鄧長(zhǎng)陽，黎婷玉，劉文匯，吳興茹，劉忠軍，郭 壯

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽 441053；3.湖北古襄陽酒業(yè)有限公司，湖北 襄陽 441100）

作為世界六大蒸餾酒之一，白酒不僅具有悠久的歷史文化，同時(shí)獨(dú)特的生產(chǎn)發(fā)酵工藝還賦予了其以酯類為主體的復(fù)合香味[1-2]。濃香型白酒作為我國(guó)白酒的典型代表之一，具有綿柔甘冽、芳香濃郁、入口甜、落口綿和尾凈余長(zhǎng)等特點(diǎn)，在我國(guó)白酒行業(yè)中占據(jù)著重要的地位[3]。大曲是濃香型白酒釀造過程中的最主要的發(fā)酵劑和糖化劑，在白酒的發(fā)酵過程中扮演著重要的角色[4]。大曲中富含著豐富的微生物群系，且以真菌為主參與了濃香型白酒的發(fā)酵生產(chǎn)[5]，如霉菌具有蛋白酶、糖化酶和淀粉酶等豐富的酶系可對(duì)發(fā)酵基質(zhì)中的碳水化合物和蛋白質(zhì)等進(jìn)行水解，進(jìn)而促進(jìn)發(fā)酵的進(jìn)行[6]；而酵母菌則具有酒精發(fā)酵和產(chǎn)香能力，對(duì)于酒精和香味物質(zhì)的生產(chǎn)具有重要的作用[7]。

最早有關(guān)大曲中真菌類群的研究主要是基于傳統(tǒng)微生物學(xué)手段完成的，如羅惠波等[8]對(duì)采集于瀘州老窖的大曲真菌進(jìn)行了分離鑒定，發(fā)現(xiàn)曲霉屬（Aspergillus）為其優(yōu)勢(shì)種群。隨著測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，以Illumina MiSeq為代表的第二代高通量測(cè)序技術(shù)在發(fā)酵食品微生物類群解析方面有著廣泛的應(yīng)用[9]，如JI Z等[10]通過對(duì)麥曲進(jìn)行高通量測(cè)序，解析了其真菌類群的多樣性，為提升黃酒品質(zhì)提供了一定的參考依據(jù)。

近年來，為了賦予酒體一定的醬香風(fēng)味，中高溫大曲逐漸被應(yīng)用于濃香型白酒的釀造。本研究使用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)襄陽地區(qū)中高溫大曲的真菌多樣性進(jìn)行解析，同時(shí)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)手段對(duì)其曲皮和曲心中真菌類群的差異進(jìn)行甄別，以期為襄陽乃至華中地區(qū)白酒制曲工藝的改良提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲：所有中高溫大曲均采集自湖北省襄陽市某酒業(yè)有限公司制曲車間。

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；FastPfu Fly DNA Polymerase、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）Mix和FastPfuBuffer：北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物ITS3F/ITS4R（ITS3F：5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'；ITS4R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成；MiSeq高通量測(cè)序配套試劑：美國(guó)Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)ProteinSimple公司；Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；Veriti FAST梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)ABI公司；sigma 3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)SIGMA公司；R930型機(jī)架式服務(wù)器：美國(guó)DELL公司；YL90L3-4磨粉機(jī)：山西泰禾工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

所采集的中高溫大曲以小麥為主要原料制作而成，潤(rùn)糧時(shí)間為30 min，成型后長(zhǎng)寬高為37 cm×18 cm×7 cm，入庫(kù)發(fā)酵時(shí)庫(kù)房溫度保持在58～60 ℃，曲塊溫度達(dá)到42 ℃進(jìn)行第一次翻曲，每隔2～3天翻曲一次，發(fā)酵30 d后進(jìn)行貯存成熟。樣品采集時(shí)，使用酒精棉擦拭后的鋼鋸在1號(hào)中高溫大曲6個(gè)側(cè)面距表皮約1 cm的位置分別進(jìn)行切割，靠近表面的部分定義為曲皮，編號(hào)為P1，其余部分定義為曲心，編號(hào)為X1，將切割下的曲皮和曲心分別使用粉碎機(jī)粉碎后按四分法取20 g左右裝入滅菌的離心管備用。共取10個(gè)中高溫大曲樣品，各樣品取樣方法相同，編號(hào)依次為P1～P10和X1～X10，其中相同數(shù)字編號(hào)的樣本來自于同一塊大曲。

1.3.2 宏基因組DNA提取和Illumina MiSeq測(cè)序

參照王玉榮等[11]的方法采用基因組提取試劑盒對(duì)大曲中微生物的宏基因組DNA進(jìn)行提取，并以其為模板，使用通用引物ITS3F、ITS4R對(duì)ITS2區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將檢驗(yàn)合格后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 序列質(zhì)控和生物信息學(xué)分析

參照郭壯等[12]的方法對(duì)下機(jī)序列進(jìn)行質(zhì)控，使用QIIME（v1.95）平臺(tái)[13]，依次使用PyNAST軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)[14]、使用UCLUST方法劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[15]、基于UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)每個(gè)OTU的代表性序列進(jìn)行注釋[16]、使用FastTree軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]和計(jì)算α和β多樣性，進(jìn)而對(duì)曲皮和曲心中真菌類群的豐度和多樣性進(jìn)行評(píng)估。

1.3.4 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Venn圖和瀑布圖對(duì)曲皮和曲心中共有的OTU進(jìn)行識(shí)別；使用Wilcoxon檢驗(yàn)和主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）分別對(duì)曲皮和曲心中真菌類群的α和β多樣性進(jìn)行計(jì)算；使用線性判別分析效應(yīng)大?。╨inear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析對(duì)曲皮和曲心中真菌類群的差異性進(jìn)行甄別。本研究中所有的分析和繪圖均使用R（v3.3.2）軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于門和屬水平的曲皮和曲心真菌構(gòu)成分析

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)曲皮和曲心中真菌類群構(gòu)成進(jìn)行了揭示，并對(duì)其在門水平上的注釋結(jié)果進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖1。

圖1 中高溫大曲曲皮和曲心中優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)含量的分析結(jié)果Fig.1 Analysis results of the relative content of dominant fungal phyla in the surface and the center of medium-high temperature Daqu

由圖1可知，所有中高溫大曲樣品中共注釋出7個(gè)真菌門，其中優(yōu)勢(shì)菌門（平均相對(duì)含量＞1.00%）有3個(gè)，分別為子囊菌門（Ascomycota）（73.73%）、毛霉菌門（Mucoromycota）（21.39%）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（2.91%），三者的累計(jì)平均相對(duì)含量高達(dá)98.03%。由圖1亦可知，3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門在曲皮和曲心中存在較大的差異，其中曲心主要以Ascomycota為主，其平均相對(duì)含量高達(dá)93.45%，而曲皮主要以Ascomy cota和Mucoromycota為主，其平均相對(duì)含量分別54.01%和38.98%，其累計(jì)占比達(dá)92.99%。值得注意的是，相較于曲皮，曲心中Mucoromycota的相對(duì)含量極低。大曲樣品中優(yōu)勢(shì)真菌屬的相對(duì)含量見圖2。

圖2 中高溫大曲曲皮和曲心中優(yōu)勢(shì)真菌屬相對(duì)含量的分析結(jié)果Fig.2 Analysis results of the relative content of dominant fungal genera in the surface and the center of medium-high temperature Daqu

由圖2可知，從曲皮中共鑒定出6個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬（平均相對(duì)含量＞1.00%），分別為隸屬于Ascomycota的嗜熱真菌屬（Thermomyces）、曲霉屬（Aspergillus）、雙足囊菌屬（Dipodascus）和畢赤酵母屬（Pichia），平均相對(duì)含量分別為25.39%、8.23%、8.09%和5.35%；隸屬于Mucoromycota的根霉屬（Rhizopus），平均相對(duì)含量為38.83%；以及隸屬于Basidiomycota的絲孢酵母屬（Trichosporon），平均相對(duì)含量為2.28%。從曲心中共鑒定出9個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬，分別為隸屬于Ascomycota的Thermomyces、熱子囊菌屬（Thermoascus）、Aspergillus、Rasamsonia和Dipodascus，其平均相對(duì)含量分別為56.67%、16.86%、9.22%、5.55%和1.43%；隸屬于Mucoromycota的根毛霉屬（Rhizomucor）和Rhizopus，其平均相對(duì)含量分別為2.01%和1.49%；以及隸屬于擔(dān)子菌門的Trichosporon，其平均相對(duì)含量為2.18%。經(jīng)Wilcoxon檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Rhizopus、Dipodascus和Pichia在曲皮中的含量顯著偏高（P＜0.05），平均含量分別為38.83%、8.09%和5.35%，而Thermomyces、Thermoascus、Rasamsonia和Rhizomucor在曲心中的含量顯著偏高（P＜0.05），平均含量分別為56.67%、16.86%、5.55%和2.01%。由此可見，中高溫大曲曲皮和曲心中真菌類群的構(gòu)成存在一定的差異。

2.2 曲皮和曲心中真菌類群群落結(jié)構(gòu)的比較

本研究進(jìn)一步對(duì)曲皮和曲心中真菌類群的4種α多樣性指數(shù)進(jìn)行了比較分析，其結(jié)果見圖3。

圖3 中高溫大曲曲皮和曲心α多樣性指數(shù)的比較分析Fig.3 Comparative analysis of α diversity indexes in the surface and the center of medium-high temperature Daqu

香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)常用來評(píng)估樣本中微生物的多樣性，而超1指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)則常用來評(píng)估樣本中微生物的豐度[18]。本研究使用Wilcoxon檢驗(yàn)對(duì)兩類大曲中的4種α多樣性指數(shù)進(jìn)行顯著性分析發(fā)現(xiàn)，其差異均不顯著（P＞0.05）。由此說明，曲皮和曲心中真菌類群的多樣性和豐度并不存在顯著性差異。本研究進(jìn)一步基于非加權(quán)和加權(quán)的UniFrac距離對(duì)真菌類群的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了主坐標(biāo)分析，其結(jié)果見圖4。

由圖4可知，基于非加權(quán)和加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析均表明，中高溫大曲中不同部位的樣品在空間排布上呈現(xiàn)出明顯聚類趨勢(shì)。

圖4 基于非加權(quán)（a）和加權(quán)（b）UniFrac距離的主坐標(biāo)分析Fig.4 Principal coordinate analysis based on unweighted (a) and weighted (b) UniFrac distance

由圖4a可知，曲皮樣本主要位于X軸負(fù)方向，曲心樣本則幾乎全部位于X軸正方向，而圖4b亦可以觀察到類似的現(xiàn)象。值得注意的是，相較于非加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析，加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析顯示曲皮中的真菌群落結(jié)構(gòu)組間差異更大。由此說明，曲皮中低豐度的真菌類群之間的構(gòu)成差異較小，而優(yōu)勢(shì)菌屬之間的相對(duì)含量存在較大的差異；但曲心中的低豐度物種差異較大，而優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)含量之間并無明顯的差異。因此，本研究對(duì)曲皮和曲心中的共有OTU進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖5。

圖5 中高溫大曲曲皮和曲心中共有OTU的分析結(jié)果Fig.5 Analysis results of common OTU in the surface and the center of medium-high temperature Daqu

由圖5a可知，所有大曲樣品中共篩選出330個(gè)代表性O(shè)TU（在每組50%的樣品中出現(xiàn)），曲皮中有73個(gè)代表性O(shè)TU，而在曲心中有290個(gè)代表性O(shè)TU，且兩組的共有OTU有33個(gè)。由圖5b可知，共有5個(gè)OTU在所有樣品中出現(xiàn)，可被注釋為Thermomyces和Aspergillus兩個(gè)屬，兩個(gè)屬分別占總序列數(shù)的33.34%和3.27%。而對(duì)比圖2亦可知，Thermomyces和Aspergillus主要分布在曲心，而在曲皮中的相對(duì)含量較低。由此說明，曲皮中存在大量的非代表性O(shè)TU（在每組樣品中出現(xiàn)的頻率不足50%），且其平均相對(duì)含量較低；而曲心則存在著較多的代表性O(shè)TU，大部分OTU注釋到的菌屬隸屬于優(yōu)勢(shì)菌屬，這也導(dǎo)致大曲中部的低豐度物種的種類較少。此結(jié)果與圖4所得出的結(jié)論相一致，進(jìn)一步說明了結(jié)果的正確性。同時(shí)，本研究通過LEfSe分析對(duì)大曲不同部位中差異的微生物進(jìn)行了解析，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，本研究通過LEfSe分析共甄別出22個(gè)具有差異的微生物類群，其中在屬水平上共甄別到10個(gè)差異菌屬，但僅有兩個(gè)隸屬于優(yōu)勢(shì)菌屬，分別為Rhizomucor和Thermoascus，且兩者都主要分布在曲皮。由此說明，造成中高溫大曲曲皮和曲心中真菌菌群結(jié)構(gòu)差異的主要是由Rhizomucor和Thermoascus及若干低豐度菌屬造成的。

圖6 線性判別分析效應(yīng)大小分析結(jié)果Fig.6 Analysis results of linear discriminant analysis effect size

3 討論

本研究采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)中高溫大曲曲皮和曲心中的真菌多樣性進(jìn)行了解析，發(fā)現(xiàn)Ascomycota和Mucoromycota為其優(yōu)勢(shì)真菌門，這與前人關(guān)于大曲中真菌多樣性的研究結(jié)果相一致[19-20]。本研究亦發(fā)現(xiàn)Thermomyces、Rhizomucor、Thermoascus、Aspergillus、Dipodascus和Pichia等為大曲中的優(yōu)勢(shì)真菌屬，其累計(jì)平均相對(duì)含量高達(dá)93.12%。前期針對(duì)大曲微生物多樣性研究的報(bào)道與本研究的結(jié)論存在一定的差異，孫利林等[21]研究發(fā)現(xiàn)，安徽省北部某酒廠高溫大曲中主要優(yōu)勢(shì)菌屬為Aspergillus和Thermoascus，而CHEN B等[22]通過研究發(fā)現(xiàn)，高溫大曲中主要優(yōu)勢(shì)菌種為多變擬青霉（Paecilomyces variotii）和米曲霉（Aspergillus oryzae），導(dǎo)致這種差異的原因可能在于制曲工藝、原料和制作地環(huán)境等因素的不同[23-24]。

雖然同一份中高溫大曲的制作工藝、發(fā)酵條件和原料等完全相同，但曲皮和曲心的微生物構(gòu)成依舊存在著較大的差異。本研究結(jié)果表明，曲皮主要以Rhizopus和Rhizomucor為主，且不同大曲樣本中存在較多的低豐度物種；而曲心則主要以Thermomyces、Thermoascus、Aspergillus和Pichia等大曲中常見的真菌屬為主，且曲心的低豐度物種數(shù)相對(duì)較少。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在貯存成熟過程中同一份大曲曲皮和曲心的溫度并不相同，由于曲皮直接與空氣相接觸，可以直接和空氣進(jìn)行熱傳遞因而其溫度較之曲心偏低。此外，曲皮的水分含量要低于曲心，加之曲皮與空氣接觸的更為密切，這些均可能是導(dǎo)致大曲不同部位真菌類群存在較大差異的原因。

不可否認(rèn)的是，本研究使用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)中高溫大曲中真菌ITS2區(qū)域進(jìn)行了測(cè)序，其僅能在“屬水平”上展開分析討論，且無法對(duì)真菌類群發(fā)揮的具體功能展開解析[25]，這也使得本研究存在一定的局限性。因此，在后續(xù)研究中采用宏基因組學(xué)技術(shù)在“種”或“株”水平上對(duì)襄陽地區(qū)中高溫大曲中真菌類群進(jìn)行解析亦是十分必要的。

4 結(jié)論

襄陽地區(qū)中高溫大曲曲皮和曲心真菌的豐度和多樣性無明顯差異，但兩者菌群的構(gòu)成存在顯著的不同。在門水平上，曲心主要以子囊菌門（Ascomycota）為主，而曲皮以子囊菌門（Ascomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）為主。在屬水平上，根霉屬（Rhizopus）、雙足囊菌屬（Dipodascus）和畢赤酵母屬（Pichia）在曲皮中的含量顯著偏高，而嗜熱真菌屬（Thermomyces）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、踝節(jié)菌屬（Rasamsonia）和根毛霉屬（Rhizomucor）在曲心中的含量顯著偏高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Rhizomucor和Thermoascus及若干低豐度物種是造成襄陽地區(qū)中高溫大曲曲皮和曲心真菌菌群結(jié)構(gòu)存在差異的關(guān)鍵類群。