李藝文，唐志書*，張珍*，梁濤，宋忠興，王昌利，，馬虎強(qiáng)，王宇鵬（.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育）/陜西中藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，陜西 咸陽(yáng) 708；.陜西海天制藥有限公司，陜西 咸陽(yáng) 7046；.內(nèi)蒙古海天制藥有限公司，內(nèi)蒙古 通遼 08000）

慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease，CKD）是指由于各種原因引起的慢性腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙，包括各種原發(fā)的、繼發(fā)的腎小球腎炎、腎小管損傷和腎血管的病變等，其特點(diǎn)是發(fā)病率高、伴發(fā)的心血管患病率高、病死率高[1]。腎臟纖維化是CKD的主要病理基礎(chǔ)。目前研究認(rèn)為腎臟纖維化不可逆，臨床上用于治療的藥物主要分為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑兩大類，但是治療效果不佳，且伴隨一系列的不良反應(yīng)[2]。因此，尋找有效減緩腎臟纖維化的藥物已成為CKD治療的關(guān)鍵。

沙棘總黃酮（total flavonoids of hippophae，TFH）是從沙棘（Hippophae rhamnoidesLinn.）中提取的有效活性成分，主要含有槲皮素、異鼠李素及山柰酚等[3]。近年多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可改善單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstructive，UUO）大鼠腎功能，具有抗UUO大鼠腎臟纖維化的作用[4-6]；異鼠李素具有抗肝臟纖維化和肺纖維化的作用[7-9]；因此，推測(cè)沙棘總黃酮可能具有抗腎臟纖維化的作用。本研究擬建立UUO大鼠腎臟纖維化模型，研究沙棘總黃酮對(duì)UUO大鼠腎臟纖維化的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±10）g [成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2020-030]。

1.2 試藥

沙棘總黃酮（陜西海天制藥有限公司，以異鼠李素為標(biāo)準(zhǔn)，沙棘總黃酮含量為30%）；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、鈣黏附蛋白-E（E-cadherin）、細(xì)胞間隙連接蛋白（Cx43）（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；纖維連接蛋白（Fibronectin）（美國(guó)Santa Cruz biotechnology公司）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（中國(guó)Proteintech公司）；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗、RIPA（強(qiáng)）裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司）；內(nèi)源性H2S檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；PVDF膜（美國(guó)Merck Millipore公司）。

1.3 儀器

LD5-2A型低速離心機(jī)（北京雷博爾）；DSZ 2000X型倒置顯微鏡（重慶澳浦）；Thermo Multiskan GO多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo）；Western blot曝光儀器ChemiDoc XRS＋凝膠成像1708265（美國(guó)Bio-bad）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

雄性SD大鼠50只，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（35 mg·kg－1）麻醉大鼠，腹部左側(cè)切口，雙結(jié)扎左側(cè)輸尿管的近端中上三分之一處，然后在兩個(gè)結(jié)扎處之間將輸尿管剪斷，逐層縫合腹腔。假手術(shù)組僅游離，不結(jié)扎不剪斷[10]。將50只大鼠隨機(jī)分為5組（n＝10）：假手術(shù)組、模型組、依那普利組（10 mg·kg－1）、沙棘總黃酮低劑量組（175 mg·kg－1）、沙棘總黃酮高劑量組（350 mg·kg－1）。給藥組使用蒸餾水配制并灌胃給藥，假手術(shù)組及模型組給予等量蒸餾水灌胃。術(shù)前給藥3 d，術(shù)后連續(xù)給藥2周，每日一次。

2.2 標(biāo)本采集

手術(shù)2周后，用1%戊巴比妥鈉（35 mg·kg－1）麻醉，腹主動(dòng)脈采血，收集血清，將其保存于－80℃。取左側(cè)腎臟組織，除去腎包膜，生理鹽水沖洗，從中間縱切，1/2固定于4%多聚甲醛，1/2保存于－80℃進(jìn)行后續(xù)蛋白表達(dá)分析。

2.3 腎組織形態(tài)學(xué)觀察

2.3.1 測(cè)定腎臟重量、皮質(zhì)厚度及長(zhǎng)度 將腎臟取出后，生理鹽水沖洗，稱重。將固定后的1/2腎臟取出，觀察UUO誘導(dǎo)大鼠腎臟大小和腎盂擴(kuò)張情況，腎臟縱切面測(cè)量腎皮質(zhì)厚度和腎臟長(zhǎng)度。

2.3.2 Masson染色 腎臟組織用4%多聚甲醛緩沖液固定24 h，石蠟包埋、切片，進(jìn)行Masson染色。觀察腎小管擴(kuò)張、管型形成和間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，并采用Image J軟件對(duì)膠原纖維的藍(lán)色陽(yáng)性染色進(jìn)行定量分析。

2.3.3 免疫組化分析 石蠟切片脫蠟、水化后，置于枸櫞酸緩沖液中煮沸15 min；置3% H2O2中滅活，3%BSA 室溫封閉1 h；孵育Ⅰ抗：α-SMAⅠ抗的稀釋比例為1∶1000，Cx43 Ⅰ抗的稀釋比例為1∶100，F(xiàn)ibronectinⅠ抗的稀釋比例為1∶500，置于4℃冰箱過(guò)夜；α-SMA、Cx43和Fibronectin Ⅱ抗的稀釋比例均為1∶200，室溫孵育Ⅱ抗1 h；按DAB顯色試劑盒說(shuō)明配制顯色液，滴加后鏡下控制反應(yīng)時(shí)間；洗滌、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色或深棕色染色，采用Image J軟件分析對(duì)陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行定量分析。

2.4 腎臟組織纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)量檢測(cè)

取各組大鼠腎臟組織研碎，加入裂解液4℃低溫勻漿。將裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中4℃ 12 000 r·min－1離心收集裂解液上清，采用BCA試劑盒蛋白定量，取60 μg蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃過(guò)夜，PBST洗膜，加入二抗，孵育1 h，洗膜后用ECL發(fā)光試劑顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。采用Image J分析軟件，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，定量計(jì)算各組樣品間蛋白相對(duì)表達(dá)量。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 腎臟組織和血清中H2S檢測(cè)

采用內(nèi)源性H2S檢測(cè)試劑盒檢測(cè)腎臟組織和血清中H2S水平，按照試劑盒說(shuō)明操作，內(nèi)源性H2S與醋酸鋅、N，N-二甲基對(duì)苯二胺和硫酸鐵銨等反應(yīng)生成亞甲基藍(lán)，顯色，使用酶標(biāo)儀在665 nm處測(cè)定吸光度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 沙棘總黃酮改善UUO大鼠腎臟組織形態(tài)

造模第14日后，肉眼可見(jiàn)UUO導(dǎo)致大鼠腎臟腎盂擴(kuò)張、皮質(zhì)變薄，經(jīng)測(cè)量發(fā)現(xiàn)UUO引起腎臟重量增加、皮質(zhì)變薄、長(zhǎng)度增大。給予沙棘總黃酮干預(yù)，以上各項(xiàng)腎臟形態(tài)指標(biāo)均顯著改善（見(jiàn)圖1）。

圖1 沙棘總黃酮對(duì)UUO大鼠腎臟形態(tài)的影響（n＝4）Fig 1 Effect of TFH on the renal morphology in UUO rat（n＝4）

3.2 沙棘總黃酮減少UUO大鼠腎臟纖維化模型中膠原纖維的沉積

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腎臟的膠原纖維大量沉積，纖維化面積顯著增大（P＜0.01），表明造模成功。與模型組比較，沙棘總黃酮高、低劑量組大鼠的腎臟膠原纖維化面積顯著減小（P＜0.05），表明沙棘總黃酮可有效減緩腎臟膠原纖維的形成（見(jiàn)圖2）。

圖2 沙棘總黃酮對(duì)UUO大鼠腎臟組織膠原纖維沉積的影響（n＝4，200×）Fig 2 Effect of TFH on the accumulation of collagen fibrils in UUO rat（n＝4，200×）

3.3 沙棘總黃酮抑制UUO大鼠腎臟組織Fibronectin的表達(dá)

免疫組化結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腎臟組織中Fibronectin表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，沙棘總黃酮高、低劑量組Fibronectin表達(dá)顯著降低（見(jiàn)圖3A、B，P＜0.05）。Western blot結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組Fibronectin蛋白表達(dá)顯著升高（見(jiàn)圖3C，P＜0.01）；與模型組比較，沙棘總黃酮高、低劑量Fibronectin蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（見(jiàn)圖3C，P＜0.05）。表明沙棘總黃酮可降低細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的沉積，有效改善UUO大鼠腎臟纖維化。

圖3 沙棘總黃酮對(duì)UUO大鼠腎臟組織ECM的影響（200×；A＆B.n＝4；C.n＝3）Fig 3 Effect of TFH on the expression of ECM in UUO rat（200×；A＆B.n＝4；C.n＝3）

3.4 沙棘總黃酮抑制UUO大鼠腎臟組織上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）形成

免疫組化結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組腎臟組織中α-SMA顯著升高（P＜0.01）；給予沙棘總黃酮高、低劑量組干預(yù)后，α-SMA顯著降低（P＜0.01）。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組α-SMA蛋白表達(dá)顯著升高，E-cadherin顯著降低（P＜0.05）；給予沙棘總黃酮高、低劑量干預(yù)后，α-SMA蛋白表達(dá)下調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。表明沙棘總黃酮能有效抑制UUO大鼠腎臟組織EMT的形成（見(jiàn)圖4）。

圖4 沙棘總黃酮對(duì)大鼠UUO腎臟組織EMT形成的影響（200×；A＆B.n＝4；C＆D.n＝3）Fig 4 Effects of TFH on EMT formation in UUO rat（200×；A＆B.n＝4；C＆D.n＝3）

3.5 沙棘總黃酮抑制UUO大鼠腎臟組織TGF-β1蛋白表達(dá)

結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組TGF-β1水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，沙棘總黃酮高、低劑量組TGF-β1水平均顯著下降（見(jiàn)圖5，P＜0.05）。

圖5 沙棘總黃酮對(duì)大鼠UUO模型誘導(dǎo)腎臟組織中TGF-β1水平的影響（n＝3）Fig 5 Effect of TFH on the TGF-β1 level in kidney tissue of UUO rat（n＝3）

3.6 沙棘總黃酮上調(diào)UUO大鼠腎臟組織和血清中H2S水平

與假手術(shù)組相比，模型組腎臟組織和血清中H2S水平顯著下降（P＜0.01），而沙棘總黃酮干預(yù)后，H2S水平均顯著升高（見(jiàn)圖6，P＜0.01），表明沙棘總黃酮可上調(diào)UUO大鼠內(nèi)源性H2S水平。

圖6 沙棘總黃酮對(duì)大鼠UUO模型誘導(dǎo)腎臟組織和血清中H2S水平的影響（±s，n＝7）Fig 6 Effect of TFH on the kidney tissue and plasma H2S level in UUO rat（±s，n＝7）

3.7 沙棘總黃酮抑制UUO大鼠腎臟組織Cx43的表達(dá)

免疫組化結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腎臟組織中Cx43表達(dá)顯著升高（P＜0.01），而沙棘總黃酮高劑量組的Cx43表達(dá)與模型組比較顯著降低（見(jiàn)圖7，P＜0.05）。

圖7 沙棘總黃酮對(duì)大鼠UUO模型腎臟組織中Cx43的影響（200×，n＝4）Fig 7 Effect of TFH on the expression of Cx43 in UUO rat（200×，n＝4）

4 討論

本研究建立經(jīng)典的UUO大鼠腎臟纖維化模型，研究沙棘總黃酮對(duì)腎臟纖維化的影響及其機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)沙棘總黃酮改善UUO大鼠腎臟形態(tài)及皮質(zhì)厚度，抑制UUO大鼠腎臟組織中膠原纖維形成和Fibronectin的表達(dá)，表明沙棘總黃酮能減少ECM的沉積；減少α-SMA的表達(dá)，增加E-cadherin的表達(dá)，表明沙棘總黃酮能抑制EMT的形成；其中沙棘總黃酮高劑量組效果強(qiáng)于沙棘總黃酮低劑量組。提示沙棘總黃酮具有抗腎臟纖維化的作用。

TGF-β1在纖維化的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。TGF-β1主要介導(dǎo)TGF-β1/Smads和非Smad信號(hào)通路的激活，引起EMT的形成和ECM的進(jìn)行性聚集，而ECM的降解減少，會(huì)導(dǎo)致腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化，最終使腎功能喪失[11]。本研究發(fā)現(xiàn)沙棘總黃酮可顯著抑制UUO大鼠腎臟組織TGF-β1的表達(dá)，但是沙棘總黃酮的抗腎臟纖維化作用是否通過(guò)TGF-β1/Smads和非Smad信號(hào)通路還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

眾所周知，H2S是繼一氧化氮、一氧化碳后被發(fā)現(xiàn)的第三種人體內(nèi)重要的氣體信號(hào)分子。臨床研究表明CKD患者血清中H2S水平下降[12]，多項(xiàng)研究表明UUO大鼠的H2S水平相比于假手術(shù)組顯著降低，給予NaHS供體干預(yù)，可顯著改善其腎臟纖維化[10]。本研究發(fā)現(xiàn)沙棘總黃酮可上調(diào)UUO大鼠腎臟組織和血清H2S水平，但沙棘總黃酮是否通過(guò)影響產(chǎn)生H2S相關(guān)酶CBS、CSE和3-MST的表達(dá)以及沙棘總黃酮如何通過(guò)上調(diào)內(nèi)源性H2S改善UUO大鼠腎臟纖維化，有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞間隙連接或稱縫隙連接，在腎臟組織中有著廣泛的分布，在維持腎臟組織結(jié)構(gòu)和功能中起重要的作用[13]。Cx43蛋白是主要的間隙連接組成蛋白[14]。近年來(lái)有研究證實(shí)Cx43在高血壓性腎病和梗阻性腎病的早期表達(dá)增加，抑制Cx43表達(dá)降低了炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和腎纖維化，并明顯改善了腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，Cx43被認(rèn)為是治療CKD的新靶點(diǎn)[14，15-17]。本研究中發(fā)現(xiàn)沙棘總黃酮高劑量可顯著抑制Cx43的表達(dá)，表明其抗腎臟纖維化作用很可能是通過(guò)Cx43發(fā)揮的。

綜上所述，沙棘總黃酮可顯著改善UUO大鼠腎臟纖維化，抑制EMT形成和降低ECM沉積，其作用機(jī)制可能與降低TGF-β1表達(dá)，升高內(nèi)源性H2S水平和抑制Cx43表達(dá)有關(guān)。沙棘總黃酮有可能發(fā)展為潛在的抗腎臟纖維化的治療藥物。