張 銳，顧志榮，呂 鑫，葛 斌

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000；2. 甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

紅芪是豆科植物多序巖黃芪的干燥根，功能補氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血，行滯通痹，托毒排膿，斂瘡生肌[1]。紅芪主要分布在甘肅的六盤山及南部山地處，與黃芪同科異屬，首載于《神農本草經》中黃芪項下，同被列為上品。紅芪與黃芪的功效大致相同，但在物質基礎、藥理藥效方面存在一定差異[2]。紅芪以其復雜的化學成分、多重的藥理作用及巨大的治療價值受到廣泛關注。研究表明，紅芪的主要化學成分有皂苷類、黃酮類、苯丙素類、糖苷類、多糖、氨基酸、微量元素等，具有抗氧化[3]、促生長[4]、調節(jié)免疫[5]、抗腫瘤[6]、抗炎[7]、神經保護[8]、抗老年癡呆[9]、保護心肌[10]、抗骨質疏松[11]、抗貧血[12]、抗衰老[13]等廣泛的藥理作用，其中抗腫瘤、治療糖尿病并發(fā)癥、抗骨質疏松及化學成分與藥理作用的“譜-效”關系等是目前研究的熱點。

網絡藥理學是近年來隨著“互聯(lián)網+大數據”的快速發(fā)展而興起的交叉學科，它通過系統(tǒng)、綜合的思路探討“藥物-靶點-疾病”之間的深層次、全面的作用機制，與中醫(yī)藥的整體性、系統(tǒng)性思維完全契合，是近年來快速發(fā)展的研究中醫(yī)藥復雜作用的有力工具[14]。紅芪的活性成分種類較多且復雜，藥理作用較為廣泛，開發(fā)利用價值較大，在多種疾病治療中顯示了很大的潛力，因此有必要基于網絡藥理學技術對其活性成分、作用靶點及潛在的治療價值進行深入梳理與探討，為其進一步研究提供有益思路。

1 資料與方法

1.1 分析軟件和數據庫

中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)數據庫(http://lsp. nwu. edu. cn/tcmsp. php)，UniProt蛋白數據庫(http://www. uniprot. org)，Swiss Target Prediction服務器(http://www. swisstargetprediction. ch/)，String數據庫(https://string-db. org/Version 10.5)，Cytoscape 3.6.0軟件，David數據庫(https://david. ncifcrf. gov/home. Jsp)。

1.2 活性成分的篩選

TCMSP[15]采用的是HIT數據庫預測算法SysDT來獲得藥物靶點之間的關系，在TCMSP中可獲取每種藥物的藥代動力學信息，如類藥性(Drug like，DL)、口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)、血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)、腸上皮通透性(Intestinal epithelial cells，Caco-2)、脂水分配系數(Lipid-water partition coefficient，ALogP)、H鍵供體/受體(H bond donor/acceptor，H don/H acc)等。OB指藥物被吸收進入人體循環(huán)的速度與程度，DL指化合物與已知藥物的相似性。通過操作TCMSP收集、整理紅芪中的所有化學成分，并依據OB≥30%且DL≥0.18篩選出紅芪中的活性成分。

1.3 候選化合物靶點的預測

Uniprot(Universal protein resource，UniProt)數據庫被認為是收錄最廣泛和注釋信息最全面的蛋白質數據庫，其數據主要來自于基因組測序項目完成后，后續(xù)獲得的蛋白質序列。通過Uniprot數據庫將TCMSP挑選出的目標蛋白名轉化為基因名，并找出其對應的Uniprot ID，最后匯總整理。

1.4 靶點蛋白的補充

從TCMSP的候選化合物的“Pubchem Cid”中進入，在Swiss Target Prediction中利用SMILES格式預測靶點蛋白，將其與“1.3”項所得基因匯總在一起，進行收集整理。

1.5 網絡的構建與分析

將“1.4”項得到的基因名進行查重，得到潛在靶點，將其導入String網站中，得到紅芪中的“活性成分-靶點”網絡模型圖，將其以TSV格式通過Excel導出后，帶入Cytoscape 3.6.0軟件中，利用Network Analyzer插件進行網絡分析，繪制網絡圖。將Betweenness Centrality(介數中心性值，接近中心性高的靶標與更多的靶標直接相連，表明該靶標在不同疾病病機過程中的重要性)和Degree(結點中心度，反映與某個靶標共同參與不同疾病病理過程的其他靶標數目)中的數據選取高于平均值以上，并將其對應的基因摘出，找出相應的Uniprot ID，便得到關鍵靶點。

1.6 靶標的GO富集分析及KEGG通路分析

將從“1.5”項中得到的關鍵靶點Uniprot ID導入David數據庫功能注釋工具中進行分析。進入Functional Annotation Chart，下載“Gene Ontology”中的生物過程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF)和細胞組成(Cellular component，CC)，進行GO富集分析，并下載“Pathways”中的KEGG_PATHWAYS進行KEGG通路分析。

1.7 目標疾病的預測

將關鍵靶點的Uniprot ID導入David數據庫功能注釋工具中，操作進入Annotation Summary Results界面后，同時操作“Disease”中的GAD_DISEASE和OMIM_DISEASE，然后進入Functional Annotation Chart。將數據下載后導入Excel中，再根據其P值選擇對應的疾病，即為其預測的疾病。

2 結 果

2.1 活性化合物的篩選

在TCMSP數據庫中，以中藥“紅芪”為“Herb name”搜索紅芪中的所有化學成分，共得到43個化學成分。結合閾值(OB≥30%且DL≥0.18)篩選后，共得到14個活性成分。結果見表1。

表1 紅芪中14個活性化合物的基本信息Table 1 Basic information of 14 active compounds in Radix Hedysari

2.2 活性成分-靶點相互作用的網絡分析

從TCMSP數據庫整理得到的有關紅芪的靶點基因共有405個，將紅芪的Smiles格式上傳到Swiss Target Prediction網站，共得到278個潛在作用靶點。對匯總的靶點基因進行查重后，共得到334個靶點基因。利用String網站對查重后的潛在靶點進行網絡分析，得到紅芪的“活性成分-靶點”網絡模型圖(圖1)。分析其網絡模型圖，發(fā)現(xiàn)有303個節(jié)點，1227條邊。網絡中的節(jié)點表示紅芪中的藥物活性成分與關鍵靶點基因；網絡中的邊表示單味藥與活性成分及活性成分與關鍵靶點基因。

圖1 紅芪活性化合物-靶點網絡圖Fig. 1 Network diagram of active compounds - targets of Radix Hedysari

選取Betweenness Centrality、Degree均大于其平均值的57個靶標作為關鍵靶標，如表2所示。其中，Degree值在前5名的靶點基因分別為AKT1、TP53、IL6、VEGFA及MAPK3，表明這些基因在網絡中具有重要的位置，可作為紅芪有效成分作用的靶點基因。

表2 紅芪的57個關鍵靶標Table 2 The 57 key targets of Radix Hedysari

續(xù)表2 紅芪的57個關鍵靶標Table 2 The 57 key targets of Radix Hedysari

2.3 GO富集分析

利用DAVID數據庫對關鍵靶標進行GO分析，包括生物過程、細胞組成和分子功能分析，結果如表3～5所示。GOBP分析顯示有462條生物學過程與此有關，最顯著的5條分別為RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的陽性調控、對藥物的反應、轉錄的陽性調節(jié)，DNA模板、凋亡過程的負調節(jié)及信號傳導。GOCC分析顯示有48條細胞組成與此有關，最顯著的5條分別為細胞核、胞質溶膠、細胞質、核質及質膜。GOMF分析顯示有73條分子功能與此有關，最顯著的5條分別為蛋白質結合、酶結合、相同的蛋白質結合、轉錄因子結合及DNA結合。結果表明，紅芪可以通過參與調控多種生物學過程而發(fā)揮其治療作用。

表3 GO-BP分析結果Table 3 Analysis results of GO-BP

表4 GO-CC分析結果Table 4 Analysis results of GO-CC

2.4 KEGG通路分析

采用Omicshare數據庫中的高級氣泡圖技術對KEGG進行通路分析，其中前20條通路結果如圖2。富集最顯著的5條通路為癌癥的途徑(Pathways in cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、癌癥中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)及腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)。在與疾病類相關的通路中，主要有乙型肝炎(Hepatitis B)、癌癥的途徑(Pathways in cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、恰加斯病(美國錐蟲病)(Chagas disease (American trypanosomiasis)、胰腺癌(Pancreatic cancer)、前列腺癌(Prostate cancer)及利什曼病(Leishmaniasis)等；與信號傳導功能相關的有腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)及催乳素信號通路(Prolactin signaling pathway)等。

圖2 紅芪作用核心靶點的KEGG富集分析Fig. 2 KEGG enrichment analysis of the core target of Radix Hedysari

2.5 治療疾病的富集分析

在DAVID網站對紅芪作用的關鍵靶點進行疾病富集分析，有顯著性差異的潛在的治療疾病結果如表6?？芍t芪具有潛在治療價值的疾病主要是膀胱癌、肺癌、結直腸癌、前列腺癌、乳腺癌等癌癥，以及慢性阻塞性肺疾病和慢性腎功能衰竭，其中P值最小值所對應的疾病為膀胱癌。

表6 紅芪治療的疾病富集分析Table 6 Enrichment analysis of RadixHedysari in the treatment of diseases

3 討 論

本研究通過網絡藥理學相關技術，從紅芪藥物中篩選出了14個活性成分和683個靶點基因，通過對這些靶點基因進行網絡分析，發(fā)現(xiàn)度值比較高的靶點基因有AKT1、TP53、IL6、VEGFA、MAPK3等。治療疾病的富集分析表明，紅芪具有潛在治療價值的疾病主要是膀胱癌、肺癌、結直腸癌、前列腺癌、乳腺癌等癌癥。已有研究發(fā)現(xiàn)，AKT1在腫瘤化療的耐藥性方面有著極其重要的作用，AKT1可調控胃癌細胞對阿霉素的耐藥性，且經常與NF-kappaB、Notch-1、PTEN等共同發(fā)揮作用[16]。TP53基因與腫瘤的關系極其密切，可通過缺失、突變等直接影響p53蛋白的活性，進而導致許多腫瘤的發(fā)生[17]。其中，TP53INP1在肝癌組織和癌旁正常肝組織中都有表達，但TP53INP1在癌旁正常肝組織中比肝癌組織中表達更加強烈，可推測TP53INP1具有一定效果的抑癌作用[18]。IL6的缺失會加速肝癌、結直腸癌的發(fā)生，增加臟器中的腫瘤負荷，因此可推測IL6基因能夠抑制腫瘤的生長[19]。VEGFA(血管內皮生長因子A)在肝細胞癌中的表達率很高，它是VEGF的6個亞型中最重要的一個，主要影響血管內皮細胞的增殖和分化[20]。而肝癌組織中分布著極豐富的血管，因此VEGFA對肝癌的治療具有良好的作用。VEGFA與miR-206存在直接的靶向關系，miR-206過表達靶向VEGFA對人肝癌HepG2細胞的侵襲和遷移具有明顯的抑制作用[21]；而miR-205也可以借助VEGFA來控制乳腺癌的增殖[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，紅芪作用的潛在通路有癌癥的途徑、膀胱癌、癌癥中的蛋白多糖、乙型肝炎、腫瘤壞死因子信號通路及HIF-1信號通路等91個。其中，癌癥的途徑參與多種活性化合物的抗癌機制，如PI3K/AKT途徑參與卵巢癌[23]、乳腺癌[24]、非小細胞肺癌[25]、結直腸癌[26]等，Wnt途徑參與前列腺癌[27]、結腸癌[28]、乳腺癌[29]、肝癌[30]等。MAPK signaling pathway與腫瘤惡性演進密切相關，MAPK及其信號通路在腫瘤侵襲和轉移中起到中介和信號放大作用，能夠接受大量來自生長因子、絲裂原、環(huán)境刺激等的信號，還可通過MAPK級聯(lián)反應作用于核轉錄因子，調控基因表達[31]。如p38 MAPK信號通路的激活，能夠增強宮頸癌細胞的細胞毒性T淋巴細胞反應[32]；抑制MAPK信號通路，能夠克服他莫昔芬耐藥性并改善乳腺癌的預后；通過抑制MAPK信號通路能夠抑制BRAF突變型結腸癌細胞的生長[33]。

本研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇、槲皮素也是紅芪的主要活性成分，而這2個成分在已有的紅芪相關研究中并未得到足夠的重視。β-谷甾醇具有較好的抗氧化、抗菌、抗癲癇等作用，并對胃癌、肝癌、宮頸癌、胰腺癌、肺癌等各種癌細胞均有較好的抑制作用，其中對胃癌的作用尤強[34]。槲皮素對宮頸癌HeLa細胞的增殖有明顯的抑制作用，也可誘導HeLa細胞發(fā)生自噬，而其機制與抑制TGF-β signaling pathway有關[35]；能夠抑制人轉移性卵巢癌細胞的生長并調節(jié)PA-1細胞系固有凋亡途徑的相關成分[36]；通過PI3K/AKT通路促進人胰腺癌細胞的死亡，并增強其化學敏感性[37]；對結腸癌LOVO細胞的增殖侵襲能力具有抑制作用，并能抑制癌胚抗原(CEA)的表達[38]；通過抑制VEGF/PI3K/Akt信號通路，聯(lián)合二甲雙胍能夠協(xié)同抑制前列腺癌細胞[39]。