楊婉秋， 敬 潔， 朱 靈， 高永恒1,*

(1.中國科學(xué)院成都生物研究所, 四川 成都 610041; 2.中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049；3.中國科學(xué)院成都山地災(zāi)害與環(huán)境研究所, 四川 成都 610041)

川西北高寒草甸位于青藏高原東緣，不僅是我國5大牧區(qū)之一，也是黃河上游重要的水源涵養(yǎng)區(qū)和集水區(qū)，在國家生態(tài)建設(shè)戰(zhàn)略總布局中具有極其重要的地位[1]。隨著全球氣候變化和人類活動的不斷加劇，川西北高寒草甸生產(chǎn)力降低等生態(tài)系統(tǒng)退化問題日趨嚴(yán)峻[2-3]，對當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)和黃河上游生態(tài)功能區(qū)造成了嚴(yán)重威脅。目前施肥是改善和恢復(fù)退化草甸的有效途徑[4]，但化肥的大量使用會導(dǎo)致土壤酸化板結(jié)、微生物群體結(jié)構(gòu)破壞等一系列環(huán)境問題[5]。因此，研究開發(fā)對環(huán)境友好的新型肥料代替?zhèn)鹘y(tǒng)化肥是當(dāng)下提升高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)功能的安全有效途徑。

植物根際促進(jìn)菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)是指生存于植物根際土壤中或者附生于植物根系上，能顯著促進(jìn)植物生長發(fā)育及其對礦物質(zhì)營養(yǎng)的吸收利用，并能緩解外界環(huán)境對植物的脅迫、提高植物抗病蟲害能力的一類有益微生物[6]。研究發(fā)現(xiàn)，PGPR可以通過溶磷、固氮和解鉀等方式促進(jìn)植物對土壤中有效元素的吸收，提高植物抗病性及抗逆性，進(jìn)而提高植物的生產(chǎn)力[7]。近年來，以根際促生菌作為接種劑的新型微生物肥料替代或部分替代化肥逐漸成為當(dāng)前土壤肥料學(xué)的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

目前，有關(guān)草地植物根際促生菌的研究，在歐洲草原和我國北方草原進(jìn)行了較廣泛的探索研究，內(nèi)容涉及PGPR的菌株篩選和特性(溶磷、固氮、解鉀、分泌植物激素和信號類物質(zhì))、促生效果以及作用機(jī)理等方面[8-12]。近年來，在氣候惡劣的青藏高原高寒地區(qū)，高寒草地PGPR的研究引起了不少關(guān)注，對藏北高寒草原和高原北部的高寒草甸PGPR已有一些研究。其中，在西藏阿里的高寒草原篩選出固氮菌和溶磷菌等多種PGPR，并發(fā)現(xiàn)這些促生菌對植物有較好的促生作用[13]；在東祁連亞高山草甸篩選出的促生菌不僅具有較強(qiáng)的固氮、溶磷能力，還能分泌赤霉素、3-吲哚乙酸等[14-15]。但是，在PGPR的多功能特性、菌株種屬鑒定和促生機(jī)理等方面，仍有待更深入的研究[16]。此外，不少研究表明不同區(qū)域和不同植物的PGPR存在較大差異[17-18]，為選育出具有地區(qū)針對性的優(yōu)良菌株，就需要在特定區(qū)域下進(jìn)行相關(guān)研究。盡管如此，目前對青藏高原東緣的川西北地區(qū)高寒PGPR菌株篩選及其特性的研究鮮有報道。

本研究以川西北區(qū)域廣泛分布的四川嵩草(Kobresiasetchwanensis)、垂穗披堿草(Elymusnutans)、異葉米口袋(GueldenstaedtiadiversifoliaMaxim)、多支黃芪(ScutellariabaicalensisGeorgi)和高山紫菀(Asteralpinus)5種高寒草甸植物為對象，從其根際土壤和根系中分離細(xì)菌菌株，并對這些菌株溶磷、固氮和解鉀特性進(jìn)行定性定量分析測定，篩選出兼具多種特性的高效菌株，并利用分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行分類鑒定，以期為開發(fā)適用于川西北高寒草甸的生物菌肥提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源，同時也為高寒地區(qū)農(nóng)牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境保護(hù)與建設(shè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣邛溪鎮(zhèn)(32°50′07″ N，102°35′34″ E)，平均海拔在3 500 m以上。該地為典型的大陸高原寒溫帶季風(fēng)氣候，日照時間長，晝夜溫差較大，年均溫1.1℃，≥10℃年積溫322℃，年均積雪期達(dá)70 d以上，無絕對的無霜期。年平均降水量792 mm，降水主要集中在5—9月。研究區(qū)土壤類型以亞高山草甸土為主，其優(yōu)勢種植被以垂穗披堿草和四川嵩草為主，伴生種有異葉米口袋、高山紫菀等[19]。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1土壤樣品的采集 土壤樣品取自5種主要的高寒草甸植物：莎草科的四川嵩草、禾本科的垂穗披堿草、豆科的異葉米口袋、多支黃芪和菊科的高山紫菀。樣品于2019年7月采自邛溪鎮(zhèn)圍欄禁牧5年的試驗(yàn)樣地，采用5點(diǎn)取樣法(即分別選取樣方4個頂點(diǎn)和中心位置)采集5種植物根際(根系和土壤)樣品，采樣深度0～15 cm，各點(diǎn)樣品混合均勻后，暫時低溫保存于便攜式冰箱并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，過2 mm土壤篩后于4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2主要培養(yǎng)基 細(xì)菌的分離和純化使用金氏培養(yǎng)基(King’s B medium，KB)和牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(Nutritional Agar medium，NA)，溶磷菌篩選培養(yǎng)基包括無機(jī)磷培養(yǎng)基(Pikovaskaia’s medium，PKO)和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基，固氮菌的篩選使用無氮培養(yǎng)基(Nitrogen-free medium，NFM)，解鉀菌的篩選使用解鉀固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基除不含瓊脂，其他物質(zhì)含量與對應(yīng)的培養(yǎng)基相同[20]，菌株形態(tài)學(xué)特征鑒定使用LB(Luria-Bertani medium，LB)固體培養(yǎng)基，菌株的生理生化特性測定使用糖發(fā)酵培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基和淀粉培養(yǎng)基[21-22]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1植物根際促生菌分離和篩選 為了解PGPR在植物根際的分布，一般將根際分為3個部分，即根表土(Soil adhering to roots，RS)、根系表面(Rhizoplan or surface of roots，RP)和根內(nèi)(Histoplan or interior of roots，HP)3個區(qū)域[23]。

用平板涂布法[21]在KB和NA培養(yǎng)基上分離3個區(qū)域的細(xì)菌。具體方法如下：抖落植物根系根際以外的土后，稱取1 g根系放入9 mL(0.85%)滅菌生理鹽水中，旋渦振蕩器5 000 r·min-1振蕩5 min，靜置20 min，上清液即RS 10-1稀釋液；無菌水沖洗振蕩后的根系3次，將根系放入試管中并加9 mL滅菌生理鹽水和5顆玻璃珠，振蕩方法同上，上清液即RP 10-1稀釋液；將制備完RP菌液的根系放入75%的乙醇溶液中1 min，無菌水沖洗3次，吸干表面水分，稱取0.5 g根系研碎，加入4.5 mL生理鹽水中并同上方法振蕩，上清液即HP 10-1稀釋液。按梯度稀釋法分別制備10-2，10-3，10-4，10-5梯度的根表土、根系表面和根內(nèi)含菌懸液。然后將制備好的各濃度稀釋液用微量移液槍(槍頭滅菌)吸取50 μL分別接種在已滅菌的KB和NA固體培養(yǎng)基上，每個梯度3次重復(fù)，接種完成后的培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，28℃恒溫培養(yǎng)3 d，篩選菌落形態(tài)大、生長速度快的菌株并利用交叉劃線法進(jìn)行純化，獲得純菌株，將其保存于4℃冰箱中備用，定期進(jìn)行轉(zhuǎn)接保存。

1.3.2溶磷菌株篩選及溶磷特性測定 將純化后的菌株分別點(diǎn)接至PKO培養(yǎng)基和蒙金娜培養(yǎng)基上，每株菌重復(fù)3次，以不接種的培養(yǎng)基為對照。用溶磷圈法定性測定溶磷特性，培養(yǎng)箱中恒溫28℃培養(yǎng)2 d后，分別測定其溶磷圈直徑D與菌落直徑d，依據(jù)溶磷菌株的D/d對溶磷能力做出定性判定。篩選出的溶磷菌株在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每個菌株設(shè)置3個重復(fù)，在28℃，180 r·min-1的搖床上培養(yǎng)4 d，將發(fā)酵液在4℃，5 000 r·min-1的條件下離心20 min，采用鉬藍(lán)比色法測定發(fā)酵液上清液中可溶性磷的含量。用紫外分光光度計(jì)測定吸光值，根據(jù)吸光值OD630在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相對應(yīng)的磷質(zhì)量濃度，具體計(jì)算公式如下：

式中：P為標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的磷質(zhì)量濃度(μg·mL-1)；V表示顯色液的體積(mL)；Ts表示分取倍數(shù)；V0表示發(fā)酵液的體積(mL)。

1.3.3固氮菌株篩選及固氮特性測定 采用乙炔還原法[24]測定菌株固氮酶活性。將純化后的菌株利用交叉劃線法接種到NFM固體培養(yǎng)基上，每個菌株接種3個培養(yǎng)皿，培養(yǎng)箱中恒溫28℃培養(yǎng)3 d后,記錄能在培養(yǎng)基中生長的促生菌菌株編號，即為有固氮能力的菌株。菌株的固氮酶活性采用乙炔還原法測定：挑選一環(huán)固氮菌接種至盛有5.0 mL半固培養(yǎng)基(2%～7%的固體培養(yǎng)基瓊脂含量，其他物質(zhì)含量與NFM培養(yǎng)基相同)、容積為35.0 mL的西林瓶中，28℃恒溫培養(yǎng)2 d，用5.0 mL的醫(yī)用注射器抽取3.0 mL混合空氣，同時加入等量的C2H2氣體，封口膜密封，恒溫28℃培養(yǎng)2 d，抽取50 μL混合氣體注入氣相色譜儀(型號為GC7890F)氣體進(jìn)樣柱內(nèi)，觀察記錄C2H4的出峰時間和峰面積值，C2H4的標(biāo)準(zhǔn)氣濃度為138 mg·mL-1。氣相色譜儀工作條件為：150℃柱溫，120℃進(jìn)氣樣溫度，130℃檢測器溫度，0.1 MPa氫氣氣壓，0.3 MPa氮?dú)鈿鈮海?.2 MPa空氣氣壓。測定菌株的固氮酶活性，其計(jì)算公式如下：

固氮酶活性[nmol(C2H4)·h-1·mL-1]=

式中：hx表示樣品C2H4峰面積值；C表示C2H4摩爾濃度(nmol·mL-1)；V表示西林瓶容積(mL)；hs表示標(biāo)準(zhǔn)C2H4峰面積值；t表示樣品培養(yǎng)時間(h)；24.9表示標(biāo)準(zhǔn)C2H4氣體在測試時的體積(mL)。

1.3.4解鉀菌株篩選及解鉀特性測定 將純化后的菌株點(diǎn)接至解鉀固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)水解圈，并測定透明圈直徑D與菌落直徑d，菌株的解鉀特性依據(jù)D/d做出定性判定。將解鉀菌株接種至NA培養(yǎng)基中，以不接菌的NA培養(yǎng)基為對照，在28℃，180 r·min-1的搖床上培養(yǎng)2 d得到發(fā)酵液。發(fā)酵液于8 000 r·min-1的冷凍離心機(jī)中離心8 min，取上清液測定溶液中可溶性鉀含量。利用原子吸收分光光度計(jì)測定溶液中可溶性鉀含量，其計(jì)算公式如下：

細(xì)菌溶解鉀的量(μg·mL-1)=
發(fā)酵液可溶性鉀含量-對照培養(yǎng)液可溶性鉀含量

1.3.5菌株形態(tài)學(xué)特征鑒定 利用交叉劃線法將供試菌株接種至LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中28℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察并記錄各促生菌菌落形狀、大小、顏色等特征，此外，每隔24 h進(jìn)行記錄菌株的生長速度，生長速度表示為：24 h為快、48 h為中、72 h為慢，通過革蘭氏染色法初步鑒定菌株。

1.3.6菌株生理生化特征 糖發(fā)酵試驗(yàn)：將供試菌株分別接種在盛有葡萄糖、甘露糖和木糖的糖培養(yǎng)基中，每組重復(fù)3次，培養(yǎng)箱中恒溫28℃培養(yǎng)1 d后觀察記錄培養(yǎng)基的顏色變化，菌株產(chǎn)堿時培養(yǎng)基變?yōu)樽仙?，菌株產(chǎn)酸時培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，分別標(biāo)記為陰性、陽性。

淀粉水解試驗(yàn)：將供試菌株點(diǎn)接至淀粉培養(yǎng)基，對照處理為不接種的純培養(yǎng)基，恒溫28℃培養(yǎng)24 h后，在培養(yǎng)基表面滴加少量盧戈氏碘液，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿使其均勻鋪滿表面并觀察，若菌落周圍出現(xiàn)無色透明圈，則標(biāo)記為陽性，反之標(biāo)記為陰性。

明膠液化試驗(yàn)：將供試菌株在明膠培養(yǎng)基上進(jìn)行點(diǎn)接種，恒溫28℃培養(yǎng)，對照處理為純不接種培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 d后對裝有菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行觀察記錄，若明膠液化，標(biāo)記為陽性，說明明膠酶存在于該菌株內(nèi)，反之標(biāo)記為陰性。

1.3.7菌株16SrDNA基因序列分析 使用DP336離心柱型促生菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，保存于-20℃冰箱內(nèi)。以總DNA為模板，利用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′來擴(kuò)增16SrDNA近全長片段。PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 25.0 μL，10umol·L-1引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL(20 ng左右)，滅菌去離子水補(bǔ)足至22.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性5 min，98℃變性10 s，55℃復(fù)性15 s，72℃延伸20 s，共循環(huán)35次，72℃終延伸5 min。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后送深圳海一時代基因有限公司測序。在GenBank(http:// www.ncbi.nlm.nih.Gov)中將測序所得16SrDNA序列與已報道細(xì)菌菌株進(jìn)行同源性比較，找出同源性較高的序列進(jìn)行相似性分析,使用序列分析軟件MEGA 7.0 進(jìn)行多重序列比對，結(jié)合16SrDNA序列鑒定以及生理生化特征鑒定結(jié)果，并同時根據(jù)《常見促生菌系統(tǒng)鑒定手冊》[22]最終確定菌株種類。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)采用SPSS 24.0(IBM，Armonk，NY USA)統(tǒng)計(jì)軟件對不同菌株的溶磷、固氮和解鉀能力進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較；使用Origin 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并制圖；利用軟件MEGA 7.0 進(jìn)行Clustal W比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物間根際菌株的分布

首篩得到59株菌株，經(jīng)過復(fù)篩得到44株菌落形態(tài)大、生長速度較快的菌株，篩選結(jié)果如表1所示。四川嵩草、垂穗披堿草、異葉米口袋、多支黃芪和高山紫菀5種植物根際菌株分別占菌株總數(shù)的18.2%，18.2%，22.7%，27.3%和13.6%。總體來看，植物根際菌株資源比較豐富，RP，HP和RS 3個區(qū)域的菌株數(shù)量分別占比50.0%，27.3%，22.7%，整體呈現(xiàn)RP>HP>RS的分布趨勢。

表1 不同植物根際菌株分布情況Table 1 The distribution of strains in rhizosphere of plant

2.2 功能菌株的篩選及相關(guān)功能的測定

菌株溶磷特性測定結(jié)果：通過觀察菌株能否在培養(yǎng)基上產(chǎn)生溶磷圈，篩選出25株能溶解無機(jī)磷的菌株和24株能溶解有機(jī)磷的菌株，其中，有21株菌株能夠同時溶解無機(jī)磷和有機(jī)磷(圖1)。溶磷菌株的無機(jī)磷溶磷量在8.91～90.27 μg·mL-1之間，菌株間溶磷能力差異顯著，其中RPNY4的溶磷量最大，可達(dá)90.27 μg·mL-1，此外，RSNQ4，RPKS4，RPNZ3，RPKY3，RPNY4，RPNH5，HPKS3和HPKH5這8株菌株的溶無機(jī)磷量均達(dá)到60 μg·mL-1以上，具有高效的溶解無機(jī)磷能力。24株可溶解有機(jī)磷的溶磷菌株溶磷量介于10.58～75.13 μg·mL-1之間，其中，RSNQ4，RPNZ3，HPKS3，RPNY4，HPKH5和RPKQ4這6株菌株的溶磷量達(dá)到50 μg·mL-1以上。

圖1 菌株的溶磷能力Fig.1 Capacities of phosphorus-dissolving of strains注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

菌株固氮特性測定結(jié)果：從分離的44株菌株中，進(jìn)一步分離篩選出20株固氮菌株，其固氮酶活性如圖2A所示。20株固氮菌株的固氮酶活性在5.23～64.87 nmol(C2H4)·h-1·mL-1之間，固氮酶活性在各菌株間差異顯著。固氮酶活性低于30 nmol(C2H4)h-1·mL-1的菌株占40%，固氮能力相對較差；固氮酶活性大于50 nmol(C2H4)·h-1·mL-1的有4株，分別為RSNZ3，RPNY4，HPKY3和HPKY4。

菌株解鉀特性測定結(jié)果：分離篩選共獲得21株解鉀菌株(圖2B)。解鉀菌株的解鉀量范圍在9.23～73.21 μg·mL-1之間，其中RSNY4菌株的解鉀量最大，為73.21 μg·mL-1，解鉀量大于60 μg·mL-1的有3株，分別為RSNY4，RPKQ5和RPKS4。

通過對菌株促生效應(yīng)的測定結(jié)果綜合分析，最終篩選出12株兼具溶磷、固氮和解鉀的PGPR菌株(表2)，菌株編號為：RSNQ4，RPKQ5，RSNY4，RPNY4，HPKY3，RSNZ3，RPKZ4，RPNZ3，RPKS4，HPKS3，HPKH5，HPKY4，對上述菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性及分子生物學(xué)鑒定。

2.3.1菌株形態(tài)學(xué)特征 表2顯示12個菌株形態(tài)學(xué)特性。大部分菌株生長速度較快，只有RPNZ3和RSNZ3生長速度慢；菌落顏色包括黃色和白色2種，只有RPNY4和RSNZ3為白色，其余菌株顏色均為黃色；大部分供試菌株的菌落形狀為橢圓形，只有RPNY4，RSNZ3，RSNY4和HPKS3菌株的菌落形狀為圓形；革蘭氏染色供試菌株的結(jié)果均為陽性。

圖2 菌株的固氮、解鉀能力Fig.2 Capacities of nitrogen-fixingand potassium-releasing of strains

表2 菌株形態(tài)學(xué)特征Table 2 Phenotypic characteristics and Gram staining results of strains

2.3 優(yōu)質(zhì)菌株的篩選

2.3.2菌株生理生化特性 各個菌株的生理生化特性如表3所示。在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，菌株RPNZ3，RSNY4和HPKH5菌株不能利用D-葡萄糖、D-甘露糖和D-木糖，其余菌株均可以利用3種糖發(fā)酵培養(yǎng)基；在淀粉水解利用試驗(yàn)中，菌株RPKQ5，RPKS4，RSNZ3，RSNQ4，HPKS3和HPKY4可以進(jìn)行水解，其余菌株則不能對淀粉進(jìn)行水解利用；在明膠液化試驗(yàn)中，所有供試菌株都可以在明膠培養(yǎng)基中將明膠液化。

2.3.3菌株16SrDNA基因序列 對PGPR菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，12株菌株的16SrDNA基因序列與選擇對比序列間的相似度均高于99%(表4)。它們分別歸屬于6個菌屬，其中RPKQ5，RPNZ3，HPKS3，HPKY4，HPKY3以及RPNY4這6株促生菌菌株均屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)；RSNQ4和RPKS4屬于沙雷氏菌屬(Serratia)；RSNY4，HPKH5，RPKZ4和RSNZ3分別屬于假單胞菌屬(Pseudomoas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、戴爾福特菌屬(Delftia)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)。

表3 菌株生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains

表4 優(yōu)良PGPR菌株的分子生物學(xué)鑒定Table 4 Molecular biology identification of excellent PGPR strains

3 討論

川西北高寒地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)脆弱，退化的高寒草甸迫切需要綠色高效的肥料來改善土壤環(huán)境，修復(fù)已退化的生態(tài)系統(tǒng)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，微生物菌肥為草地修復(fù)指明了方向。PGPR是微生物菌肥的重要來源，目前雖然由PGPR研發(fā)的菌肥已廣泛應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中[25-26]，但是對高寒草甸PGPR的研究明顯不足。因此，從高寒草甸主要植物根際篩選促生菌菌株，為研發(fā)適合川西北高寒草甸使用的微生物菌肥提供了優(yōu)良菌株資源，可為退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)和管理提供新的途徑。

本研究對川西北高原四川嵩草、垂穗披堿草、異葉米口袋、多支黃芪和高山紫菀5種高寒草甸植物的根際促生菌進(jìn)行了分離和篩選。共篩選出根際促生菌菌株44株，其中從豆科植物多支黃芪和異葉米口袋根際篩選出的PGPR多于其他3種植物根際，這與張英等[26]在西藏阿里地區(qū)高寒草原上的研究結(jié)果相似。這一現(xiàn)象可能與植物本身有關(guān)，不同菌株與寄主植物存在一定的專一性關(guān)系，如具有高效固氮功能的根瘤菌常見于一些豆科植物中[27]。從菌株在植物根際不同部位分布來看，其在根際表面分布最多，這與馬文文[28]和馬驄毓等[29]對高寒草地植物根際菌株分布規(guī)律的研究結(jié)果一致。菌株的這種分布模式一方面可能與根際特殊的生理代謝活動有關(guān)，使得某些根際分泌物有利于微生物分布在RP區(qū)域。Williams和Russo[30]研究發(fā)現(xiàn)植物根部分泌的甘露聚糖可以介導(dǎo)土壤微生物大量附著在植物根部表面；另一方面，根表作為根土界面，是根系相關(guān)活動影響最直接的部位，相比于RS和HP區(qū)域，能夠積累更多的根系分泌物以及土壤中的一些營養(yǎng)物質(zhì)，為微生物生長提供了豐富的營養(yǎng)和良好的環(huán)境條件[27]。

通過測定菌株的溶磷能力發(fā)現(xiàn)，5種植物根際促生菌的溶磷量存在較大差異，四川嵩草根際篩選的菌株溶解無機(jī)磷能力要強(qiáng)于其他4種植物，而多支黃芪根際的菌株溶解有機(jī)磷的能力最強(qiáng)，菌株溶解無機(jī)磷和有機(jī)磷的能力均高于張英[13]對西藏高寒草原植物篩選的溶磷菌，這種結(jié)果可能是2個研究所選擇的植物種類不同所致。研究表明，菌株溶磷能力與植物種類有關(guān)：溶磷菌主要是通過釋放有機(jī)酸，如葡萄糖酸和2-酮葡萄糖酸，來溶解磷酸鈣和巖石中的磷，不同植物根際促生菌的種類和數(shù)量存在較大差異，所產(chǎn)生的有機(jī)酸的種類和濃度不同，菌株體內(nèi)代謝碳源的途徑也不同，進(jìn)而表現(xiàn)出植物間不同的溶磷效果[31]。此外，菌株的溶磷能力還與土壤養(yǎng)分有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)溶磷菌在缺乏無機(jī)氮源的情況下，生長量和溶磷量顯著降低[31]，而川西北的高寒草甸土壤養(yǎng)分要顯著高于西藏高寒草原，這也就很好地解釋了本研究篩選的溶磷菌的溶磷能力強(qiáng)于張英等所篩選的溶磷菌[13]。本研究篩選的20株固氮菌中，其固氮酶活性在5.23～64.87 nmol(C2H4)·h-1·mL-1之間，整體上高于西藏阿里高寒草原植物根際固氮菌的固氮酶活性[13]，但低于東祁連高寒草甸植物根際菌株的固氮能力[32]，這可能由于3個不同研究區(qū)域氣候差異而造成的。固氮酶活性主要是指微生物體內(nèi)鉬鐵固氮酶(由鐵蛋白和鉬鐵蛋白組成)等的酶活，它受外界氣候條件影響很大，特別是溫度[33]。一般來說，生長在氣溫低、生長季短的區(qū)域的植物，其固氮酶活性相對較低[34]。對解鉀菌株而言，從四川嵩草根際獲得的菌株其解鉀量要高于其他植物，解鉀量介于9.23～73.21 μg·mL-1之間。解鉀菌的解鉀作用受土壤礦物種類和含量、土壤類型、pH值、土壤溫度及環(huán)境中鉀離子濃度等多種因素影響，盛下放和黃為一[35]發(fā)現(xiàn)當(dāng)土壤中鉀離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.5～75.8 mg·kg-1時，解鉀菌的解鉀能力最強(qiáng),且解鉀量與礦粉粒徑密切相關(guān),隨礦粉粒徑的減小而增加。此外，解鉀量還與寄主植物的種類有關(guān)，有學(xué)者對比研究菊科的加拿大一枝黃花(Solidagocanadensis)和禾本科的白茅(Imperatacylindrica)根際促生菌發(fā)現(xiàn)，加拿大一枝黃花根際解鉀菌解鉀量要顯著多于白茅根際解鉀菌[36]。目前，鮮有關(guān)于青藏高原地區(qū)解鉀菌的報道，尚無法與青藏高原其他地區(qū)菌株解鉀量進(jìn)行比較，但本研究中大部分解鉀菌的解鉀量大于26.5 mg·kg-1，表明篩選出的菌株具有較強(qiáng)的解鉀能力[35]。需要指出的是，本研究中菌株的溶磷、固氮和解鉀特性是在實(shí)驗(yàn)條件下(28℃)的測定結(jié)果，而這一培養(yǎng)溫度下菌株的特性與高寒草甸自然環(huán)境下可能會存在一定差異?？紤]到菌株在未來的實(shí)用性，篩選的12株多功能促生菌在自然環(huán)境下的促生特性以及對植物的促生效應(yīng)有待進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。

篩選出的12株菌株分別歸屬于不動桿菌屬、沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、戴爾福特菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬，其中7株為假單胞菌目。在12株優(yōu)良菌株中，有4株來自異葉米口袋，3株來自高山紫菀，其他每種植物只篩選到1～2株，因此，高山紫菀和異葉米口袋可作為篩選優(yōu)良菌株的主要目標(biāo)植物。目前，國內(nèi)外學(xué)者篩選的PGPR菌株已涵蓋了多個菌屬，常見的有假單胞菌、芽孢桿菌等，但不同研究所篩選的菌株種類存在較大差異，有研究者從豆科植物苜蓿(Medicagosativa)的根際篩選出的促生菌主要為芽孢桿菌[37]。產(chǎn)生這種差異的原因可能與研究地區(qū)的生態(tài)環(huán)境和菌株的生長習(xí)性有關(guān)，林啟美[38]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和假單胞菌在不同生態(tài)系統(tǒng)土壤中的數(shù)量存在較大差異，假單胞菌在各個生態(tài)系統(tǒng)分布比較廣泛，而芽孢桿菌在草地生態(tài)系統(tǒng)中較多。已有大量研究表明，從植物根際篩選的假單胞菌、芽孢桿菌等促生菌，尤其是生長在逆境中的促生菌，不僅對植物生長具有良好的促生效果，還具有抗旱性、抗鹽性及抗堿性等抗逆特點(diǎn)，這些優(yōu)良的根際促生菌在農(nóng)牧業(yè)上得到了廣泛的應(yīng)用[39-40]。因此，本研究篩選的12株多功能菌株，有望在川西北地區(qū)草地修復(fù)與生產(chǎn)力維持中得到應(yīng)用并收到明顯效果。

4 結(jié)論

川西北高寒草甸不同植物根際分布的促生菌數(shù)量不盡相同，四川嵩草、垂穗披堿草、異葉米口袋、多支黃芪和高山紫菀5種植物根際促生菌數(shù)量分別占比18.2%，18.2%，22.7%，27.3%和13.6%；植物根際促生菌在根際不同部位的分布數(shù)量存在明顯差異，呈現(xiàn)RP>HP>RS的分布特征。

篩選獲得44株菌株中，具有溶解無機(jī)磷和有機(jī)磷能力的菌株分別有25株和24株，具有固氮能力的菌株20株，具有解鉀能力的菌株21株。12株兼具溶磷、固氮和解鉀功能菌，歸屬于不動桿菌屬、沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、戴爾福特菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬，可作為川西北高寒草甸專用新型生物菌肥的潛在優(yōu)質(zhì)菌種資源。