范菠菠， 張學(xué)峰， 于 卓， 趙 彥， 馬艷紅*

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019； 2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factors，TF)在植物抗非生物逆境中起關(guān)鍵作用，主要的TF家族有WKRY，bZIP，MYB，BHLH，NAC等[1-2]。其中NAC家族是植物特有的、最大的TF家族之一，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，其NAM結(jié)構(gòu)域由N端150個(gè)左右的氨基酸殘基組成，含有5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域A—E[3-5]，其中A，C，D子域具有高度保守性，B，E子域有較大可變性，使NAC轉(zhuǎn)錄因子表現(xiàn)出多種調(diào)節(jié)功能。首個(gè)NAC基因在矮牽牛(PetuniahybridaVilm)中被發(fā)現(xiàn)[6]，隨后在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)了ATAF1/2和CUC2基因[7]，之后NAC基因在許多其他物種中被檢測到。目前，植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB(2021年3月17日)中收錄了19 997個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，其中擬南芥138個(gè)、粳稻(Oryzasativasubsp.japonica)170個(gè)、秈稻(Oryzasativasubsp.indica)158個(gè)、小麥(Triticumaestivum)263個(gè)、大豆(Glycinemax)269個(gè)，NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的生長發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)[8-13]。在干旱脅迫處理葡萄(Vitisvinifera)砧木后，qRT-PCR分析表明VvNAC8，VvNAC17，VvNAC18，VvNAC26，VvNAC40，VvNAC8，VvNAC56共7個(gè)基因與抗旱相關(guān)[12]。對甘薯(IpomoeabatatasLam.)的IbNAC72基因研究發(fā)現(xiàn)，干旱處理的轉(zhuǎn)基因煙草根系會(huì)更加發(fā)達(dá)[14]。在干旱環(huán)境中水稻SNAC1基因的表達(dá)可提高22%～34%的結(jié)實(shí)率[8]。水稻ONAC066在干旱中起正向調(diào)控作用[15]。小黑麥(TriticosecaleWittmack)的TwNAC01基因在抗旱應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用[16]。擬南芥的ANAC069[17]、水稻的ONAC095在干旱脅迫中起負(fù)調(diào)控作用[18]。水稻的OsNAC006[19]，OsNAC14[20],大豆的GmNAC8[21]，GmNAC019[22]，GmNAC109[23]基因都對干旱脅迫有調(diào)控作用。

目前，影響植物生長發(fā)育的非生物逆境因素中干旱占首位，是造成作物產(chǎn)量大幅下降的主要逆境因素[24]。蒙古冰草(AgropyronmongolicumKeng)是耐旱性強(qiáng)的二倍體禾本科多年生牧草，具有作物遺傳改良的優(yōu)異抗旱基因資源[25-26]。NAC轉(zhuǎn)錄因子在作物干旱逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，但蒙古冰草抗旱相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究尚屬空白。本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對蒙古冰草NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員進(jìn)行鑒定，通過對NAC蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、磷酸化位點(diǎn)、保守基序等進(jìn)行分析，并與已報(bào)道具有抗旱功能的NAC蛋白進(jìn)行多序列對比、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以期為蒙古冰草抗旱NAC轉(zhuǎn)錄因子鑒定及作用機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

本試驗(yàn)材料為蒙古冰草，種子采自于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)薩拉齊牧草繁種基地。挑選顆粒飽滿的種子于室內(nèi)培養(yǎng)箱(BIC-300)水培生長，培養(yǎng)溫度為24℃，光周期為16 h，在三葉一心時(shí)期用含25% PEG-6000的1/5 Hoagland’s營養(yǎng)液進(jìn)行模擬干旱處理，每天定期補(bǔ)充蒸發(fā)水分，將未干旱處理的蒙古冰草葉片設(shè)置為對照(CK)。干旱處理12 h，24 h，48 h，3 d，5 d，7 d及復(fù)水24 h(fs24 h)的蒙古冰草葉片作為處理組，在每個(gè)處理時(shí)間取蒙古冰草葉片將其迅速放入預(yù)冷的無酶凍存管中，迅速轉(zhuǎn)移到—80℃冰箱進(jìn)行保存；每個(gè)處理時(shí)期3次重復(fù)，提取蒙古冰草葉片總RNA，委托杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2 蒙古冰草NAC轉(zhuǎn)錄因子篩選及結(jié)構(gòu)域鑒定

基于蒙古冰草轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，根據(jù)功能注釋初步篩選出37個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，用ORF Finder在線軟件(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder)對基因的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)進(jìn)行選擇，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)域比對，然后再用Pfam(http://pfam.xfam.org/)，CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)軟件進(jìn)行預(yù)測驗(yàn)證。

1.3 蒙古冰草NAC蛋白的理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位預(yù)測

通過Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)[27-28]對NAC蛋白的理化性質(zhì)[Isoelectric Point(PI)值，蛋白相對分子質(zhì)量，不穩(wěn)定指數(shù)，脂肪系數(shù)，親疏水性以及氨基酸數(shù)目]進(jìn)行分析；利用Softberry(http://linux1.softberry.com/)對NAC蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測。

1.4 蒙古冰草NAC蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

應(yīng)用NetPhos 3.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)[29]對蒙古冰草15個(gè)NAC蛋白序列中磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。

1.5 蒙古冰草NAC蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將蒙古冰草15條具有完整結(jié)構(gòu)域的NAC蛋白，與從Uniprot(https://www.uniprot.org/)及NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫挑選的57條擬南芥和具有抗旱功能的13條玉米、水稻、小麥和大豆等作物的NAC蛋白進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析，用MEGA 7.0[30]的Muscle進(jìn)行多序列比對，并基于相鄰連接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，應(yīng)用ITOL(https://itol.embl.de/)軟件進(jìn)行美化。

1.6 蒙古冰草NAC蛋白的保守基序及序列比對

利用MEME(https://meme-suite.org/meme/)軟件對蒙古冰草AmNAC102-2，AmNAC100及高度同源的小麥、水稻和小黑麥的NAC蛋白進(jìn)行保守基序分析，并通過DNAMAN6.0對這5條蛋白進(jìn)行多序列比對。

1.7 蒙古冰草NAC蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SOPMA[31](https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa_sopma. html)在線軟件對NAC蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，分析其中的螺旋、轉(zhuǎn)角、延伸鏈及無規(guī)則卷曲所占比例，用SWISS-MODEL[32](https://swissmodel.expasy.org/)對其進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.8 蒙古冰草抗旱NAC基因的qRT-PCR

用SnapGene 3.2.1對篩選出的蒙古冰草抗旱相關(guān)的AmNAC100和AmNAC102-2基因的特異性引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，以U6作為內(nèi)參基因(引物序列見表1)，并委托生工(Sangon，上海)合成。

表1 蒙古冰草抗旱相關(guān)NAC基因qRT-PCR引物序列Table 1 The sequence of qRT-PCR primers of drought resistance related NAC gene of A. mongolicum Keng

用FastQuant RT Kit(with gDNase)試劑盒(KR106)將蒙古冰草處理組及對照組的Total RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用MonAmp SYBR Green qPCR Mix試劑盒(MQ10201S)進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，每個(gè)處理4次生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)體系為MonAmp SYBR Green qPCR Mix試劑10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，Nuclease-Free Water 8 μL。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95℃，30 s，變性95℃，10 s，退火延伸62℃，30 s，循環(huán)數(shù)為45，在FTC-3000P上運(yùn)行程序。

用livak等的2-ΔΔCT法[34]計(jì)算蒙古冰草2個(gè)NAC基因的相對表達(dá)量，用SPSS 26.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古冰草NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定分析

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫挑選出注釋為NAC轉(zhuǎn)錄因子的37個(gè)基因，通過ORF分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測，獲得具有NAC蛋白結(jié)構(gòu)域的26個(gè)基因，其中11條NAM結(jié)構(gòu)域存在殘缺現(xiàn)象，14條NAC蛋白的NAM結(jié)構(gòu)域在150個(gè)氨基酸殘基左右，為完整的NAM結(jié)構(gòu)域；只有一條AmNACA2蛋白預(yù)測為完整的NAC-NACA結(jié)構(gòu)域(圖1)。

2.2 蒙古冰草NAC蛋白理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位分析

通過Protparam對26個(gè)NAC蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)NAC蛋白氨基酸數(shù)目在60～432之間，相對分子量在7 080.09～47 615.03之間；PI值為4.24～10.48，表明既有酸性蛋白也有堿性蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)在31.92～71.92之間，脂肪系數(shù)介于57.10～77.83，NAC蛋白的疏水性為—0.780～-0.257，表明所有蒙古冰草NAC蛋白均為親水性蛋白(表2)。

通過Softberry軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)AmNACA2,AmNAC1-2蛋白定位在線粒體，AmNAC046定位于細(xì)胞質(zhì)，其余蛋白均定位于細(xì)胞核，說明NAC蛋白主要在細(xì)胞核中行使功能，也有少數(shù)在其他細(xì)胞器中發(fā)揮作用。

2.3 蒙古冰草NAC蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

蛋白磷酸化是植物中普遍存在的一類現(xiàn)象，出現(xiàn)在植物蛋白激酶及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，屬于蛋白翻譯后修飾中的一種[31-32]。對蒙古冰草的15個(gè)NAC蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)其均含有絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸，其中磷酸化位點(diǎn)總數(shù)最多的是AmNAC103蛋白(41個(gè))，最少的是AmNAC036-4蛋白(8個(gè))。

圖1 蒙古冰草NAC家族序列結(jié)構(gòu)域Fig.1 Sequence domain of A. mongolicum Keng NAC family

表2 蒙古冰草NAC蛋白理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位Table 2 Subcellular localization and physicochemical properties of NAC protein of A. mongolicum Keng

表3 蒙古冰草NAC蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Table 3 The predicted phosphorylation sites of NAC proteins from A. mongolicum Keng

2.4 蒙古冰草NAC蛋白進(jìn)化關(guān)系分析

為研究蒙古冰草NAC蛋白家族的進(jìn)化關(guān)系，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，蛋白名標(biāo)簽分為6種顏色，將進(jìn)化樹分為Ⅰ～Ⅵ亞族。進(jìn)化樹枝的顏色從綠色到紅色過渡，代表同源性從0到1。縱觀整個(gè)進(jìn)化樹，除Ⅳ和Ⅴ亞族不含蒙古冰草NAC蛋白外，其余亞族中均有分布，說明Ⅳ和Ⅴ中的擬南芥蛋白與蒙古冰草NAC蛋白無進(jìn)化關(guān)系。AmNACA2蛋白單獨(dú)成一個(gè)分支，AmNAC073處于Ⅱ亞族與擬南芥AtNAC73,AtNAC10等在一個(gè)小支上。有7個(gè)蒙古冰草NAC蛋白處于第Ⅲ亞族，分別為AmNAC103，AmNAC071，AmNAC090-1，AmNAC090-2，AmNAC042，AmNAC036-1和AmNAC036-4。其余蒙古冰草蛋白都處于第Ⅵ亞族，其中AmNAC2-1與擬南芥AtNAC50在同一支上；AmNAC100與小黑麥的抗旱蛋白TwNAC01[16]同源性極高；AmNAC041與擬南芥AtNAC83處于同一分支；AmNAC2-2，AmNAC047-1與AtNAC47有較近進(jìn)化關(guān)系；AmNAC102-2蛋白與抗旱功能已知的小麥TaNAC6[34]和水稻OSNAC6[35]，OsNAC5[36]同源性較高。由此推測AmNAC100和AmNAC102-2參與干旱脅迫調(diào)控。

2.5 蒙古冰草抗旱相關(guān)的NAC蛋白二、三級結(jié)構(gòu)分析

對AmNAC100和AmNAC102-2進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，結(jié)果表明AmNAC100蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占51.26%，α-螺旋占25.49%，延伸與β-轉(zhuǎn)角分別占16.25%，7.00%；AmNAC102-2蛋白中無規(guī)則卷曲占58.62%，α-螺旋占13.10%，延伸與β-轉(zhuǎn)角分別占20.69%，7.59%；TaNAC6中無規(guī)則卷曲占67.11%，α-螺旋占18.12%，延伸和β-轉(zhuǎn)角分別占11.07%，3.69%；水稻OsNAC5中無規(guī)則卷曲占60.49%，α-螺旋占22.19%，延伸和β-轉(zhuǎn)角分別占12.46%和4.86%；小黑麥中TwNAC01無規(guī)則卷曲占53.98%，α-螺旋占22.73%，延伸和β-轉(zhuǎn)角分別占16.48%，6.82%(圖3)。由以上數(shù)據(jù)可知，蒙古冰草的2個(gè)抗旱相關(guān)NAC蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲為主，其次含α-螺旋、延伸和轉(zhuǎn)角。

NAC蛋白三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)AmNAC100與TwNAC01空間構(gòu)型一致；AmNAC102-2與TaNAC6，OsNAC5蛋白空間構(gòu)型保持一致(圖4)，與蛋白進(jìn)化樹中同源關(guān)系相一致。

圖3 NAC蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure of NAC protein注：藍(lán)色，α-螺旋；紫色，無規(guī)則卷曲；紅色，延伸；綠色，β-轉(zhuǎn)角Note:Bue,alpha-helix;purple,random coil;red,extended strand;green,beta turn

圖4 NAC蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Tertiary structure of NAC protein

2.6 蒙古冰草抗旱相關(guān)NAC蛋白基序及保守結(jié)構(gòu)域分析

保守基序分析發(fā)現(xiàn)，5個(gè)NAC蛋白輸出的有效motif有8個(gè)，均含有motif 1，2，3和8(圖5)，說明這4個(gè)motif是蒙古冰草AmNAC100和AmNAC102-2蛋白的共有基序。AmNAC102-2蛋白不含motif4，其motif 1，2，3和8與TaNAC6，OsNAC5一致；AmNAC100與TwNAC01都含有motif5，6，7，這兩個(gè)蛋白基序結(jié)構(gòu)一致。

將蒙古冰草AmNAC100，AmNAC102-2與小麥、水稻和小黑麥的已知抗旱功能NAC蛋白進(jìn)行多序列比對發(fā)現(xiàn)，其保守結(jié)構(gòu)域均分為A—E亞結(jié)構(gòu)域，其中D，E亞結(jié)構(gòu)域是重要的DNA結(jié)合區(qū)域，A亞結(jié)構(gòu)域在NAC二聚體蛋白形成中發(fā)揮作用。

圖5 抗旱相關(guān)NAC蛋白基序Fig.5 The motif of NAC protein related to drought resistance

圖6 保守結(jié)構(gòu)域的多序列比對Fig.6 Multiple sequence alignment of conserved domains

2.7 蒙古冰草2個(gè)抗旱相關(guān)的NAC基因的表達(dá)分析

蒙古冰草抗旱相關(guān)的AmNAC100和AmNAC102-2在25% PEG-6000處理期間表達(dá)量均高于CK。其中AmNAC100基因干旱處理12 h，3 d以及復(fù)水24 h的相對表達(dá)量分別是CK的15.37，18.70和14.65倍(P<0.05)，只有干旱處理24 h后AmNAC100基因相對表達(dá)量與CK差異不顯著；AmNAC102-2基因相對表達(dá)量較高的處理組有12 h，48 h，3 d及復(fù)水24 h，分別是CK的7.34，3.67，4.04以及7.12倍(P<0.05)(圖7)，表明蒙古冰草的2個(gè)NAC基因在25% PEG-6000 模擬干旱處理中均可被誘導(dǎo)表達(dá)。

圖7 25% PEG-6000 干旱脅迫下蒙古冰草抗旱相關(guān)的NAC基因相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression of drought resistance related NAC genes in Agropyron mongolicum Keng under 25% PEG-6000 drought stress注：不同小寫字母表明差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level

3 討論

為篩選與蒙古冰草抗旱相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子，本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)篩選出26個(gè)蒙古冰草NAC家族成員，其中15個(gè)具有完整NAC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)蒙古冰草NAC轉(zhuǎn)錄因子均屬于親水性蛋白，與大豆、苦蕎、蘋果等[32,37-38]對NAC蛋白親疏水性的研究結(jié)果一致。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)蒙古冰草NAC蛋白主要定位于細(xì)胞核中，有2個(gè)定位于線粒體中、1個(gè)在細(xì)胞質(zhì)中，說明大部分蛋白在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，少數(shù)在其他細(xì)胞器中行使功能。

大量研究表明NAC蛋白在非生物脅迫中起正調(diào)控作用，比如IbNAC72[14]，SNAC1[8]，ONAC066[15]等。將15個(gè)NAC蛋白與擬南芥和已知抗旱功能的13個(gè)NAC蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，預(yù)測到2個(gè)抗旱相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子，其余蒙古冰草NAC蛋白分布于Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅵ亞族中。處于同亞族的蒙古冰草NAC基因與其他物種的NAC基因同源性存在差異，推測是由環(huán)境和物種間差異引起的，這與周棋贏、黃文娟和榮玉萍的研究一致[5,37,39]。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果與方志紅研究結(jié)果一致，均含有絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸磷酸化位點(diǎn)[32]。二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)蒙古冰草AmNAC100與TwNAC01結(jié)構(gòu)相似，AmNAC102-2與TaNAC6，OsNAC5相似，推測其有相同的抗旱功能。

保守結(jié)構(gòu)域承載著基因的重要遺傳信息，對其發(fā)揮特定調(diào)控功能具有重要意義[5,40]，擁有相同的保守結(jié)構(gòu)域可能發(fā)揮相似的功能。根據(jù)Hisako等人對NAC蛋白保守結(jié)構(gòu)域的劃分，將5個(gè)抗旱相關(guān)NAC蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分為A—E亞結(jié)構(gòu)域[41]，通過顏色來區(qū)分NAC蛋白序列的保守關(guān)系，黑色區(qū)域表示序列相似性在100%即完全相同，粉紫色代表相似性≥75%，淺藍(lán)色表示相似性在50%及以上，黃色表示相似性在33%以上，無色代表相似性在0～33%。通過著色可以清晰的看到保守性從高到低依次為A>C>D>B>E，高保守性結(jié)構(gòu)域用來維持NAC基因特定功能，有研究表明保守的NAC結(jié)構(gòu)域承擔(dān)DNA結(jié)合的功能[41]；子域B和E的保守性相對較小，是可變動(dòng)的結(jié)構(gòu)域，推測其可用來激活調(diào)控植物其他功能[41]。

王婉妮對干旱脅迫下3種葡萄砧木進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，NAC基因相對表達(dá)量均高于對照[12]；張歡等對甘薯抗旱基因IbNAC72的qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，其在20% PEG-6000處理中相對表達(dá)量均高于對照，起正調(diào)控作用[14]，這與本研究結(jié)果相似。本試驗(yàn)中qRT-PCR分析表明，經(jīng)過生物信息學(xué)篩選得到蒙古冰草2個(gè)抗旱相關(guān)的AmNAC100和AmNAC102-2基因，在25% PEG-6000干旱處理下其相對表達(dá)量上升，呈上調(diào)表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究首次從蒙古冰草轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中篩選鑒定出26個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，得到15個(gè)有完整結(jié)構(gòu)域的NAC蛋白，通過進(jìn)化關(guān)系比對及保守基序,保守結(jié)構(gòu)域和NAC蛋白二、三級結(jié)構(gòu)分析，獲得2個(gè)抗旱相關(guān)的AmNAC100和AmNAC102-2基因，對其進(jìn)行差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)其在干旱脅迫中起正調(diào)控作用。