clarireedia to boscalid

圖3 不同菌株在PDA上25℃黑暗條件下培養(yǎng)14 d的菌落形態(tài)Fig.3 Cultural characteristics of different strains on PDA at 25℃ in dark(14 d)

2.4 菌株生長速率、菌絲生物量和草酸產(chǎn)量

不同菌株的生長速率、菌絲生物量和草酸產(chǎn)量如表2所示。

從菌株生長速率看，菌株HR1生長最慢，與其他5個菌株差異顯著(P<0.05)。菌株SS2生長最快，是HR1的1.52倍，是HR2的1.27倍，差異顯著(P<0.05)。同為高抗菌株的HR1和HR2，其生長速率差異顯著，但LR1與LR2以及SS1與SS2的菌絲生長速率則無顯著差異。

從菌絲生物量上看，HR1菌株生物量最低，僅為低抗菌株的34.7%～35.8%，與其他菌株間差異顯著(P<0.05)。SS2菌株生物量最高，是HR1菌株的3.86倍，與其他5個菌株差異顯著(P<0.05)。HR1,HR2菌株生物量與SS1,SS2菌株的生物量差異顯著(P<0.05)。LR1和LR2菌株的生物量無顯著差異。

從草酸產(chǎn)量上看，HR1菌株草酸產(chǎn)量最低，為低抗、敏感菌株產(chǎn)量的52.3%～56.4%，與其他菌株草酸產(chǎn)量差異顯著(P<0.05)。SS2菌株草酸產(chǎn)量最高，敏感(SS1和SS2)與低抗菌株(LR1和LR2)間的草酸產(chǎn)量無明顯差異，高抗(HR1和HR2)與敏感菌株(SS1和SS2)間草酸產(chǎn)量差異顯著(P<0.05)。

2.5 匍匐翦股穎發(fā)病率及病情指數(shù)

匍匐翦股穎接種不同菌株后96 h的發(fā)病率及病情指數(shù)如表3所示。

從發(fā)病率來看，除LR1和LR2外，相同抗性菌株(HR1和HR2，SS1和SS2)處理的匍匐翦股穎之間發(fā)病率差異顯著(P<0.05)，其中接種了HR1和HR2菌株的匍匐翦股穎發(fā)病率(分別為6.88%和25.33%)最低，與接種低抗菌株植物體的發(fā)病率相比，降幅在37.5%以上，與低抗、敏感菌株差異顯著(P<0.05)。接種了SS1和SS2菌株的匍匐翦股穎發(fā)病率(分別為58.46%和66.84%)最高，是高抗菌株的2.3～9.7倍，與低抗、高抗菌株差異顯著(P<0.05)。

從病情指數(shù)來看，接種了HR1和HR2菌株的匍匐翦股穎病情指數(shù)最低，分別為低抗菌株的28.4%～64.5%，與低抗、敏感菌株差異顯著(P<0.05)。接種了SS1和SS2菌株的匍匐翦股穎病情指數(shù)最高，是HR1菌株的4.5倍和6.1倍，與低抗、高抗菌株差異顯著(P<0.05)；接種LR1和LR2菌株的翦股穎病情指數(shù)無顯著差異。6個菌株侵染匍匐翦股穎后的發(fā)病率與病情指數(shù)高低表現(xiàn)一致。

圖4 基于ITS-rDNA序列采用鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed using Neighbor-Joining method based on ITS rDNA sequences

表2 不同菌株的生長速率、菌絲生物量和草酸產(chǎn)量Table 2 Growth rate,mycelial biomass and oxalic acid amount of different strains

表3 匍匐翦股穎接種不同菌株的發(fā)病情況Table 3 Incidence and disease index of creeping bentgrass inoculated with different strains

2.6 MDA含量變化

匍匐翦股穎接菌前與接菌后96 h內(nèi)的葉片MDA含量變化如圖5所示。

圖5 6株幣斑病菌株接種后匍匐翦股穎葉片的MDA含量變化Fig.5 Changes of MDA content in creeping bentgrass leaves inoculated with 6 Clarireedia strains

由圖5可知，隨著時間的推移，與CK相比，接菌的匍匐翦股穎葉片MDA含量均顯著上升，且呈現(xiàn)出先上升，再下降，最后又上升的趨勢。在6 h時，接菌處理的植物葉片MDA含量均大幅增加，其中HR1號菌株處理的翦股穎葉片MDA含量僅為5.37 μmol·g-1，顯著低于低抗菌株與敏感菌株處理(P<0.05)；SS2號菌株處理的葉片MDA含量達(dá)到10.36 μmol·g-1，是HR1處理的1.9倍，與HR1，HR2差異顯著(P<0.05)，低抗菌株處理組與敏感菌株處理組無明顯差異。在6～12 h，植物葉片中MDA含量出現(xiàn)了不同程度的下降，隨后整體呈上升趨勢。不同處理的植株葉片MDA含量在96 h達(dá)最大值，其中HR1號菌株處理的翦股穎葉片MDA含量最低，僅為5.98 μmol·g-1；SS1號菌株處理的葉片MDA含量最高，是HR1號菌株處理的2.56倍，高抗與敏感菌株處理的植株葉片MDA含量差異顯著(P<0.05)。

3 討論

幣斑病是高爾夫球場草坪主要病害之一，近年來幣斑病菌抗藥性問題逐漸顯現(xiàn)，北京、海南、江蘇等地[17]均報道有幣斑菌株群體對殺菌劑的敏感性下降情況。本研究在天津幣斑病菌群體中發(fā)現(xiàn)13株對啶酰菌胺敏感性下降的菌株，表明天津地區(qū)的幣斑病菌抗藥性問題已經(jīng)出現(xiàn)，在使用殺菌劑時應(yīng)加以重視。6株菌株分別屬于C.monteithiana，C.jacksonii兩種，與胡健研究的我國幣斑病菌分類結(jié)果一致[7]。

本研究分析了對啶酰菌胺不同敏感性幣斑病菌的致病性，病原菌的致病力強(qiáng)弱體現(xiàn)在多個方面。鄧小軍[25]的研究表明，致病力強(qiáng)的菌株生長速率與生物量均高于致病力弱的菌株，強(qiáng)致病力菌株的菌絲較弱致病力菌株的菌絲更為致密。本研究中致病性強(qiáng)的SS菌株菌絲生長致密，生長快，生物量大。幣斑病菌產(chǎn)生的草酸毒素是其致病能力的決定因子之一[26]。Nacarath[27]的研究中發(fā)現(xiàn)一株不產(chǎn)草酸的菌株，幾乎沒有致病力，施加外源草酸后致病力恢復(fù)。也有研究表明，在一定范圍內(nèi)，病菌對植株致病力強(qiáng)弱與草酸分泌量成正比[28-29]。本研究中HR菌株的草酸分泌量顯著低于SS菌株，尤其HR1菌株的草酸產(chǎn)量最低，其致病性也是6個菌株中最低的。李琨[30]的研究發(fā)現(xiàn)，與弱毒菌株相比，水稻白葉枯病菌強(qiáng)毒菌株能使水稻葉片MDA含量顯著增加。本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。由此可以說明，用單一指標(biāo)來評價病原菌致病性存在片面性和不穩(wěn)定性，用多個指標(biāo)進(jìn)行綜合評價可以更好地保證結(jié)果的可靠性。

病原菌對殺菌劑的敏感性下降后，往往會引起生物適合度的降低[15]。本研究結(jié)果也表明，啶酰菌胺敏感菌株，其致病力較強(qiáng)，總體表現(xiàn)為生長速率快、生物量高，草酸產(chǎn)量高，發(fā)病率、病情指數(shù)和植株葉片MDA含量等數(shù)據(jù)也表明致病力強(qiáng)的菌株侵染草坪草的能力更強(qiáng)。而對啶酰菌胺敏感性下降的菌株，其致病力也明顯降低。但也有研究表明，病原菌對殺菌劑的敏感性下降時，不會引起病原菌致病力的改變[31]，甚至對殺菌劑敏感性下降菌株的致病力等生物適合度出現(xiàn)了明顯增加[32]。由此可見，病原菌對藥劑敏感性變化對其致病力的不同影響，可能與菌株自身和藥劑種類有關(guān)，因此在研究啶酰菌胺的抗性風(fēng)險時，有必要針對啶酰菌胺敏感性下降菌株分析其致病力變化情況。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)天津幣斑病病原菌自然群體對啶酰菌胺的敏感性發(fā)生分化，部分菌株已產(chǎn)生抗藥性。其中啶酰菌胺對93株敏感病原菌EC50均值及頻率分布可以作為天津地區(qū)草坪幣斑病菌種群對啶酰菌胺抗性監(jiān)測的參考之一。HR1菌株對啶酰菌胺的敏感性降低與自身弱致病力產(chǎn)生的原因可能與HR2不同，HR1菌株可能作為低毒菌株而具有對草坪幣斑病生防的潛力[33]?？傮w上，對啶酰菌胺高抗菌株的致病性最弱，敏感菌株的致病性最強(qiáng)，低抗菌株的致病性介于二者之間。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究幣斑病菌對啶酰菌胺的抗藥性風(fēng)險奠定了基礎(chǔ)。