譚顯東，陳 楠，王 浪，魏 琨，吉栗漫

（成都信息工程大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，四川 成都 610225）

靈芝（Ganoderma lucidum）又名仙草、瑞草，屬靈芝屬，多孔菌科真菌，其中包括赤芝和紫芝的干燥子實(shí)體[1]。屬擔(dān)子菌門（Basidionmycota），擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes），非褶菌目（Aphyllophorales），靈芝科（Ganodermataeea）類真菌。靈芝三萜類化合物是靈芝中除靈芝多糖外另一類重要的活性物質(zhì)。它的基本構(gòu)成是由30個(gè)碳原子組成，具有很高的脂溶性，其分子質(zhì)量通常在400～600之間，具有比較復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)由六個(gè)異戊二烯單位聚合而成。三萜類化合物大多數(shù)為四環(huán)和五環(huán)三萜，少數(shù)為鏈狀、單環(huán)、雙環(huán)和三環(huán)三萜[2]。靈芝三萜類化合物具有保肝護(hù)肝、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗氧化、降血脂血糖等功效[3-4]，在食品生產(chǎn)加工以及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

三七（Panax notoginseng）藥渣中含有大量的粗蛋白、粗纖維、粗多糖、粗脂肪等有機(jī)物和磷、鈣、鎂等礦質(zhì)元素以及一些微量元素鋅、錳等，適合作為發(fā)酵基質(zhì)使用[5]。相關(guān)研究人員以三七渣為原料，變廢為寶，成功開發(fā)了多種高附加值的產(chǎn)品[6-7]。采用靈芝固態(tài)發(fā)酵三七渣生產(chǎn)靈芝三萜可以為三七渣的資源化利用開辟一條新的途徑，但三七渣的營(yíng)養(yǎng)組成不能滿足靈芝生長(zhǎng)及靈芝三萜合成的需求。本研究以三七渣為基質(zhì)，固體發(fā)酵生產(chǎn)靈芝三萜，通過單因素試驗(yàn)及Box-Behnken試驗(yàn)對(duì)三七渣固體培養(yǎng)基的制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，使其更適合靈芝生長(zhǎng)及靈芝三萜的合成。選擇采用三七渣培養(yǎng)基產(chǎn)靈芝三萜，既能夠?qū)崿F(xiàn)三七渣的資源化利用，提高其附加值，又能夠?yàn)殪`芝三萜的生產(chǎn)提供一條新的低成本途徑，以期為工業(yè)規(guī)模利用三七渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)靈芝三萜提供培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

川芝6號(hào)（國(guó)品認(rèn)菌2007045，川審菌2004007）：由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所微生物室提供；三七渣：取自成都市某中成藥廠，經(jīng)日曬、烘干、粉碎、過篩后置于干燥器中備用，主要成分為真蛋白9.97%、粗蛋白12.28%、粗纖維27.45%、還原糖2.19%、總糖48.87%、淀粉30.35%[8]。

1.1.2 化學(xué)試劑

酵母浸出粉（生化試劑）、齊墩果酸（純度＞98%）、磷酸二氫鉀、葡萄糖（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子液培養(yǎng)基：20 g土豆，2.0 g葡萄糖，0.3 g酵母粉，0.2 g蛋白胨，0.1 g KH2PO4，0.06 g MgSO4，1 000 mL蒸餾水。

121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：20g土豆，2.0g葡萄糖，0.3g酵母粉，0.2 g蛋白胨，0.1 gKH2PO4，0.06 g MgSO4，2.0 g瓊脂粉，1 000 mL蒸餾水。121 ℃滅菌20 min。

三七渣固體培養(yǎng)基：采用過60目篩的三七渣10.00 g，酵母浸出粉3%，培養(yǎng)基初始含水量為60%，pH自然。121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SF-130中藥分析研磨機(jī)：長(zhǎng)沙中南制藥機(jī)械廠；PYX-280H-C恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱：廣東韶關(guān)科力試驗(yàn)儀器有限公司；QYC—211水浴恒溫振蕩器：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；VT1300L-U超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司：LDZX-50KB高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)：日本SHIMADZU公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

將川芝6號(hào)接入PDA培養(yǎng)基中，于28 ℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)7～8 d，用于菌種的活化擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3.2 種子液制備及固態(tài)發(fā)酵

用打孔器在PDA培養(yǎng)基的邊緣打取0.25 cm2的靈芝菌絲塊，接入裝液量為100 mL/250 mL種子液培養(yǎng)基中，置于水浴恒溫振蕩器中，在150 r/min、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)4 d，得到靈芝菌種子液。將川芝6號(hào)孢子種子液10%接種至三七渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為12 d。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

分別考察三七渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母浸出粉添加量（0、1%、2%、3%、4%、5%、6%）、磷酸二氫鉀添加量（0、0.125%、0.250%、0.375%、0.500%、0.625%）、初始水含量（30%、40%、50%、60%、70%、80%）對(duì)靈芝三萜產(chǎn)量的影響。

（2）Box-Behnken試驗(yàn)[9]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以靈芝三萜產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，酵母粉添加量（A）、磷酸鹽添加量（B）及培養(yǎng)基初始含水量（C）為自變量，采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件，并用-1、0、1對(duì)每個(gè)自變量的低、中、高3個(gè)水平進(jìn)行編碼，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 靈芝三萜含量的測(cè)定[10-11]

準(zhǔn)確稱取0.50 g發(fā)酵培養(yǎng)物，置于50 mL比色管中，加入12.5 mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇進(jìn)行超聲處理（溫度40 ℃；功率250 W；時(shí)間45 min），超聲處理結(jié)束后，加體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液定容至50 mL，搖勻，再經(jīng)過5 000 r/min離心10 min，取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

吸取0.1 mL上清液置于比色管中（空白樣加0.1 mL無水乙醇），用沸水浴加熱煮干其中的溶劑，再依次加入5%的香草醛溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻后放入水浴鍋中60 ℃保溫處理20 min。取出冷卻，加5 mL冰乙酸，搖勻，在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定其吸光度值。

以齊墩果酸為對(duì)照品，采用上述方法制作齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算發(fā)酵培養(yǎng)物中靈芝三萜的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 酵母浸出粉添加量對(duì)靈芝三萜產(chǎn)量的影響

氮源是影響微生物酶合成的重要因素之一[12]，相對(duì)于無機(jī)氮源而言，靈芝能夠更好地利用有機(jī)氮源[13]。C/N對(duì)微生物的生長(zhǎng)影響較大，適宜的C/N能夠更好的促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的生成[14]。有研究表明酵母提取物是產(chǎn)生三萜類化合物的最佳氮源[15-16]，因此本次研究按0、1%、2%、3%、4%、5%、6%的比例在三七渣中添加酵母浸出粉，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，考察其對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)物中靈芝三萜產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酵母浸出粉添加量對(duì)靈芝三萜產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of yeast extract powder addition on Ganoderma lucidum triterpenoids yield

由圖1可以看出，酵母浸出粉添加量在0～3%范圍內(nèi)的增大，靈芝三萜的產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)酵母浸出粉添加量為3%時(shí)，靈芝三萜產(chǎn)量達(dá)到最大值，為0.39%；當(dāng)酵母浸出粉添加量＞3%之后，靈芝三萜產(chǎn)量有所下降。這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)牡从兄诰w的生長(zhǎng)、發(fā)育和次級(jí)代謝，但當(dāng)?shù)催^多時(shí)會(huì)使轉(zhuǎn)錄因子Are A在促進(jìn)氮源代謝的過程時(shí)還會(huì)激活硝酸還原酶產(chǎn)生抑制靈芝三萜合成的NO，導(dǎo)致靈芝三萜產(chǎn)量降低[17-18]，只有添加合適量的氮源才能夠促進(jìn)靈芝菌體的生長(zhǎng)及靈芝三萜的合成。因此，最佳酵母浸出粉添加量為3%。

2.1.2 初始含水量對(duì)靈芝三萜產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基的初始含水量是影響固態(tài)發(fā)酵過程中次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的重要因素之一[19]。本次試驗(yàn)中分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始含水量為：30%、40%、50%、60%、70%、80%，考察培養(yǎng)基初始含水量對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)物中靈芝三萜產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 初始含水量對(duì)靈芝三萜產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of initial moisture contends on Ganoderma lucidum triterpenoids yield

由圖2可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基初始含水量為30%～60%時(shí)，靈芝三萜的產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)培養(yǎng)基初始含水量為60%時(shí)，靈芝三萜產(chǎn)量達(dá)到最大值，為0.38%；當(dāng)培養(yǎng)基初始含水量＞60%之后，靈芝三萜的產(chǎn)量隨之下降。這與采用中藥渣發(fā)酵[20]、竹粉發(fā)酵[21]培養(yǎng)靈芝的研究結(jié)果相似。含水量過低或者過高都不利于靈芝三萜的生產(chǎn)，這是因?yàn)橐环矫?，適當(dāng)?shù)暮坎庞欣谠擉w系熱傳遞以及CO2、O2的交換；另一方面，三七渣基質(zhì)顆粒間的自由水也能夠作為良好的載體起到一定的傳質(zhì)作用。當(dāng)基質(zhì)中含水率過低時(shí)，基質(zhì)中的自由水不足以維持靈芝的生長(zhǎng)需求，進(jìn)而破壞其新陳代謝平衡；當(dāng)基質(zhì)中含水率過高時(shí)，培養(yǎng)基容易黏結(jié)成團(tuán)，從而影響物料的透氣性，不利于微生物生長(zhǎng)繁殖及代謝產(chǎn)物的生成[22]。因此，最佳培養(yǎng)基初始含水量為60%。

2.1.3 磷酸鹽添加量對(duì)靈芝三萜產(chǎn)量的影響

磷元素是多種微生物細(xì)胞組成物質(zhì)，如菌體核酸、蛋白、細(xì)胞膜等的重要成分[23]；鈣元素能夠中和菌體生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸，還有助于菌體細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[24]；鉀元素能夠?qū)?xì)胞內(nèi)酸堿度起到一定的調(diào)節(jié)作用，另外在酶促反應(yīng)中還可作為輔助因子或激活劑。由此可見，無機(jī)鹽是影響微生物菌體生長(zhǎng)和繁殖的重要因素[25]。

本研究選取磷酸二氫鉀作為磷源。在三七渣基質(zhì)中按0、0.125%、0.250%、0.375%、0.500%、0.625%的比例添加KH2PO4，考察其對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)物中靈芝三萜產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 磷酸二氫鉀添加量對(duì)靈芝三萜產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of potassium dihydrogen phosphate addition on Ganoderma lucidum triterpenoids yield

由圖3可知，當(dāng)磷酸二氫鉀添加量為0～0.125%時(shí)，靈芝三萜的產(chǎn)量隨著磷酸二氫鉀添加量的增加而增加；當(dāng)磷酸二氫鉀添加量為0.125%時(shí)，靈芝三萜產(chǎn)量達(dá)到最大值，為0.36%；當(dāng)磷酸二氫鉀添加量＞0.125%之后，靈芝三萜的產(chǎn)量隨之下降。當(dāng)磷酸二氫鉀添加量繼續(xù)增大，靈芝三萜含量會(huì)逐漸減少?？赡艿脑蛟谟冢自靥砑舆^量，會(huì)導(dǎo)致滲透壓的不平衡以及抑制參與中心代謝和次級(jí)代謝等的一系列基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而對(duì)靈芝菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成起到抑制作用[26-27]。因此，最佳磷酸二氫鉀添加量為0.125%。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以靈芝三萜產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，酵母粉添加量（A）、磷酸鹽添加量（B）及培養(yǎng)基初始含水量（C）為自變量，采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

通過Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到靈芝三萜產(chǎn)量（Y）對(duì)酵母浸出粉的添加量（A）、磷酸鹽的添加量（B）及培養(yǎng)基初始含水量（C）的多元回歸方程：

由表3可知，該回歸模型極其顯著（P＜0.0001），而失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），決定系數(shù)R2=0.997 9，校正決定系數(shù)R2Adj=0.995 2，說明該模型可以解釋大約99.52%的靈芝三萜含量響應(yīng)值的變化。由此可見該二元回歸模型可以用來分析與預(yù)測(cè)該發(fā)酵體系中靈芝三萜含量的實(shí)際情況。一次項(xiàng)A、C、交互項(xiàng)AB、AC、BC及二次項(xiàng)A2、B2、C2均對(duì)靈芝三萜含量的影響極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)B對(duì)靈芝三萜含量的影響不顯著（P＞0.05）。該三種因素對(duì)于靈芝三萜含量的影響程度排序?yàn)椋号囵B(yǎng)基初始含水量（C）＞酵母浸出粉添加量（A）＞磷酸鹽添加量（B）。

2.2.2 影響因素的交互作用分析[28-29]

利用Design-Expert 8.0.6軟件繪制回歸模型的三維響應(yīng)面及等高線，考察不同因素之間的交互作用對(duì)靈芝三萜產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4A可知，酵母浸出粉添加量與磷酸鹽添加量交互作用極顯著。當(dāng)三七渣中酵母浸出粉和磷酸二氫鉀添加量較少時(shí)，靈芝三萜含量較低。隨著酵母浸出粉和磷酸二氫鉀添加量的增加，靈芝三萜含量開始增加，但當(dāng)二者添加到一定量之后靈芝三萜含量會(huì)有輕微下降。

由圖4B可知，酵母浸出粉添加量和培養(yǎng)基初始含水量?jī)烧咧g的交互作用極顯著。當(dāng)培養(yǎng)基初始含水量處于較低水平時(shí)，靈芝三萜的含量也較低。這是因?yàn)槌跏己康蜁r(shí)，氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解浸出及傳遞受阻，靈芝不能充分利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

由圖4C可知，磷酸二氫鉀添加量和培養(yǎng)基初始含水量之間的交互作用極顯著。當(dāng)培養(yǎng)基初始含水量處于較低水平時(shí)，隨著磷酸鹽添加量的增加，靈芝三萜的含量先增加后減少，但整體處于一個(gè)較低的水平，可見磷酸鹽添加量對(duì)靈芝三萜產(chǎn)量的影響不顯著，這與回歸模型方程顯著性分析結(jié)果相同。

圖4 酵母浸出粉添加量、磷酸鹽添加量和培養(yǎng)基初始含水量交互作用對(duì)靈芝三萜產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between the yeast extract addition,the phosphate addition and initial substrate moisture on Ganoderma lucidum triterpenoids yield

響應(yīng)值對(duì)影響因素的敏感程度，可以由三維響應(yīng)圖中各影響因素曲面的陡峭程度來判斷[30]。由圖4可知，培養(yǎng)基含水量影響最為顯著，其曲面最為陡峭，靈芝三萜含量隨培養(yǎng)基含水量的變化而顯著變化；酵母粉添加量的曲面較為陡峭，對(duì)靈芝三萜含量影響相對(duì)顯著，但其曲面較于培養(yǎng)基含水量稍顯平緩；磷酸鹽添加量曲面坡度較于酵母粉添加量顯平緩。該結(jié)論與回歸模型分析結(jié)果一致，各因素對(duì)靈芝三萜含量的影響程度排序?yàn)椋号囵B(yǎng)基初始含水量＞酵母粉添加量＞磷酸鹽添加量。

通過對(duì)該多元回歸模型方程求偏導(dǎo)與解逆矩陣，求得該模型的極值點(diǎn)：酵母浸出粉添加量為2.47%，磷酸二氫鉀添加量為0.145%，培養(yǎng)基初始含水量為65.47%，在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵培養(yǎng)物中靈芝三萜產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值為0.380%?？紤]實(shí)際操作條件，將發(fā)酵條件調(diào)整為酵母浸出粉添加量為2.5%，磷酸二氫鉀添加量為0.15%，培養(yǎng)基初始含水量為65%，在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵培養(yǎng)物中靈芝三萜含量實(shí)際值為0.367%，與預(yù)測(cè)值相差不大，比未優(yōu)化前提高了0.013%。

3 結(jié)論

本次研究通過單因素試驗(yàn)，以靈芝三萜產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察了酵母浸出粉添加量、培養(yǎng)基初始含水量、磷酸二氫鉀添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵結(jié)果的影響，并通過響應(yīng)面分析優(yōu)化確定靈芝固態(tài)發(fā)酵三七渣生產(chǎn)靈芝三萜的培養(yǎng)基制備條件為：采用過60目篩的中藥渣，酵母浸出粉添加量為2.5%，磷酸二氫鉀添加量為0.15%，培養(yǎng)基初始含水量為65%。在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，發(fā)酵培養(yǎng)物中靈芝三萜含量為0.367%，比優(yōu)化前提高了0.013%。