符 娜，向 均，張永江，張祥林

(1.烏魯木齊海關(guān)技術(shù)中心，烏魯木齊 830011; 2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123)

0 引 言

【研究意義】玉米極易受到檢疫性病毒-玉米褪綠斑駁病毒(Maizechloroticmottlevirus，MCMV)的侵染。受該病毒的入侵的玉米，其主要癥狀是染病植株的葉片逐漸失綠、變黃，隨后整片葉呈現(xiàn)黃綠相間的斑駁條斑[1]。當(dāng)MCMV單獨(dú)侵染會(huì)導(dǎo)致玉米產(chǎn)量降低10%～15%[2]。在田間MCMV與玉米矮花葉病毒(Maizedwarfmosaicvirus，MDMV)、甘蔗花葉病毒(Sugarcanemosaicvirus，SCMV)及小麥線條花葉病毒(Wheatstreakmosaicvirus，WSMV)等馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)的病毒進(jìn)行復(fù)合侵染，引起嚴(yán)重的玉米致死性壞死病(Maizelethalnecrosisdisease，MLND)[3]，致使玉米產(chǎn)量損失高達(dá)90%[4]。MCMV可經(jīng)玉米種子、介體甲蟲、薊馬等方式傳毒。目前MCMV在美國(guó)、秘魯、阿根廷、法國(guó)、南非和澳大利亞等國(guó)家均有發(fā)生[5]，在我國(guó)部分地區(qū)也有發(fā)生報(bào)道[6]。納米酶試紙條具有成本低，操作簡(jiǎn)單，適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。建立的納米酶免疫層析試紙條在玉米褪綠斑駁病毒大范圍傳播之前具有提前預(yù)警的效果，也為縮短該病毒的快速檢測(cè)時(shí)間?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，用于鑒定和檢測(cè)MCMV的方法主要包括血清學(xué)方法、分子生物學(xué)和納米磁珠轉(zhuǎn)換熒光檢測(cè)法。Stenger D C[7]等提出酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是最常見(jiàn)的用于MCMV的血清學(xué)檢測(cè)方法。，Wen等[8]、Zhang等[9]分別根據(jù)該病毒外殼蛋白基因的保守序列，設(shè)計(jì)了特異性引物及TaqMan熒光探針，建立了檢測(cè)MCMV的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法。高利增等[10-17]提出了“納米酶”的概念，納米酶材料的出現(xiàn)，為檢測(cè)該病毒提供了一種新的方法。【本研究切入點(diǎn)】目前，還未有文獻(xiàn)報(bào)道MCMV納米酶免疫層析試紙條的出現(xiàn)。將帶有MCMV納米酶標(biāo)記的鼠抗體IgG與硝酸纖維素膜質(zhì)控線上的鼠抗體結(jié)合，建立納米酶免疫層析試紙條檢測(cè)技術(shù)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以MCMV為研究對(duì)象，將帶有MCMV納米酶標(biāo)記的鼠抗體IgG與硝酸纖維素膜質(zhì)控線上的鼠抗體結(jié)合，并在二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine, DAB)的作用下進(jìn)行顯色，建立納米酶免疫層析試紙條檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

MCMV鼠抗IgG與甘蔗花葉病毒(sugarcane mosaic virus, SCMV)、水稻矮縮黑條病毒(rice black-streaked dwarf virus , RBSDV)、大麥黃矮病毒(barley yellow dwarf virus, BYDV)、小麥線條花葉病毒(wheat streak mosaic virus，WSMV)毒源均來(lái)自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院。其它供試樣品由海關(guān)截獲，編號(hào)為1#～6#。

生化試劑：羊抗兔IgG純化抗體、納米酶溶液來(lái)自中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所、聚氯乙烯板(PVC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、牛血清蛋白(BSA)、硝酸纖維素膜(NC)、二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine, DAB)顯色試劑、植物總RNA提取試劑盒、Easy Script One-Step RT-PCR Super Mix。

供試儀器：XYZ三維劃膜噴金儀(BioDot-XYZ)、微電腦自動(dòng)斬切機(jī)(BioDot- cm5000)、磁力架(12孔)、PCR儀(WD-94028 D)、離心機(jī)(Eppendorf5425D)、超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2F)、雙頻臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器(SK3200LHC)。

PCR引物：參照龔海燕等[2]的方法合成下列引物對(duì)。

MCMVF：5'ATGGCGGCAAGTAGCCGGTCTACCCGAGGTAGAA3'

MCMVR：5’TCAATGATTTGCCAGCCCTGGGCCTGGAACC3'

1.2 方 法

1.2.1 試紙條制備

將長(zhǎng)度為2 cm的吸水墊、2.5 cm NC膜、1.5 cm的玻璃纖維膜依次貼在6 cm PVC上，制成空白試紙條。利用XYZ三維劃膜噴金儀在空白試紙條的NC膜表面分別噴上間隔0.5 cm的羊抗鼠抗體(C線)，特異性的MCMV抗體(T線)。并在37℃烘箱中烘干，干燥保存。

1.2.2 樣品制備

在研磨皿中放入0.1 g待測(cè)樣品，加入液氮，充分研磨。后加入5 mL的1% BSA-PBS研磨；5 500 r/min離心20 min，取上清；再次離心，取上清，-20℃冷凍，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗體與納米酶顆粒的偶聯(lián)

取500 mL(1 mg/mL)納米酶溶液，渦旋震蕩混合，加1 mL ddH2O，并放入超聲波清洗器中振蕩30 s，棄上清液。將1 mL活化劑(NHS、EDC)添加至500 mL納米酶溶液中，渦旋震蕩混合后靜置30 min。將50 mg MCMV抗體與450 mL醋酸鈉溶液(50 mM, pH=6.0)混合，添加至納米酶溶液中，振蕩混勻，置于旋轉(zhuǎn)混勻儀中避光孵育4℃過(guò)夜。將孵育溶液放置磁力架上，澄清后棄上清，加入1 mL終止液(Tris-Hcl)并置于旋轉(zhuǎn)混勻儀(4℃，3 h)，棄上清。加入1 mL 的5%BSA-PBS，超聲混勻，置于旋轉(zhuǎn)混勻儀(4℃，3 h)上震蕩，棄上清。加入500 mL的1% BSA-PBS，制成抗體納米酶偶聯(lián)復(fù)合物，儲(chǔ)存于4℃冰箱中。

1.2.4 樣品檢測(cè)

將上述抗體納米酶偶聯(lián)復(fù)合物用1% BSA-PBS稀釋5倍，震蕩混勻，制成納米酶稀釋液。取65 mL待測(cè)樣品研磨液，將其與5.5 mL納米酶稀釋液混合，滴加至試紙條加樣孔，層析15 min。最后將1 mL配制好的DAB底物液滴入用棉花覆蓋的顯色窗中，顯色7 min。若試紙條同時(shí)出現(xiàn)C線和T線，則檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；僅出現(xiàn)C線，則檢測(cè)結(jié)果為陰性；出現(xiàn)T線，則檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，需重新測(cè)試。

1.2.5 樣品RNA提取

用植物總RNA提取試劑盒提取MCMV葉片，將提取的該病毒RNA按梯度稀釋，-20℃保存?zhèn)溆?。取待測(cè)樣品1#～6#號(hào)，用植物總RNA提取試劑盒提取各待測(cè)樣品RNA, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 待測(cè)樣品RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)

取各待測(cè)樣品(1#～6#)RNA，分別放入PCR管，每管中分別加入2× One step Reaction Mix 25 mL，RNA-Free H2O 18.6 mL，上游引物0.8 mL，下游引物0.8 mL，Enzyme Mix 0.8 mL，RNA 4 mL，充分混合均勻后置于PCR儀中，50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共28個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min后結(jié)束反應(yīng)；PCR反應(yīng)產(chǎn)物送生物技術(shù)公司做基因測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米酶試紙條檢測(cè)靈敏度

研究表明，NISA方法的靈敏度是RT-PCR法的100倍。圖1，圖2

注：1.空白對(duì)照；2.10-3；3.10-4；4.10-5；5.10-6；6.10-7；7.10-8

注：1.空白對(duì)照；2.10-1；3.10-2；4.10-3；5.10-4；6.10-5

2.2 納米酶試紙條特異性

研究表明，僅有MCMV出現(xiàn)C線和T線，其它病毒只出現(xiàn)了C線，未出現(xiàn)T線，也無(wú)其它非特異性吸附，該試紙條具有良好的特異性。圖3

注：1.空白對(duì)照；2.MCMV；3.RBSDV；4.SCMV；5.BYDV；6.WSCV

2.3 納米酶試紙條檢測(cè)待測(cè)樣品

研究表明，在3個(gè)樣品(1#、2#和6#、)的C線和T線分別出現(xiàn)了紅褐色條帶，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；在3份樣品中(3#、4#、5#、)C線出現(xiàn)了紅褐色條帶，T線無(wú)顯示，檢測(cè)結(jié)果為陰性。所有陽(yáng)性樣品的核苷酸序列與已報(bào)道的GeneBank庫(kù)中(GU594293.1)MCMV序列高度一致，一致性達(dá)99.56%。納米酶試紙條法檢測(cè)供試樣品中攜帶MCMV的結(jié)果可靠。圖4，圖5

注：1.空白對(duì)照；2. 2～7供試樣品(1#～6#)

注：1.空白對(duì)照； 2～7待測(cè)樣品(1#～6#)。

3 討 論

納米酶試紙條對(duì)玉米褪綠斑駁病毒的研磨液靈敏度的檢測(cè)，同RT-PCR相比具有更高的靈敏度，在檢測(cè)過(guò)程中會(huì)有植物組分對(duì)試紙條背景色的影響，可以通過(guò)稀釋研磨液解決。試紙條對(duì)其它4種病毒進(jìn)行特異性驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果表明，該試紙條只能檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒,對(duì)其它病毒非特異性吸附?？贵w的特異性在很大程度上影響試紙條特異性檢測(cè)該病毒。隨機(jī)選取的待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，試紙條檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR以及基因測(cè)序結(jié)果一致，表明該試紙條檢測(cè)結(jié)果可靠。

試紙條在檢測(cè)、儲(chǔ)存時(shí)間上需要進(jìn)一步改善。不同大小尺寸的納米酶對(duì)試紙條靈敏度的影響。目前，該試紙條還無(wú)法同時(shí)檢測(cè)侵染玉米的多種病毒，也無(wú)法做到定量檢測(cè)，這是后續(xù)需要開(kāi)展的研究。

4 結(jié) 論

納米酶試紙條檢測(cè)MCMV研磨液的靈敏度比RT-PCR檢測(cè)MCMV的靈敏度高100倍，應(yīng)用該方法檢測(cè)其它4種病毒也具有良好的特異性。納米酶試紙條檢測(cè)6份供試樣品，其中3份為陽(yáng)性，3份為陰性；經(jīng)RT-PCR法及基因測(cè)序法驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果可靠。該方法具有較高的靈敏度、良好的特異性以及檢測(cè)結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn)。