楊 琦，楊許花，楊雪妍，楊 揚，馬燁杰，程子天，高丹丹

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心 中國-馬來西亞國家聯(lián)合實驗室，甘肅 蘭州 730124）

高血壓（hypertension）是指收縮壓≥140 mmHg，舒張壓≥90 mmHg，并且對心臟、腦、腎和其他器官具有功能或器質性損害的一種常見疾病。對于原發(fā)性高血壓，食物中的血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽可用于控制血壓[1-2]。ACE抑制肽抑制血管緊張素I向血管緊張素II的轉化，從而抑制血管收縮并減緩血壓的升高。基于ACE抑制肽毒副作用小、降壓效果顯著的特點，研究人員致力于構建定量構效關系模型，指導合成高效的藥物模型。

以往對ACE抑制肽的研究主要針對ACE抑制肽的制備、分離純化及檢測技術、蛋白質來源等，本研究針對食源性ACE抑制肽的序列信息、降壓機制及ACE抑制肽的定量構效關系進行了概括?？偨Y了能夠描述氨基酸理化性質的定量構效關系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）模型，指出了存在的問題和未來的研究方向，為指導ACE抑制肽的分子設計、合成新型降壓藥物奠定基礎。

1 ACE抑制肽作用機理及制備來源

1.1 血管緊張素轉換酶

血管緊張素轉換酶（ACE、激肽酶Ⅱ或肽基-羧基肽酶）是一種血管內皮細胞膜結合酶，其作用機制是將氨基酸切割成兩段來水解肽鏈C端的二肽殘基。其廣泛分布于人體組織中，在附睪、睪丸和肺組織中含量豐富。其中肺毛細血管內皮細胞中的ACE活性最高。ACE分為體細胞血管緊張素轉換酶（soma-tic angiotensin converting enzyme，sACE）和睪丸血管緊張素轉換酶（testic ACE，tACE）；sACE是由1 306個氨基酸組成的多聯(lián)糖蛋白，存在于內皮和上皮細胞中；tACE含701個氨基酸殘基，分布在雄性動物的睪丸和精子中，它與sACE的C端結構域有相同結構（除前36個氨基酸殘基）[3]。sACE由兩個高度同源的具有60%相似性的蛋白結構域N、C-domain組成，包含His-Glu-X-X-His和Zn2+。兩種結構域在底物和抑制劑的特異性及氯離子激活等方面存在較大差異。sACE的C-domain將十肽血管緊張素I（Angiotensin I，AngI）水解為八肽血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）；而兩種結構域又可共同完成舒緩激肽的水解。

血管緊張素轉換酶粘附在內皮細胞表面，可分解并釋放到血液循環(huán)中。其主要功能是催化血管緊張素I向血管緊張素II的轉化，并滅活緩激肽。ACE的分子質量為120～150 kDa，最適pH為7.5～8.3，等電點（isoelectric point，PI）為4.7，沉降系數為7.9s，是一種能被Zn2+和Cl-激活[4-5]的由單肽鏈組成的糖蛋白。ACE是治療高血壓、心力衰竭、2型糖尿病和糖尿病腎病的理想靶點。

1.2 高血壓產生機制

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）的發(fā)生是由于血管收縮活性的增加或舒張活性的降低，血壓的相對穩(wěn)定受多種活性物質以及血壓調節(jié)系統(tǒng)的影響。這種調節(jié)系統(tǒng)包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）、交感神經系統(tǒng)（sympathetic nervous system，SNS）、一氧化氮合酶/一氧化氮（nitric oxide synthase/nitric oxide，NOS/NO）、內皮素、胰島素、血漿同型半胱氨酸等[6-7]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（kallikrein-kinin system，KKS）作為一對拮抗系統(tǒng)用以維持人體血壓平衡。在RAS系統(tǒng)中，ACE使失活的血管緊張素轉換酶Ⅰ水解為血管緊張素轉換酶Ⅱ，作用于小動脈，引起血管平滑肌收縮，增加外周血管阻力，血壓上升。同時ACE還刺激腎上腺皮質球區(qū)分泌醛固酮，增加鈉含量和血容量水平，促使血壓升高；在KKS系統(tǒng)中，舒緩激肽（bradykinin，BK）能夠擴張毛細血管、增加其通透性，從而降低血壓。然而，ACE能將緩激肽降解為無效片段，使其不能發(fā)揮降壓的作用。如果局部組織ACE含量和活性增加，將直接導致緩激肽含量下降和血管緊張素轉換酶Ⅱ含量增加，從而促進血壓升高。

圖1 腎素-血管緊張素系統(tǒng)、激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)血壓調節(jié)機制Fig.1 Blood pressure regulation mechanism of RAS and KKS system

1.3 ACE及其抑制肽的相互作用

ACE活性位點中有S1、S'1和S'2三個亞位點，它們易與C末端有疏水性氨基酸殘基或競爭性抑制劑的抑制肽作用。位于S1、S'1間的Zn2+從酰胺鍵的酮基得電子參與水解使肽鍵裂解并釋放二肽[8]。ACE和抑制肽間的有多個氫鍵作用，穩(wěn)定了非催化酶-肽復合物的結構，促進ACE抑制肽的活性[9]。

ACE抑制肽直接與血管緊張素轉換酶結合，使其作用喪失，減少血管緊張素II的合成，從而緩解血管收縮、醛固酮分泌造成的血壓升高；同時無法使緩激肽失活成為無效片段，促進血管擴張，降低血壓。所以，ACE抑制肽的攝入能有效地抑制局部ACE的含量增加、活性增強，有效抑制血壓升高[10]。

1.4 食源性ACE抑制肽的制備

食源性ACE抑制肽活性強、安全性高，多從天然蛋白質中水解得到，具有廣泛的生物學功能。研究者從乳源、發(fā)酵食物、動植物、海洋生物中獲得大量ACE抑制肽，為研究打下了堅實的基礎。ACE抑制肽通常通過酶水解、發(fā)酵和脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）重組等方法制備，最常用的制備方法是通過酶水解的形式。發(fā)酵法是在食品發(fā)酵過程中，利用微生物產生的蛋白酶和肽酶水解蛋白質，釋放功能性多肽的方法降低了成本。DNA重組法通過鑒定高活性ACE抑制肽的序列，并進一步融合成能在體系中高效表達的ACE抑制肽，克隆至表達載體并轉接至宿主菌進行表達[11]。對食源性ACE抑制肽來源和序列信息進行匯總見表1。

表1 食源性血管緊張素轉換酶抑制肽來源和序列信息Table 1 Source and sequence information of foodborne angiotensin converting enzyme inhibitory peptide

續(xù)表

2 定量構效關系研究

圖2 定量構效關系原理Fig.2 Principle of quantitative structure-activity relationship

定量構效關系（QSAR）是研究有機小分子和生物大分子相互作用和有機小分子在生物體內的吸收、分布、代謝和排泄的一種方法，可以深入研究ACE抑制肽的結構和活性機制，了解ACE抑制肽活性對血壓的影響，優(yōu)化ACE抑制肽的結構以改變其活性，指導生產高效、低成本的抗高血壓藥物。QSAR可以建立ACE抑制肽的生物活性與分子結構之間的定量關聯(lián)模型，篩選和設計有效的藥物模型，是ACE抑制肽研究的熱點。

QSAR研究方法最早由HANSCH等確立，將分子電性、立體效應與分子活性聯(lián)系構建定量模型。隨著計算機輔助手段的發(fā)展，QSAR從二維（two dimension，2D）發(fā)展到六維。

2.1 二維定量構效方法

2D-QSAR主要包括Hansch法、基團貢獻法和分子連接性指數法三類。多元線性回歸法（multiple linear regression,MLR）、主成分分析法（principal components，PCA）、偏最小二乘法（partial least squares，PLS）和人工神經網絡法（artificial neural networks，ANN）為其主要的建模方法。Hansch法是假設化合物活性和可計算測量物化性質相聯(lián)系，采用多重自由能相關法，最后再利用多元線性回歸法就能得到目標的模型；基團貢獻法則適用于對具有相同母體的有機物的毒性評估；分子連接性指數法是根據骨架原子連接排列方式來描述分子結構特征的一種方法。

2.2 三維定量構效方法

3D-QSAR有分子形狀分析、距離幾何方法、比較分子力場分析、比較分子相似因子分析以及虛擬受體等。其方法是在分子水平上認為，影響生物活性的相互作用主要是非共價性立體和靜電作用，在模型建立后通過非交叉驗證的相關系數R2、方差比F和絕對標準差S來作為其預測準確能力的依據。

2.3 高維定量構效方法

四維定量構效是在三維的基礎上考慮了分子的多構象計算；五維定量構效是在四維的基礎上考慮了受體對配體的誘導契合；六維定量構效進一步考慮了受體和配體相互作用時的溶劑化作用。

表2 定量構效關系方法的原理及優(yōu)缺點Table 2 Principles,advantages and disadvantages of quantitative structure-activity relationship method

3 ACE抑制肽定量構效研究進展

HELLBERG S等[36-37]對20種天然氨基酸的29種理化參數進行了分類，將其分為固體大小、分子親水性和電荷性質三類，稱為z-標度（Z-scales）。采用主成分分析法（PCA）對29個理化參數描述的氨基酸的主要性質進行了總結。Z1主要與親水性有關，Z2主要與固體尺寸有關，Z3主要與電荷性質有關。通過偏最小二乘分析得到兩個潛在變量。實驗結果表明，該模型預測能力較好，但不能表達構象信息。

COLLANTES E R等[38]構建了氨基酸結構并分析了氨基酸的構象，優(yōu)化能量，計算量子化學參數。用氨基酸的各向同性表面積（isotropic surface area，ISA）來描述側鏈基團的疏水性和分子體積。用電荷指數（charge index，ECI）描述受體側鏈基團的極性和受體與側鏈的偶極相互作用。實驗結果表明，該過程中使用的描述子較少，所有的描述子都是根據氨基酸的空間結構計算出來的。ISA-ECI比Z-scales有更大的自由度，因此更容易研究非天然氨基酸。

林治華等[39]基于肽鏈的一級結構，構建了分子電負性邊距矢量（molecular electronegativity edge-distance vector，VMED）。二肽由兩個氨基酸殘基組成，結構簡單，難以形成復雜的三維結構。能方便地計算出電邊緣矢量，并具有良好的活性相關性。

彭劍秋[5]將SVHEHS的13個主成分命名為SVHEHS1-SVHEHS13，分別將多元線性回歸（MLR）、偏最小二乘法（PLS）、人工神經網絡（ANN）用于ACE抑制肽的QSAR研究。實驗表明，MLR模型方程提供的多肽活性影響信息更有針對性，模型有較好的預測效果；PLS模型獲得了不同長度肽段結構與活性關系信息，模型的擬合能力、內部預測能力和穩(wěn)健性良好，外部預測能力也在合理范圍內；結果顯示ANN模型與PLS模型有相同的預測能力。

張艷萍等[40]用PLS、支持向量機（support vector machine，SVM）、主成分分析-支持向量機（principal component analysis-support vector machine，PCA-SVM）對食源性ACE抑制二肽建模，發(fā)現三種模型的預測能力無顯著差異，均能預測ACE抑制肽的活性。SVM、PCA-SVM的預測力相對較強。梅虎等[41]用PLS對苦味二肽和血管舒緩激肽促進劑建模，實驗表明，VHSE比Z-scales有更精切的物化意義，并含有更豐富的氨基酸結構信息。

梅虎[42]分析了20種氨基酸的拓撲結構。從70個結構和拓撲性質中選取25個特征。通過主成分分析（PCA）得到三個主成分。對于每個氨基酸都用得分矢量VSTV1、VSTV2、VSTV3作為新的描述子代替原始矩陣。用VSTV描述子比較MLR、主成分回歸（principal component regression，PCR）、PLS、人工神經網絡和BP算法（artificial neural network and BP algorithms，BP-ANN）、SVM。對象為苦味二肽、血管收縮素轉化酶抑制劑、血管舒緩激肽促進劑、后葉催產素和HLA-A*0201限制性CTL表位。研究表明，各種模型的建模結果基本一致。對于不同的建模對象，五種模型各有優(yōu)勢。

李玲霄[43]對20種氨基酸建立初始構象，通過主成分分析，分別用三類描述子的前6、3、6個主成分對氨基酸進行結構表征，代替原始矩陣，并命名為SVGMW。對血管緊張素轉換酶抑制劑、苦味二肽和后葉催產素進行研究，發(fā)現SVGMW能系統(tǒng)表征多肽結構和生物活性間的信息，研究過程簡單可靠，適用范圍廣，不受外界影響。運用同樣的方法，篩選出幾何描述符47個、特征值信息44個、分子幾何反比度信息41個，通過主成分分析，用三種描述子的前6、3、2個主成分對氨基酸進行結構表征，代替原始矩陣，命名為SVGER。對血管緊張素轉換酶抑制劑、苦味二肽和后葉催產素進行研究，發(fā)現SVGER也能夠系統(tǒng)表征多肽結構和生物活性間的信息，適用范圍廣且不受外界影響。

4 展望

在目前研究中，定量構效關系能準確找到抑制肽結構信息與生物活性的關系，指導合成高效降壓藥，在藥物研究中起到很重要的作用。隨著研究人員對ACE抑制肽的深入了解，獲得了越來越多的有效信息，但同時也存在很多問題：①由于ACE的三維結構和長肽在立體空間中的強柔性，導致二維定量構效關系很難涉及分子空間構象的變化。此后應針對長肽分子展開更高維定量構效關系的研究。②目前的肽類結構描述子優(yōu)勢互補，但從長遠來看，還需要解決幾個關鍵性問題：a.擬肽和環(huán)肽結構表征的問題；b.不同長度肽的結構表征問題；c.結構復雜導致的計算復雜度過高的問題。③在定量構效關系研究中，以支持向量機為代表基于核函數的建模方法成為主流，但目前需要解決幾個基于核函數的各種方法的問題：a.核函數的選擇；b.參數的尋優(yōu)；c.計算速度的提高；d.結果的可解釋性等。④前人對多肽空間位阻以及多肽對ACE活性中心Zn2+正四面體結構的影響進行了深入研究，此后可通過熒光猝滅、等溫滴定量熱法等實驗方法對多肽與ACE之間的結合能進行研究。⑤此前研究多針對ACE抑制肽活性的體外模擬，此后可通過制備高效的ACE抑制肽進行生物實驗，探究其生物利用度。