周 實(shí)，李錦蓮，郭曉玲，張樹(shù)萌，孟令仁，武冬梅

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

0 引 言

以嘌呤堿基為生物標(biāo)志物的細(xì)胞電化學(xué)法因其靈敏度高、可即時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)成為常見(jiàn)環(huán)境污染物毒性評(píng)價(jià)的新方法[1, 2]. 對(duì)細(xì)胞電化學(xué)法應(yīng)用范圍起到限制作用的主要是電極的靈敏度和性質(zhì)，常規(guī)電極只能檢測(cè)到黃嘌呤(X)和鳥(niǎo)嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和次黃嘌呤(HX)的混合信號(hào)，并且無(wú)法檢測(cè)到嘌呤代謝終產(chǎn)物尿酸(UA)的存在[3]，利用GOQDs/MWCNTs/SPCE*電極檢測(cè)到V79細(xì)胞中UA與G/X、A和HA的四個(gè)電化學(xué)信號(hào)，選取最佳檢測(cè)條件，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中UA,A,HX的定量分析.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞(V79細(xì)胞)，DMEM培養(yǎng)基，氧化石墨烯量子點(diǎn)(GOQDs)，高純多壁碳納米管(MWCNTs)，尿酸(UA)，黃嘌呤(X)，鳥(niǎo)嘌呤(G)，腺嘌呤(A)，次黃嘌呤(HX)，絲網(wǎng)印刷電極(SPCE，SE100). 恒電位儀(CHI 660)；高效液相色譜儀系統(tǒng)(G1311Agilent 1100).

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與檢測(cè)

DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和1%的青霉素/鏈霉素配成完全培養(yǎng)基，V79細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，結(jié)束后，采用原位細(xì)胞裂解法[4]處理細(xì)胞后25℃下進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè). 高效液相色譜檢測(cè)(HPLC)樣品用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣檢測(cè).

2 結(jié)果與討論

2.1 富集電位對(duì)混合溶液電化學(xué)信號(hào)的影響

圖1為不同富集電位下五種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的電化學(xué)曲線(xiàn)圖. 除去富集電位為0.3 V時(shí)UA的信號(hào)最弱，富集電位的改變對(duì)四個(gè)電化學(xué)信號(hào)沒(méi)有明顯影響.

2.2 富集時(shí)間對(duì)混合溶液電化學(xué)信號(hào)的影響

圖2為不同富集時(shí)間下五種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的電化學(xué)曲線(xiàn)圖. 圖中UA的電化學(xué)信號(hào)(信號(hào)1)隨富集時(shí)間的增加而增加，300s處的信號(hào)最強(qiáng)；G/X的電化學(xué)信號(hào)(信號(hào)2)在90s處最大；A(信號(hào)3)和HX(信號(hào)4)的電化學(xué)信號(hào)隨富集時(shí)間的增加而增加，240s后電化學(xué)信號(hào)幾乎沒(méi)有變化. 考慮實(shí)驗(yàn)擬對(duì)五種標(biāo)準(zhǔn)品混合液同時(shí)檢測(cè)及檢測(cè)時(shí)間的限制，選取240s為最佳富集時(shí)間.

圖1 富集電位對(duì)混合溶液電化學(xué)信號(hào)的影響

圖2 富集時(shí)間對(duì)混合溶液電化學(xué)信號(hào)的影響

2.3 pH對(duì)混合溶液電化學(xué)信號(hào)的影響

研究五種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的氧化峰電位和氧化峰電流在不同pH下的變化情況. 四個(gè)電化學(xué)信號(hào)的氧化峰電位(圖3 A)隨pH的變化而呈線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程分別為：EUA= 0.7004 - 0.0559 pH(R2= 0.9942)、EG/X= 1.0022 - 0.0476 pH(R2= 0.9943)、EA= 1.3098 - 0.0520 pH(R2= 0.9934)、EHX= 1.2875 - 0.0431 pH(R2= 0.9935). 斜率值與理論值接近，說(shuō)明五種標(biāo)準(zhǔn)品混合物在電極表面發(fā)生的是兩電子和兩質(zhì)子氧化反應(yīng). 而四個(gè)電化學(xué)信號(hào)的氧化峰電流(圖3 B)總體趨勢(shì)均隨著pH的增加而下降，說(shuō)明酸性條件下有利于五種標(biāo)準(zhǔn)品混合液的檢測(cè).

圖3 pH對(duì)五種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液(A)氧化峰電位

2.4 V79細(xì)胞的嘌呤含量分析

對(duì)V79細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，四個(gè)電化學(xué)信號(hào)(圖4 A)分別歸屬于UA,G/X,A和HX的氧化.

圖4 V79細(xì)胞的電化學(xué)曲線(xiàn)

3 結(jié) 語(yǔ)

實(shí)現(xiàn)了V79細(xì)胞中UA,G/X,A和HA的同時(shí)檢測(cè)，該電化學(xué)法為嘌呤核苷酸生理代謝過(guò)程研究提供了新方法.