沈海聰， 朱 志

（廈門大學化學化工學院，福建廈門361005）

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 （SARSCoV-2） 給全人類生命健康和公共醫(yī)療系統(tǒng)帶來了嚴重威脅。 迄今為止，由于缺乏針對該病毒的有效藥物和疫苗，快速、大規(guī)模的感染者鑒定對病毒的擴散控制有著重要意義。 SARS-CoV-2 的檢測方法主要分為3 類： 胸部計算機斷層掃描（CT），血清學檢查和核酸檢查。胸部CT 能夠檢測到患者的肺部病變，但它不能準確識別輕度肺部病變或無癥狀的患者，特異性不夠。 血清學檢測主要檢測患者血清中的抗體，但受限于檢測窗口期。 相比之下，即便在感染的初期，患者鼻咽拭子中的病毒滴度也比較高， 因此直接對病毒進行RNA 檢測是比較推薦的[1]。 反轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）被認為是SARS-CoV-2 核酸檢測的金標準。 然而，RT-qPCR 方法需要專用且昂貴的設(shè)備， 專業(yè)的操作以及較長的樣品檢測時間，不利于資源匱乏地區(qū)、學校、診所和家庭的使用。 作為RT-qPCR 方法的有效補充，基于核酸恒溫擴增的技術(shù)和CRISPR 技術(shù)的側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l可滿足快速檢測的需求[2]。 當前的研究大都只是針對單一的靶基因，這對臨床的診斷是不夠準確的。 最近，華南師范大學生命科學學院周小明教授課題組聯(lián)合湖北省疾病預防控制中心，將Cas9/sgRNA 系統(tǒng)整合到已建立的生物傳感平臺中，通過膠體金試紙條對新冠病毒的E 和Orf1ab基因片段進行聯(lián)合檢測，以期獲得更加可靠的檢測結(jié)果[3]， 這一研究成果近期發(fā)表在Angew．Chem．Int．Ed．雜志上。

為了實現(xiàn)雙基因檢測的目標，他們首先設(shè)計了包括兩條測試線（T 1 和T 2）和一條質(zhì)控線（C）的膠體金試紙條（圖a）。 隨后，利用多重RT-RPA恒溫核酸擴增技術(shù)，對目標基因E 和Orf1ab 進行擴增使其DNA 雙鏈產(chǎn)物分別帶上生物素和地高辛標記物（圖b）。 同時利用基因特異性的Cas9/sgRNA1 和Cas9/sgRNA2 復合物對相應的DNA雙鏈產(chǎn)物進行識別和結(jié)合。 在試紙條分析中，將以上復合物加到試紙條樣品墊上，液體流經(jīng)金標墊時， 預固定的AuNP-DNA 探針通過核酸雜交與Cas9/sgRNA 上的環(huán)形支架序列結(jié)合， 使得DNA 雙鏈產(chǎn)物間接帶上納米金信號；接著，復合物依次流過T1（固定有鏈霉親和素）和T2（固定有抗地高辛抗體）， 帶有生物素或地高辛標記物的復合物分別被捕獲； 多余的AuNP-DNA 探針則被C 線捕獲。 最后，通過肉眼識別即可得到相應的檢測結(jié)果（圖c）。 這種新開發(fā)的雙靶標核酸檢測試紙條可提供4 個潛在的測試結(jié)果：①僅C線可見，表示測試結(jié)果為陰性；②③T1 線和C 線（或T2 線和C 線）可見，表示只有單個基因被發(fā)現(xiàn)，暗示有可疑感染；④T1 線、T2 線和C 線均可見， 確認SARS-CoV-2 感染。 在單個反應中（25 μL），該技術(shù)可檢測出100 個RNA 拷貝。 在臨床64 例樣本的檢測中， 該方法具有100%的陰性預測值和97．14%的陽性預測值。 綜上，該平臺具有為資源貧乏地區(qū)提供更加準確便捷的SARSCoV-2 或其他傳染病診斷的潛力。