丁泓皓，戴慧敏，張熠璇，蔡 俊

（湖北工業(yè)大學 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 工業(yè)微生物湖北省重點實驗室發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068）

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）作為一種益生菌，其功能及益生特性日益受到人們廣泛的關注。凝結芽孢桿菌可調節(jié)腸道中細菌的生長，改善粘膜屏障功能，并影響腸粘膜和全身免疫系統(tǒng)[1-2]；可通過改變pH值來優(yōu)化礦物質的吸收；可通過產(chǎn)生消化酶對碳水化合物的消化產(chǎn)生重大影響，并且可以通過降解腸道中的膽固醇來降低膽固醇水平，甚至可以產(chǎn)生維生素等重要的營養(yǎng)物質[3-4]。此外，凝結芽孢桿菌在發(fā)酵生長后期可以形成芽孢[5]，抵御胃的酸性環(huán)境到達腸道，萌發(fā)后有助于碳水化合物和蛋白質的消化[6]；凝結芽孢桿菌能夠促進腸道形成抵御各種病原體的環(huán)境，有利于營養(yǎng)物質的消化吸收[7]，并且促進有益細菌的繁殖以及腸內細胞健康所需的短鏈脂肪酸的產(chǎn)生[8]。不同的凝結芽孢桿菌菌株，特性存在差異，如：從土壤中分離出來的凝結芽孢桿菌NRS27，嗜熱且對維生素D有大量需求；從鴨的排泄物中分離出的凝結芽孢桿菌BC07，耐酸耐膽鹽，并且乳酸的產(chǎn)量高達43.2 g/L；從雞排泄物中分離出的凝結芽孢桿菌C-4，具體抑制大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[9-12]等特性。

通過常規(guī)發(fā)酵方式產(chǎn)生的生物質存在局限性，且隨著市場對益生菌產(chǎn)品的需求量增加，生物質對于制藥、乳制品以及益生菌具有非常重要的價值[13]。因此，需要探究增殖凝結芽孢桿菌的方法以增強生物質的積累[14]。目前，國內外對凝結芽孢桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)方面有一些報道。GAO S F等[15]使用一定濃度的碳酸鈣、磷酸二氫鈉、蛋氨酸，采用分段式補料批次發(fā)酵的方式，對1株畜禽用凝結芽孢桿菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，活菌數(shù)由6.80×109CFU/mL提高到8.30×109CFU/mL；葛風清等[16]利用麩皮和豆粕粉等作為培養(yǎng)基，對凝結芽孢桿菌AHU1366進行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，OD600nm值達到19.68；嚴濤等[17]利用糖蜜對凝結芽孢桿菌BC01進行發(fā)酵優(yōu)化，使活菌數(shù)最高達到6.7×109CFU/mL。一般的凝結芽孢桿菌耐受性較差，那么優(yōu)化其產(chǎn)孢能力從而提高其耐受性成為必要條件，AMAHA M等[18]通過調節(jié)培養(yǎng)基組分來提高凝結芽孢桿菌芽孢產(chǎn)率的研究時發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入硫酸錳后，產(chǎn)孢能力提高了3倍，且初始pH在6.0時產(chǎn)芽孢能力最強；路程等[19]利用麩皮水代替蒸餾水對凝結芽孢桿菌T50進行發(fā)酵優(yōu)化，并發(fā)現(xiàn)在pH值接近中性時芽孢產(chǎn)率可達到94.3%。上述報道對于凝結芽孢桿菌的活菌數(shù)或菌體濃度方面有一定的提升，但菌株的生產(chǎn)能力還有待提高。

因此，本研究以凝結芽孢桿菌CNJD為研究對象，采用單因素及響應面試驗優(yōu)化該菌株增殖的發(fā)酵工藝，旨在有效提高凝結芽孢桿菌CNJD活菌數(shù)，為進一步研究提高其芽孢產(chǎn)率奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）CNJD：分離自湖北工業(yè)大學南區(qū)菜市場泡菜腌水，保藏于湖北工業(yè)大學微生物制劑團隊。

1.1.2 試劑

蔗糖、木糖、淀粉、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、酵母浸粉、玉米芯粉、小麥麩皮、氯化銨、玉米粉、硫酸銨、尿素、硝酸鈉、豆粕、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸錳、溴甲酚紫：國藥集團化學試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 6.6，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基[20]：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，pH自然，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1D型單人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；AR1140型電子分析天平：奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；PHS-25 pH計：上海精密科學儀器有限公司；ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；EVOLUTION300型可見光分光光度計：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將斜面保存的凝結芽孢桿菌CNJD接種于YPD培養(yǎng)基，45 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.2 凝結芽孢桿菌CNJD增殖發(fā)酵條件的優(yōu)化

將活化的凝結芽孢桿菌CNJD按1%（V/V）的接種量接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/300 mL，在45 ℃、160 r/min條件下，依次考察發(fā)酵時間（0～24 h）、發(fā)酵溫度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、初始pH值（4、5、6、7、8、9、10）、裝液量（25 mL/250 mL、50mL/250mL、75mL/250mL、100mL/250mL、125mL/250mL）、搖床轉速（120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220 r/min）對凝結芽孢桿菌活菌數(shù)的影響，凝結芽孢桿菌的活菌數(shù)采用活菌計數(shù)法進行測定[21]。

1.3.3 凝結芽孢桿菌CNJD增殖發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

（1）單因素試驗

在發(fā)酵條件優(yōu)化后的初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，依次考察碳源種類（蔗糖、木糖、淀粉、玉米芯粉、小麥麩皮、葡萄糖，添加量為20 g/L）及添加量（5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L），氮源種類（氯化銨、蛋白胨、玉米粉、硫酸銨、尿素、硝酸鈉、豆粕、胰蛋白胨、酵母浸粉，添加量為10 g/L）對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數(shù)的影響。

選取較好的三種氮源，分別兩兩做復合氮源比例優(yōu)化試驗，比例分別為1∶1、1∶2、2∶1，并考察總添加量（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數(shù)的影響。

最后，考察無機鹽種類（磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸錳，添加量為1.0 g/L）對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數(shù)的影響。

（2）Plackett-Burman試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用Plackett-Burman設計篩選試驗，以蔗糖、胰蛋白胨、酵母浸粉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸錳為自變量，以活菌數(shù)為響應值，篩選出對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數(shù)影響較為顯著的因素[22]。

（3）最低添加量試驗

從Plackett-Burman試驗設計中挑選出不顯著性因素，考慮到后期投入生產(chǎn)中成本效益的最大化，研究對凝結芽孢桿菌活菌數(shù)影響不顯著的因素的最低添加量。

（4）最陡爬坡試驗

從Plackett-Burman設計試驗中挑選出顯著性因素進行最陡爬坡試驗，依據(jù)顯著性因素正負效應，設計合理的步長，增加試驗的密集度，來逼近效果最好的區(qū)域[23]。

（5）中心組合設計試驗

根據(jù)最陡爬坡試驗結果，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數(shù)試驗數(shù)據(jù)進行方差分析及多元回歸方程擬合，依據(jù)回歸方程繪制響應面圖，并預測發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成[24]。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應用Design-Expert 8.0.6.1進行數(shù)據(jù)處理和分析，包括回歸分析、二次多項式回歸方程、方差分析和響應面圖。所有試驗重復3次，實驗數(shù)據(jù)表示為“平均值±標準偏差”。

2 結果與分析

2.1 凝結芽孢桿菌CNJD增殖發(fā)酵條件的優(yōu)化

不同發(fā)酵條件對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響見圖1。

圖1 不同發(fā)酵條件對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of different fermentation conditions on the viable number of Bacillus coagulans CNJD

由圖1a可知，發(fā)酵0～4 h為菌體生長的遲緩期，4～16 h為對數(shù)生長期，16～24 h為穩(wěn)定期，16 h活菌數(shù)最高為（1.48±0.11）×1010CFU/mL，故確定最優(yōu)發(fā)酵時間為16 h。

由圖1b可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，菌體活菌數(shù)呈先升高后下降的趨勢，當發(fā)酵溫度為55 ℃時，活菌數(shù)最高為（2.78±0.13）×1010CFU/mL，故確定最優(yōu)發(fā)酵溫度為55 ℃。

由圖1c可知，當接種量逐漸增大時，菌體活菌數(shù)并無明顯變化，考慮到后期利用發(fā)酵罐高密度發(fā)酵菌體，接種量過大在操作接種這一步驟時可能會提高染菌幾率，故確定最優(yōu)接種量為2%。

由圖1d可知，隨著初始發(fā)酵pH值的升高，菌體活菌數(shù)呈先升高后下降的趨勢，當初始發(fā)酵pH值為5.0時，菌體生長最好，活菌數(shù)最高為（3.98±0.14）×1010CFU/mL，故確定最優(yōu)初始發(fā)酵pH值為5.0。

由圖1e可知，隨著裝液量的增大，菌體活菌數(shù)呈先升高后下降的趨勢，當裝液量為50 mL/250 mL時，菌體生長最好，活菌數(shù)最高為（4.67±0.17）×1010CFU/mL，表明此時搖瓶中的溶氧最適合該菌體生長，故確定最優(yōu)裝液量為50 mL/250 mL。

由圖1f可知，隨著轉速的升高，菌體活菌數(shù)呈先升高后下降的趨勢，分析原因可能是，在發(fā)酵過程中，搖瓶轉速影響菌體發(fā)酵過程中的溶氧，若是轉速太高，溶氧增大，則容易抑制凝結芽孢桿菌這種兼性厭氧菌的生長，若轉速太低，會影響菌體的二分裂，從而導致菌體生長遲緩。當搖瓶轉速為180 r/min時，菌體生長最好，活菌數(shù)最高為（5.37±0.15）×1010CFU/mL，故確定最優(yōu)搖瓶轉速為180 r/min。

2.2 凝結芽孢桿菌CNJD增殖發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 碳源種類及添加量對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響

碳源種類及添加量對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響見圖2。

圖2 碳源種類（a）及蔗糖添加量（b）對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響Fig.2 Effect of carbon source types (a) and sucrose addition (b) on the growth of Bacillus coagulans CNJD

由圖2a可知，當蔗糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源時，活菌數(shù)最高，為（6.45±0.12）×1010CFU/mL。分析原因可能是等體積的蔗糖作為碳源相較于葡萄糖來說，更容易在菌體發(fā)酵時提供一個低滲透壓的環(huán)境[25]，故確定最佳碳源為蔗糖。

由圖2b可知，當蔗糖添加量為30 g/L時，活菌數(shù)最高，為（6.93±0.16）×1010CFU/mL。當蔗糖的添加量較少時，由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的缺乏，導致菌體生長受限；而當蔗糖的添加量過多時，培養(yǎng)基的粘度上升，造成培養(yǎng)基中溶氧的不足，從而導致菌體的生長受到抑制[26]，故確定最佳蔗糖添加量為30 g/L。

2.2.2 氮源種類及添加量對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響

氮源種類對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響見圖3。

圖3 氮源種類對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響Fig.3 Effect of nitrogen source types on the growth of Bacillus coagulans CNJD

無機氮源對于微生物生長來說吸收較快，但在發(fā)酵過程中無機氮源會影響培養(yǎng)基中的pH值；相較于無機氮源，有機氮源含有大量的無機鹽及生長因子，并且含有豐富的微量元素[27]，由圖3可知，當?shù)礊榻湍附?、胰蛋白胨、蛋白胨、豆粕時，活菌數(shù)較高，又考慮到豆粕為工業(yè)副產(chǎn)品，出于生產(chǎn)成本以及資源再利用角度考量，使用豆粕代替活菌數(shù)較高的蛋白胨來進行復合氮源優(yōu)化。因此選用酵母浸粉、胰蛋白胨和豆粕作為復合氮源。復合氮源比例及添加量對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響分別見表1和圖4。

圖4 復合氮源添加量對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響Fig.4 Effect of compound nitrogen source addition on the growth of Bacillus coagulans CNJD

表1 復合氮源比例對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響Table 1 Effect of compound nitrogen source ratio on the growth of Bacillus coagulans CNJD

由表1可知，氮源的復合使用對于微生物生長起到了一定的促進作用，當胰蛋白胨∶酵母浸粉=1∶1時，菌株的活菌數(shù)最高，為（7.13±0.15）×1010CFU/mL，故選用胰蛋白胨∶酵母浸粉=1∶1作為復合氮源。

由圖4可知，隨著復合氮源添加量的增多，活菌數(shù)也不斷增加，當添加量為25 g/L時，活菌數(shù)最高，為（7.35±0.15）×1010CFU/mL，故確定最優(yōu)氮源添加量為25 g/L。

2.2.3 無機鹽種類對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響

無機鹽種類對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響見圖5。

圖5 無機鹽種類對凝結芽孢桿菌CNJD生長的影響Fig.5 Effect of inorganic salt type on the growth of Bacillus coagulans CNJD

由圖5可知，磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鈣和硫酸錳這幾種單一無機鹽，對凝結芽孢桿菌CNJD的生長具有積極影響，故選擇磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鈣和硫酸錳進行后續(xù)的PB試驗。

2.2.4 Plackett-Burman試驗設計

通過對單因素試驗結果分析，確定了PB試驗的因素，然后通過PB試驗篩選得到對凝結芽孢桿菌活菌數(shù)有顯著性影響的組分，以便對培養(yǎng)基的組分進行進一步的優(yōu)化。按照Design-Expert 8.0.6.1軟件設計PB試驗，試驗次數(shù)12次，每組3個平行，PB試驗設計及結果見表2，試驗方差及主效應分析見表3。

表2 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

表3 Plackett-Burman試驗方差及主效應分析Table 3 Variance and main effect analysis of Plackett-Burman experiments

由表3可知，回歸模型的P值＜0.05，顯著。蔗糖、氯化鈣、硫酸錳對凝結芽孢桿菌CNJD的活菌數(shù)影響顯著（P＜0.05），且其中蔗糖、氯化鈣為正效應，硫酸錳為負效應，而其他因素對結果影響不顯著（P＞0.05）。由表4的方差分析可知，決定系數(shù)R2=0.907 4，表明90.74%的數(shù)據(jù)都能用此模型來解釋。

2.2.5 最低添加量試驗

根據(jù)Plackett-Burman設計試驗得到的影響菌株活菌數(shù)的不顯著因素，即磷酸氫二鉀、氯化鈉、胰蛋白胨、酵母浸粉，做最低添加量試驗，結果見表4。

表4 不顯著因素的最低添加量試驗Table 4 Minimum addition experiments of insignificant factors

在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，經(jīng)濟效益、產(chǎn)品成本是首要考慮因素，所以為了極大程度的減少成本，選擇每個因素下活菌數(shù)最高的添加量作為最低添加量，即磷酸氫二鉀0 g/L、氯化鈉1.50 g/L、胰蛋白胨10.00 g/L、酵母浸粉10.00 g/L。

2.2.6 最陡爬坡試驗

固定酵母浸粉10.00 g/L，氯化鈉1.50 g/L，胰蛋白胨10.00 g/L，根據(jù)Plackett-Burman試驗結果，選取影響顯著的因素蔗糖（A）、氯化鈣（B）、硫酸錳（C）為考察因素，活菌數(shù)（Y）為響應值，按照各因素的正負效應設定最陡爬坡試驗。

由表5可知，當蔗糖、氯化鈣和硫酸錳的添加量分別為45.00 g/L、1.60 g/L和0.40 g/L時，凝結芽孢桿菌的活菌數(shù)最高，為（7.53±0.16）×1010CFU/mL，因此將其作為中心復合試驗的中心點，進一步優(yōu)化組分的添加量。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Design and results of the steepest climb experiments

2.2.7 中心組合設計試驗

通過最陡爬坡試驗得到的中心點：蔗糖45.00 g/L、氯化鈣1.60 g/L、硫酸錳0.40 g/L，以此為中心點，固定酵母浸粉10.00 g/L，氯化鈉1.50 g/L，胰蛋白胨10.00 g/L，以活菌數(shù)為響應值進行3因素5水平的中心復合設計試驗，試驗設計及結果見表6，方差分析結果見表7。

表6 中心復合設計試驗結果Table 6 Results of center composite design experiments

表7 響應面試驗的方差分析結果Table 7 Variance analysis results of response surface experiments

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表6試驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，得到的模型方程為Y=-39.529 08+1.501 12A+9.411 82B+58.491 05C-0.293 75AB-0.517 5AC-25.937 5BC-0.010416A2+3.256 64B2-2.176 24C2。由表7可知，模型的P值＜0.05，顯著；失擬項的P值＞0.05，不顯著，說明該模型與試驗值擬合較好，可用于活菌數(shù)的預測。決定系數(shù)R2=0.779 5，表明預測有22.05%的變異情況不能由該模型解釋。方程中一次項B、交互項BC對活菌數(shù)影響顯著（P＜0.05），一次項C對活菌數(shù)影響極顯著（P＜0.01），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。其中氯化鈣與硫酸錳交互作用對活菌數(shù)影響的響應面及等高線圖見圖6。

圖6 氯化鈣與硫酸錳的交互作用對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數(shù)影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between CaCl2 and MgSO4 on the viable number of Bacillus coagulans CNJD

由圖6可知，氯化鈣與硫酸錳的交互作用對凝結芽孢桿菌CNJD活菌數(shù)影響的響應面有最高點，且等高線呈橢圓，說明兩因素間交互作用明顯，與方差分析結果一致。

由模型和軟件分析得到凝結芽孢桿菌CNJD的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為蔗糖48.59 g/L，氯化鈣1.70 g/L，硫酸錳0.33 g/L，活菌數(shù)預測值為7.99×1010CFU/mL，在此優(yōu)化條件下進行3次重復試驗，活菌數(shù)為（7.86±0.25）×1010CFU/mL。實測值與回歸方程預測值吻合良好。

3 結論

本研究以活菌數(shù)為評價指標，采用單因素試驗得到凝結芽孢桿菌CNJD增殖的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：接種量2%、初始發(fā)酵pH值5.0、培養(yǎng)溫度55 ℃、搖床轉速180 r/min、發(fā)酵時間16 h、裝液量50 mL/250 mL。在此基礎上，采用單因素試驗及響應面試驗優(yōu)化得到最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：蔗糖48.59 g/L，酵母浸粉10.00 g/L，胰蛋白胨10.00 g/L，氯化鈣1.70 g/L，硫酸錳0.33 g/L，氯化鈉1.50 g/L。在此優(yōu)化條件下，凝結芽孢桿菌的活菌數(shù)為（7.86±0.25）×1010CFU/mL。