郭 麗，王鐵儒，馬 曼，王冰宜，魏新元，樊明濤

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

蘋果酒是以蘋果汁為原料經(jīng)發(fā)酵而成的含酒精飲料，富含氨基酸、有機(jī)酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，因其酒精度低和適口性良好而深受消費(fèi)者喜愛[1]。但由于我國蘋果酒發(fā)展起步較晚，在蘋果酒釀造中仍存在一些問題，如發(fā)酵過程中果汁褐變引起的果酒顏色變化、酒體口味單薄及香氣不足等。如何解決這些問題，成為蘋果酒釀造關(guān)注的重點(diǎn)。香氣物質(zhì)是果酒品質(zhì)的重要組成部分，是決定果酒風(fēng)味和典型性的重要因素[2]。目前關(guān)于提升蘋果酒香氣的研究多集中在酵母菌種的選擇[3-4]和發(fā)酵工藝的優(yōu)化等[5-6]方面，關(guān)于氮源對蘋果酒香氣影響的研究較少。

氮是酵母生長和代謝必不可少的元素。在酒精發(fā)酵過程中，酵母吸收和代謝氮元素和其他營養(yǎng)物質(zhì)，以支持酵母生長和香氣物質(zhì)的合成[7-8]。氮源不足會導(dǎo)致發(fā)酵遲緩，并產(chǎn)生一些風(fēng)味不好的物質(zhì)（如H2S）[9]。為保證發(fā)酵的順利進(jìn)行和提升酒的香氣，一般在酒中添加氮源，如磷酸氫二銨（dibasic ammonium phosphate，DAP）或氨基酸，且添加氮對果酒香氣的影響因酵母菌種[10]、發(fā)酵基質(zhì)組成[11-12]和添加時間[10，13]而不同。在目前的研究中，由于發(fā)酵條件的不同，關(guān)于氮對果酒香氣的影響無法得出比較一致的結(jié)論，如TORREA D等[11]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前添加DAP顯著降低了霞多麗酒中高級醇的含量，但SEGUINOT P等[14]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前在合成葡萄汁中添加DAP對異戊醇和異丁醇沒有影響；此外，SEGUINOT P等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定期添加氮更有利于揮發(fā)性香氣物質(zhì)的合成，尤其是乙酸酯類物質(zhì)，但GUTIERREZ A等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定期添加氮對酯類物質(zhì)的影響不顯著。因此，關(guān)于氮對蘋果酒香氣的影響需要做進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)以富士蘋果為原料，研究在發(fā)酵前、酵母生長對數(shù)期和穩(wěn)定期前期分別添加DAP對酵母發(fā)酵性能和蘋果酒香氣物質(zhì)的影響，以期提高蘋果酒的品質(zhì)特性，并為蘋果酒釀造中氮源添加的最優(yōu)時間提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富士蘋果：陜西楊凌農(nóng)貿(mào)市場；釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）WLP775：西北農(nóng)林科技大學(xué)食品微生物與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室鑒定保藏；磷酸氫二銨（食品級）：江蘇紫東食品有限公司；果膠酶（30 000 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；白砂糖（食品級）：成都太古糖業(yè)有限公司；酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉（分析純）、亞硫酸（分析純）：四川西隴科學(xué)有限公司；有機(jī)酸標(biāo)品（蘋果酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、草酸、琥珀酸）（均為色譜純）、無水葡萄糖（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；2-辛醇（純度98%）：上海麥克林生化科技有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，蒸餾水1 000 mL。固體培養(yǎng)基另加入20 g瓊脂，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HausElec離心果汁機(jī)：南通金橙機(jī)械有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；BL-50A立式滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；LC-2030 PLUS高效液相色譜儀（highperformanceliquidchromatography，HPLC）、QP2010 Ultra氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：日本島津公司；手動固相微萃取（50/30 μm DVB/CAR/SPME）進(jìn)樣器：美國Supelco公司；DB-17MS毛細(xì)管柱（60 m×250 μm，0.25 μm）：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將甘油管中保存的酵母菌株接種于10 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h，再以2%接種量在YPD液體培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接2次，離心（5 000×g，5 min）收集菌體沉淀，生理鹽水洗滌后接種到蘋果汁中進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.2 蘋果酒釀造工藝流程、操作要點(diǎn)及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

操作要點(diǎn)：選擇無病變、成熟度好的蘋果進(jìn)行切分榨汁后，分裝到用硫熏過的發(fā)酵罐中，并加入亞硫酸，添加量為1 mL/L。按50 mg/L的量加入果膠酶室溫酶解12 h后，添加白砂糖調(diào)整成分，使蘋果汁初始可溶性固形物的含量為20 °Bx，然后接入活化好的酵母在20 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵期間每天測定酵母生物量和還原糖含量，當(dāng)還原糖降為4 g/L以下，且連續(xù)3 d不再變化時，發(fā)酵結(jié)束。然后用8層無菌紗布過濾酒樣，置于-20 ℃冰箱保存。

根據(jù)酵母生長曲線，分別在發(fā)酵前（發(fā)酵0 h，記為D0）、酵母生長對數(shù)期（發(fā)酵24 h，記為D24）和穩(wěn)定期前期（發(fā)酵72 h，記為D72）添加280 mg/L的DAP，并設(shè)置對照（不添加DAP，記為CK）。每個試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.3 酵母生物量測定

采用平板計(jì)數(shù)法。發(fā)酵期間每天取樣，梯度稀釋后在YPD固體培養(yǎng)基上涂布，28 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4 還原糖含量測定

還原糖測定采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[15]。即將樣品稀釋后，依次取1 mL樣品、1 mL蒸餾水和2 mL DNS 試劑于25 mL具塞比色皿中，沸水浴5 min后流水冷卻至室溫，定容至25 mL后在波長540 nm處測定吸光度值，以葡萄糖為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用樣品相應(yīng)吸光度值對比標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算還原糖含量。

1.3.5 有機(jī)酸含量測定[16]

采用高效液相色譜法對酒樣中的有機(jī)酸進(jìn)行定性和定量測定。蘋果酒樣用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行測定，ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：0.01 mol/L磷酸氫二銨（pH 2.7），進(jìn)樣量：10 μL，等梯度洗脫，流速：0.7 mL/min，柱溫：25 ℃，檢測波長：210 nm。

1.3.6 揮發(fā)性香氣物質(zhì)測定[17]

采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對揮發(fā)性香氣物質(zhì)進(jìn)行檢測。取5 mL待測酒樣于15 mL頂空萃取瓶中，添加6 μL 2-辛醇（質(zhì)量濃度為0.45 mg/mL，溶于甲醇）作為內(nèi)標(biāo)，加入1 g NaCl后旋緊瓶蓋，于40 ℃條件下平衡15 min，插入已老化的萃取頭萃取30 min。萃取完畢后，迅速取下萃取器，插入氣相色譜儀進(jìn)樣口于260 ℃條件下解吸3 min。

GC-MS條件：色譜柱升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0 ℃，保持3 min后以4 ℃/min 的速度升溫至120 ℃，再以6 ℃/min的速度升溫至240 ℃，保持12 min。載氣為高純氦氣（He），不分流進(jìn)樣，流速1.0 mL/min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，掃描范圍35～400 u，電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV。

香氣物質(zhì)的定性和定量方法：檢測出的未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)自動檢索與美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）library、Wiley library相匹配，選擇匹配度＞85%的物質(zhì)作為有效香氣成分，結(jié)合文獻(xiàn)中的保留指數(shù)進(jìn)行香氣物質(zhì)的定性[18]；以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)（質(zhì)量濃度0.45 mg/mL），按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各成分質(zhì)量濃度實(shí)現(xiàn)定量。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（Duncan檢驗(yàn)），采用Minitab 18.0進(jìn)行主成分分析，采用Graphpad繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中添加DAP對發(fā)酵速率和酵母生長的影響

不同處理下蘋果酒發(fā)酵速率及酒中酵母數(shù)的動態(tài)變化如圖1所示，用還原糖消耗情況來表示發(fā)酵速率。如圖1A所示，在發(fā)酵過程中添加DAP均能加快發(fā)酵速率，但在穩(wěn)定期添加DAP對酵母數(shù)影響不大，這與SEGUINOT P等[14]的研究結(jié)果一致，添加DAP處理組還原糖含量在第5天時就降到4 g/L以下，且在第8天時完成發(fā)酵，而未添加DAP的對照組發(fā)酵終止需要9 d。在發(fā)酵前2 d，D0處理組還原糖消耗速率和酵母數(shù)顯著高于其它試驗(yàn)組，這說明初始氮濃度是促進(jìn)酵母生長和還原糖消耗的關(guān)鍵因素[19]。如圖1B所示，發(fā)酵到第3天時，所有處理酵母數(shù)均達(dá)到最大值，發(fā)酵前和對數(shù)期添加DAP處理組測得的酵母數(shù)分別為7.63 lg（CFU/mL）和7.62 lg（CFU/mL），高于CK和D72的7.32 lg（CFU/mL）和7.35 lg（CFU/mL），隨后，D0和D24處理組酵母數(shù)快速下降，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵蘋果汁大多數(shù)還原糖和氮源被酵母耗盡所致[10]。

圖1 發(fā)酵過程中蘋果酒發(fā)酵速率（A）和酵母數(shù)（B）的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of fermentation rate (A) and of yeast cell content (B) in cider during fermentation process

2.2 發(fā)酵過程中添加DAP對蘋果酒有機(jī)酸含量的影響

不同處理下蘋果酒中部分有機(jī)酸含量如表1所示，發(fā)酵結(jié)束后，在所有酒樣中琥珀酸和蘋果酸占總有機(jī)酸含量的85%以上。發(fā)酵前和對數(shù)期添加DAP均顯著降低了琥珀酸的含量（P＜0.05），在葡萄酒和荔枝酒中也有相似的結(jié)論[11，20]，琥珀酸含量降低可減弱酒中的咸味和苦味，對蘋果酒的感官有積極影響[21]；與CLEMENT T等[13]的研究相反，在穩(wěn)定期添加DAP顯著增加了琥珀酸的含量，同時降低了蘋果酸的含量。琥珀酸是在厭氧條件下由蘋果酸轉(zhuǎn)化而成的[22-23]，所以推測在穩(wěn)定期添加DAP促進(jìn)了蘋果酸向琥珀酸轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)行。L-蘋果酸是二元羧酸，含量過高會使酒口感酸澀，降低其含量可使蘋果酒口感更加柔和。無水檸檬酸含量受DAP添加時間的影響較大，對數(shù)期添加DAP顯著增加了無水檸檬酸的含量，而在穩(wěn)定期前期添加DAP顯著降低了其含量（P＜0.05）。發(fā)酵過程中添加DAP顯著降低了酒石酸的含量（P＜0.05），其中在穩(wěn)定期前期添加時降低的作用更顯著。草酸和L-乳酸在蘋果酒樣中的含量較低，在穩(wěn)定期前期添加DAP顯著降低了草酸的含量，在對數(shù)期添加DAP顯著增加了L-乳酸的含量（P＜0.05）。

表1 發(fā)酵過程中蘋果酒有機(jī)酸含量的動態(tài)變化Table 1 Dynamic changes of organic acids contents in cider during fermentation process

2.3 發(fā)酵過程中添加DAP對蘋果酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)的影響

不同處理下蘋果酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量如表2所示。由表2可知，蘋果酒中共檢出25種香氣物質(zhì)，包括7種醇類、5種酸類和13種酯類，其中乙酯類8種，乙酸酯類5種。在所有酒樣中，D72處理組的總香氣含量最高，為11.09 mg/L，其次為D0處理組，總香氣含量為9.77 mg/L，D24處理組香氣含量最低，為7.38 mg/L。

表2 發(fā)酵過程中蘋果酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量的動態(tài)變化Table 2 Dynamic changes of volatile aroma compounds contents in cider during fermentation process

不同處理下蘋果酒中各類香氣物質(zhì)含量如圖2所示，在所有酒樣中，含量最高的是乙酯類香氣物質(zhì)，其次為醇類物質(zhì)。在發(fā)酵前和穩(wěn)定期前期添加DAP均顯著增加了酒中乙酯類香氣物質(zhì)的含量，且D72處理組含量最高；所有添加DAP處理組均顯著降低了酒中醇類物質(zhì)的含量，D24處理組醇類物質(zhì)含量最低；此外，只有D72處理組顯著增加了乙酸酯的含量，發(fā)酵前添加DAP對乙酸酯沒有顯著影響（P＜0.05），對數(shù)期添加DAP降低了酒中乙酸酯的含量；添加DAP處理組都增加了酒中酸類物質(zhì)的含量，D0和D72處理組沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖2 發(fā)酵過程中蘋果酒各類香氣物質(zhì)含量的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of aroma substances contents in cider during fermentation process

由表2可知，在所有醇類中，含量最高的是異戊醇，其次是異丁醇，發(fā)酵過程中添加DAP都顯著降低了這兩種物質(zhì)的含量（P＜0.05），在酵母生長階段，氨和其前體物質(zhì)α-酮酸會生成酵母所需的氨基酸，但這兩種物質(zhì)都在穩(wěn)定期才開始合成[24]，因此，在發(fā)酵前和對數(shù)期前期添加DAP顯著降低了這兩種物質(zhì)的含量（P＜0.05）；在穩(wěn)定期添加銨激活了與氨基酸合成有關(guān)的基因LEU1、LEU2、BAT1和BAT2的表達(dá)[25]。此外，在穩(wěn)定期添加DAP顯著增加了酒中2,3-丁二醇和苯乙醇的含量，2,3-丁二醇具有果香和甜香，苯乙醇具有玫瑰香和蜂蜜香，可改善蘋果酒香氣。

酸類物質(zhì)是α-酮酸經(jīng)過脫羧反應(yīng)生成相應(yīng)的醛類，醛類再由乙醛脫氫酶氧化形成相應(yīng)的酸[26]。乙醛氧化脫羧形成酸還是還原形成醇取決于細(xì)胞內(nèi)氧化還原電勢。發(fā)酵過程中添加DAP都顯著增加了己酸、辛酸和癸酸的含量，這可能是因?yàn)镈AP促進(jìn)酵母產(chǎn)生更多的還原性輔酶Ⅰ，從而使醛氧化成酸[27]。

酯類種類繁多，包括乙酯類和乙酸酯類，含量占總揮發(fā)性化合物的一半以上，對蘋果酒果香和花香有重要貢獻(xiàn)。由表2可知，發(fā)酵前和對數(shù)期添加DAP對乙酸乙酯和己酸乙酯沒有顯著影響，但在穩(wěn)定期添加DAP顯著增加了己酸乙酯的含量。另外，發(fā)酵前和穩(wěn)定期添加DAP都顯著增加了辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯含量（P＜0.05），穩(wěn)定期添加增加的效果更顯著。在對數(shù)期添加DAP對乙酸酯幾乎沒有影響，發(fā)酵前添加DAP顯著增加了乙酸己酯和乙酸庚酯的含量（P＜0.05），穩(wěn)定期添加DAP顯著增加了乙酸苯乙酯和乙酸異戊酯的含量（P＜0.05）。有研究表明，乙酸酯的合成主要取決于醇?；D(zhuǎn)移酶的活性，在穩(wěn)定期添加銨能夠使編碼該酶的基因ATF1和ATF2表達(dá)量顯著上調(diào)[14]。

2.4 主成分分析

為了更好地解釋發(fā)酵過程中添加DAP對蘋果酒揮發(fā)性香氣的影響，對各類揮發(fā)性香氣化合物（醇類、酸類、乙酯類和乙酸酯類）進(jìn)行了主成分分析，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵過程中蘋果酒揮發(fā)性化合物主成分分析Fig.3 Principal component analysis of volatile compounds in cider during fermentation process

PC1解釋了65.7%的變量，PC2解釋了32.8%的變量，累計(jì)貢獻(xiàn)率為98.5%。乙酯類和酸類物質(zhì)位于PC2的正向端，且距離酒樣D0較近，說明發(fā)酵前添加DAP能夠顯著增加酒樣中乙酯類和酸類物質(zhì)的含量；此外，乙酯類和乙酸酯類物質(zhì)位于PC1正向端，距離酒樣D72較近，說明穩(wěn)定期前期添加DAP有利于乙酯類和乙酸酯類物質(zhì)的生成。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)分析了在發(fā)酵前、酵母生長對數(shù)期和穩(wěn)定期前期添加DAP對酵母發(fā)酵性能和蘋果酒香氣物質(zhì)的影響。在發(fā)酵前和對數(shù)期前期添加DAP加快了發(fā)酵速率，并增加了酵母數(shù)量，但在穩(wěn)定期添加DAP僅加快發(fā)酵速率，對酵母數(shù)無影響。香氣分析表明，對數(shù)期添加DAP對蘋果酒香氣物質(zhì)影響不顯著，盡管發(fā)酵前和穩(wěn)定期前期添加DAP對蘋果酒香氣的影響表現(xiàn)出一定的相似性，但在穩(wěn)定期前期添加DAP對蘋果酒香氣物質(zhì)含量的提升效果更顯著，尤其對酯類物質(zhì)，所以穩(wěn)定期前期是添加DAP的最優(yōu)時間。本研究可為蘋果酒品質(zhì)特性的改善及氮源在果酒中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。關(guān)于不同時間添加DAP對蘋果酒香氣調(diào)節(jié)的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。