王隆隆，張海風(fēng)，楊忠杰，劉菊，黃霞，于曉濤，王瑞*（.漯河市中心醫(yī)院，河南 漯河 4600；.鄭州市中醫(yī)院，鄭州 450000；.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州 450000）

雙石清熱合劑是本院中醫(yī)科醫(yī)師在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中以《銀翹散》為基礎(chǔ)加減裁化所得的臨床驗(yàn)方，由金銀花、黃芩、知母等14味中藥組成，主要用于熱毒壅盛所致發(fā)熱面赤、口渴、頭昏、喉腫等癥。方中以金銀花為君藥，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱功效；以黃芩、知母為臣藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒、滋陰潤(rùn)燥的功效；佐以梔子，清瀉三焦火熱、涼血解毒[1]。金銀花、梔子、知母、黃芩等中藥具有抗菌、抗炎、抗病毒、解熱及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用[2-3]，該方常用于肺胃實(shí)熱、口舌生瘡、牙齦腫痛及上呼吸道感染等[4]。

本文選取金銀花、黃芩、知母、梔子和牛蒡子為研究對(duì)象，建立合適的HPLC法同時(shí)測(cè)定綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷6種指標(biāo)成分的含量。目前，雙石清熱合劑的制備是傳統(tǒng)的煎藥經(jīng)驗(yàn)，并未進(jìn)行系統(tǒng)性工藝研究，為了保證藥品質(zhì)量和療效，本文通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，更全面地保證了藥品質(zhì)量，確保了患者用藥的安全性、有效性和穩(wěn)定性[5]。

1 材料

1.1 中藥飲片

中藥飲片金銀花（批號(hào)：190801）、蟬蛻（批號(hào)：191101）、生石膏（批號(hào)：191001）、連翹（批號(hào)：190201）、大青葉（批號(hào)：190401）、黃芩（批號(hào)：190901）、龍膽（批號(hào)：191101）、梔子（批號(hào)：190701）、玄參（批號(hào)：190801）、麥冬（批號(hào)：190501）、知母（批號(hào)：291101）（河南鴻博藥業(yè)有限公司）；牛蒡子（批號(hào)：1708100017）、紫花地?。ㄅ?hào)：1710120037）、地黃（批號(hào)：1712230127）（亳州天濟(jì)藥業(yè)有限公司），由鄭州大學(xué)藥學(xué)院賈陸教授鑒定為金銀花（Lonicera japonicaThunb.）、蟬蛻（Cryptotympana pustulataFabricius）、生石膏（Gypsum Fibrosuum）、連翹[Forsythia suspensa（Thunb.）Vah]、大青葉（Isatis indigoticaFort.）、黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）、龍膽（Gentiana scabraBge.）、梔子（Ganiema Ellis）、玄參（Scrophularia ningpoensisHemsl）、麥 冬[Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-GawL]、知母（Anemarrhena asphodeloidesBunge）、牛蒡子（Arctiumm lappa.）、紫花地?。╒iok yedoensisMakino）、地黃（Rehmannia glutinosaLibosch.），均為合格飲片。

1.2 試藥

對(duì)照品綠原酸（批號(hào)：110753-201817，純度：96.8%）、梔子苷（批號(hào)：110749-201718，純度：97.6%）、芒果苷（批號(hào)：111607-201704，純度：98.1%）、黃芩苷（批號(hào)：110715-201821，純度：95.4%）、牛蒡苷（批號(hào)：110819-201812，純度：95.0%）、漢黃芩苷（批號(hào)：112002-201702，純度：98.5%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲醇均為色譜純（美國(guó)Fisher公司）；甲酸為色譜純（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其余試劑為市售分析純；水為飲用水或超純水。

1.3 儀器

島津LC-20AD高效液相色譜儀（包括二元泵、全波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、工作站）；DHG-9070型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SB25-12D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；FW-80型微型高速萬(wàn)能試樣粉碎機(jī)（天津市工興電器廠）；AUW-120D型十萬(wàn)分之一電子天平（日本SHIMADZU公司）；5810R高速離心機(jī)（美國(guó)Eppendorf公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

采用色譜柱為Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以0.5%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～20 min，8%B；20～50 min，8%～15%B；50～90 min，15%～35%B；90～100 min，35%～80%B；100～110 min，80%B；110～112 min，80%～8%B；112～120 min，8%B）；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL；流速0.8 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)239 nm[6-7]。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷對(duì)照品適量，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度為1.86、2.00、1.89、2.02、2.14、2.03 mg·mL－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取上述各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，混勻，制得質(zhì)量濃度分別為127.77、166.02、36.05、826.41、113.72、295.52 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液，密封保存。

2.3 供試品溶液制備

按處方稱取6份藥材飲片，按照原工藝方法（加水8倍，煎煮2次，每次1.5 h，濃縮至500 mL）制備，取樣品10 mL，置于50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL，超聲1 h，冷卻后室溫稱重，用50%甲醇補(bǔ)足失重，13 000 r·min－1離心3 min，取上清液為供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液制備

按照雙石清熱合劑處方比例分別稱取缺金銀花、梔子、知母、黃芩、牛蒡子的5份處方藥材，依據(jù)“2.3”項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液[8]。

2.5 專屬性考察

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示，陰性樣品無(wú)干擾，且分離度均超過(guò)1.5，表明該色譜方法分離效果良好。

圖1 雙石清熱合劑高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of Shuangshi Qingre mixture

2.6 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液100、200、400、600、800、1000 μL，分別置于1 mL量瓶中，用甲醇定容，制成系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液。進(jìn)樣測(cè)定，以各待測(cè)成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，以S/N約為3時(shí)計(jì)算檢測(cè)限，以S/N約為10時(shí)計(jì)算定量限，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各化學(xué)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量限及檢測(cè)限Tab 1 Regression equation，correlation coefficient，linearity，LOQs and LODs of components

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷峰面積的RSD為0.81%、0.50%、0.32%、0.54%、0.65%、1.3%，表明儀器的精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

按處方比例稱取6份各藥材飲片，按照原工藝方法制備6份溶液，并按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定各成分含量。結(jié)果綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、黃芩苷的RSD分別為1.8%、1.6%、0.79%、2.3%、1.0%、1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，室溫下存放 0、6、12、24、48 h，進(jìn)樣后測(cè)定，記錄各指標(biāo)成分峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為2.4%、3.0%、0.99%、3.2%、1.3%、2.0%，表明樣品溶液在室溫條件下48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收試驗(yàn)

取“2.8”項(xiàng)下已知含量的供試品溶液1 mL，分別置于2 mL離心管中，精密加入“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1、1.5 mL，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算出各成分含量和回收率。結(jié)果表明各成分平均回收率在98.7%～103.7%，RSD均＜5%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度良好。

2.11 樣品含量測(cè)定

取已知含量雙石清熱合劑3批（批號(hào)：20190903、20191209、20200203），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算3批樣品的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(μg·mL－1)Tab 2 Content determination in sample (μg·mL－1)

3 Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

3.1 評(píng)分方法

由于經(jīng)驗(yàn)性加權(quán)評(píng)分方法容易主觀性干擾，本試驗(yàn)根據(jù)6種指標(biāo)成分的重要程度結(jié)合含量測(cè)定結(jié)果，采用SPSS軟件降維因子分析與“歸一法”相結(jié)合的評(píng)分方法[2，9]。結(jié)果顯示綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷的權(quán)重系數(shù)分別為0.1921、0.0856、0.1101、0.2286、0.1749、0.2126，即綜合評(píng)分Y＝0.1921X1＋0.0856X2＋0.1101X3＋0.2286X4＋0.1749X5＋0.2126X6（X為指標(biāo)成分）。

3.2 單因素試驗(yàn)

① 吸水率試驗(yàn)：按處方量比例稱取中藥飲片，考察藥材浸泡不同時(shí)間的吸水率（室溫約22℃），結(jié)果藥材浸泡40 min時(shí)吸水率達(dá)到17.5%，吸水較快；浸泡120 min時(shí)吸水率為24.3%，達(dá)到飽和。

② 加水量試驗(yàn)：按處方量比例稱取中藥飲片，考察煎煮90 min，煎一次條件下不同加水量（4、6、8、10、12、14倍）的評(píng)分結(jié)果。

③ 煎煮時(shí)間試驗(yàn)：按處方量比例稱取中藥飲片，考察加10倍量水，煎一次條件下不同煎煮時(shí)間（60、80、100、120 min）的評(píng)分結(jié)果。

④ 煎煮次數(shù)試驗(yàn)：按處方量比例稱取中藥飲片，考察加10倍量水，煎100 min條件下不同煎煮次數(shù)（1、2、3、4次）的評(píng)分結(jié)果。

結(jié)果見(jiàn)圖2，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，藥材吸水0.24倍，對(duì)實(shí)際影響較小，故本試驗(yàn)采用浸泡40 min，加水量8、10、12倍，煎煮80、100、120 min，煎煮1、2、3次進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 單因素試驗(yàn)Fig 2 Single-factor experiment

3.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

3.3.1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)以加水量（A）、煎煮時(shí)間（B）、煎煮次數(shù)（C）為考察因素，采用Design-Expert v.8.0.6軟件，按照Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)原理，以6個(gè)成分指標(biāo)的綜合得分為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表3，結(jié)果見(jiàn)表4[10]。

表3 因素與水平Tab 3 Factor and level

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Tab 4 Design and result of the response surface test

3.3.2 模型結(jié)果分析 采用Design-Expert v.8.0.6軟件對(duì)表5的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到綜合得分Y＝2.29＋0.024A＋0.044B＋0.22C－0.044AB＋0.018AC－0.020BC－0.04A2－0.091B2－0.15C2，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，在回歸方程中一次項(xiàng)B、C，二次項(xiàng)B2、C2為顯著項(xiàng)（P＜0.05），交互項(xiàng)AB、AC、BC均不顯著（P＞0.05）；整體模型P＜0.05，表示該模型可以用于指標(biāo)評(píng)分的分析和預(yù)測(cè)，且各指標(biāo)對(duì)綜合評(píng)分的影響C（煎煮次數(shù)）＞B（煎煮時(shí)間）＞A（加水量）。采用Design-Expert v.8.0.6軟件繪制各影響因素的響應(yīng)面圖，見(jiàn)圖3。由圖3可知交互因素BC＞AC＞AB。

圖3 各因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖Fig 3 Response surface of the interaction of various factors on the comprehensive score

表5 方差分析結(jié)果Tab 5 Analysis of variance

3.4 最優(yōu)結(jié)果的確定

采用Design-Expert v.8.0.6軟件預(yù)測(cè)的最佳工藝為加水10.66倍，煎煮101.62 min，煎煮2.73次，綜合評(píng)分2.379。根據(jù)單因素試驗(yàn)及實(shí)際工藝要求，最終確定工藝為浸泡40 min，加水量為10倍量，煎煮3次，每次100 min。

3.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方比例稱取各中藥飲片，按照“3.4”項(xiàng)下工藝方法，平行進(jìn)行3次試驗(yàn)。按照“2.1”項(xiàng)下色譜方法同時(shí)測(cè)定6種成分含量，并計(jì)算出綜合評(píng)分。結(jié)果顯示3份樣品的綜合評(píng)分分別為2.357、2.337、2.399，與預(yù)測(cè)工藝綜合評(píng)分2.382偏差[偏差＝（最優(yōu)值－預(yù)測(cè)值）/ 預(yù)測(cè)值×100%]分別為1.05%、1.89%、－0.71%，表明該提取方法實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值擬合較好，表明該工藝方法穩(wěn)定可行。

4 討論

本試驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸、乙腈-0.5%甲酸幾種流動(dòng)相搭配，最終確定了以乙腈-0.5%甲酸水溶液梯度洗脫進(jìn)行雙石清熱合劑中6種有效成分測(cè)定，結(jié)果顯示各成分特征峰的分離度均高于1.5，且峰形較好。

本試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)Design-Expert v.8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，選擇出了加10倍量水，浸泡40 min，煎煮3次，每次100 min為最佳工藝方法。該方法穩(wěn)定、可靠，可作為該制劑的生產(chǎn)工藝。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同工藝方法下梔子苷、黃芩苷的含量變化較大，而芒果苷、牛蒡苷含量變化相對(duì)較?。浑S著煎煮時(shí)間的延長(zhǎng)，綠原酸、梔子苷含量有下降趨勢(shì)，黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷含量有上升趨勢(shì)，該制劑的清熱，抗炎、抗病毒效果可能會(huì)隨煎煮時(shí)間的延長(zhǎng)而改變[11-12]。

綜上所述，本文建立了測(cè)定6種有效成分的HPLC法，進(jìn)一步利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，可有效地保證該制劑療效可控、質(zhì)量穩(wěn)定，確?；颊哂盟幇踩?。本研究也為醫(yī)院新制劑的研發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)控提供參考。