龐琳諾，倪健，蔡夢(mèng)如，馬葆睿，張志勤，白杰，張萌，王曉玲*，曲昌海*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 0488；.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院，北京 00045）

知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖，味苦、甘，性寒，歸肺、胃、腎經(jīng)，有清熱瀉火、滋陰潤(rùn)燥之功[1-2]。新芒果苷、芒果苷、異芒果苷為知母藥材中具有代表性的雙苯吡酮類(lèi)成分[3]，結(jié)構(gòu)如圖1所示?，F(xiàn)代藥理研究表明，此類(lèi)成分具有抗炎、降血壓、抗糖尿病等多種藥理作用[4-6]，知母飲片鹽炙后芒果苷含量顯著升高[7]、新芒果苷和異芒果苷含量降低[8]，且鹽炙后能夠促進(jìn)新芒果苷在大鼠體內(nèi)的吸收[9]。

圖1 芒果苷、異芒果苷及新芒果苷化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structures of mangiferin，isomangiferin，and neomangiferin

復(fù)幼方為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，鹽知母為方中君藥，全方由鹽知母、生地黃、玄參、醋鱉甲、關(guān)黃柏等11味中藥組合而成，鹽知母具有滋補(bǔ)肝腎、清熱瀉火的作用，用于治療女童性早熟療效確切[10]。原劑型為合劑，攜帶、貯存不便且口感不佳，本課題組擬將復(fù)幼方開(kāi)發(fā)成質(zhì)量穩(wěn)定、療效確切的顆粒劑，以君藥鹽知母中的芒果苷作為質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分之一，在復(fù)方工藝研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，芒果苷在提取和干燥過(guò)程中，含量損失較大，80℃下減壓干燥，芒果苷損失率約48%。而在同樣條件下對(duì)鹽知母進(jìn)行單獨(dú)提取，芒果苷的含量卻并未發(fā)生明顯變化。

作者在前期研究中還發(fā)現(xiàn)，在相同提取條件下，新芒果苷、芒果苷、異芒果苷在單體溶液及鹽知母水提液中穩(wěn)定性良好，在復(fù)幼方水提液中3種成分含量發(fā)生改變，由此猜測(cè)復(fù)幼方中的其他藥味會(huì)對(duì)這3種成分產(chǎn)生影響。目前關(guān)于此3種成分穩(wěn)定性的相關(guān)報(bào)道較少，僅有研究表明，新芒果苷、芒果苷受熱后化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，轉(zhuǎn)化為其他成分[11]。本研究建立高效液相色譜分析方法，以3種成分作為指標(biāo)，全面系統(tǒng)考察復(fù)幼方全方提取、不同配伍組合提取、鹽知母單獨(dú)提取過(guò)程中3種成分的變化情況，并對(duì)不同藥味配伍提取后水提液中3種成分的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，嘗試闡明影響復(fù)幼方中新芒果苷、芒果苷、異芒果苷提取率和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，并對(duì)復(fù)幼方提取中芒果苷不穩(wěn)定的原因進(jìn)行探討，以期為其他含知母藥材中藥復(fù)方的研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DZTW型電子調(diào)溫電熱套（北京中儀泓瑞科技發(fā)展有限公司）；JY5002型電子天平（精度：0.01 g，上海衡平儀器儀表廠(chǎng)）；MS105DU型電子分析天平（精度：0.01 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司）；FiveEasy Plus型pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SB-5200DTD超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LC-20AT型高效液相色譜儀（SPD-20A DAD檢測(cè)器，LC Solution色譜工作站，日本島津）。

1.2 試藥

鹽知母、生地黃、玄參、鱉甲、關(guān)黃柏、地骨皮、牡丹皮等藥材均購(gòu)于北京本草方源藥物有限公司，經(jīng)北京本草方源藥物有限公司研究助理王穎鑒定。新芒果苷對(duì)照品（批號(hào)：C13S8G43633）、芒果苷對(duì)照品（批號(hào)：P04M9F60454）、異芒果苷對(duì)照品（批號(hào)：P10D10S105531）（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；娃哈哈純凈水，乙腈、甲醇為色譜純（Fisher公司），實(shí)驗(yàn)用水為高純水，冰乙酸分析純（北京化工廠(chǎng)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 3種成分含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件 Agilent zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%醋酸溶液（9∶91，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)：258 nm，流速：1.0 mL·min－1，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取異芒果苷對(duì)照品1.39 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得異芒果苷母液。精密吸取1 mL異芒果苷母液并分別精密稱(chēng)取新芒果苷2.53 mg、芒果苷1.25 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取復(fù)幼方浸膏粉0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱(chēng)定重量，超聲30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)即得。

2.1.4 專(zhuān)屬性考察 制備不含鹽知母的陰性樣品溶液，取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液按“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2，表明陰性樣品無(wú)干擾，方法專(zhuān)屬性良好。

圖2 混合對(duì)照品（A）、供試品（B）及陰性樣品（C）的HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of mixed reference substances（A），sample（B）and negative sample（C）

2.1.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下1、2、3、4、5、6、7 mL混合對(duì)照品溶液，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣檢測(cè)，以質(zhì)量濃度（mg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。新芒果苷、芒果苷和異芒果苷的回歸方程分別為Y＝1.32×105X＋1.14×105（r＝0.9998）、Y＝1.05×105X＋8.44×104（r＝0.9998）、Y＝9.31×103X＋7.96×103（r＝0.9991），表明新芒果苷進(jìn)樣量在49.59～347.12 μg、芒果苷進(jìn)樣量在24.50～171.68 μg、異芒果苷進(jìn)樣量在2.72～19.07 μg與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取同一份對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。新芒果苷、芒果苷、異芒果苷峰面積RSD值分別為0.026%、0.057%、0.059%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品中新芒果苷、芒果苷、異芒果苷含量分別為0.95、0.38、0.058 mg·g－1，RSD值分別為0.78%、0.74%、2.8%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取浸膏粉約0.25 g于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，共9份，分為3組。每組分別加入適量對(duì)照品母液使加入量與供試品中成分含量之比約為1.2∶1、1∶1和0.8∶1，進(jìn)樣測(cè)定各樣品中新芒果苷、芒果苷、異芒果苷的含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 新芒果苷、芒果苷及異芒果苷的加樣回收率(n＝3)Tab 1 Recovery of neomangiferin，mangiferin，and isomangiferin (n＝3)

2.2 藥味配伍對(duì)3種成分提取率的影響

為考察方中各藥味在提取過(guò)程中對(duì)鹽知母中3種成分提取率的影響情況，將方中10味藥材分別與鹽知母配伍，按處方比例及優(yōu)選工藝進(jìn)行分別提取，并在相同條件下單獨(dú)提取鹽知母和復(fù)幼方，將上述水提液放冷后定容至等體積，平行操作兩份。測(cè)定不同配伍水提液中新芒果苷、芒果苷、異芒果苷的峰面積，計(jì)算提取率，考察配伍對(duì)3種成分提取率的影響（本次實(shí)驗(yàn)用鹽知母中新芒果苷的平均含量為11.06 mg·g－1，芒果苷的平均含量為10.25 mg·g－1，異芒果苷的平均含量為0.94 mg·g－1），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同藥味與鹽知母配伍提取后3種成分的提取率(%，n＝2)Tab 2 Extraction rate of 3 components of different compatibility medicinal with salt processed Rhizoma Anemarrhenae (%，n＝2)

提取率（%）＝[水提液中成分的濃度（mg·mL－1）×水提液體積（mL）]/[鹽知母中該成分的平均含量（mg·g－1）×處方中鹽知母用量（g）]×100%

結(jié)果表明復(fù)幼方中不同藥味配伍會(huì)影響新芒果苷、芒果苷和異芒果苷的提取率，復(fù)幼方合提后新芒果苷、異芒果苷提取率高于鹽知母單獨(dú)提取，芒果苷提取率低于鹽知母單獨(dú)提取，3種成分的總提取率大于鹽知母單獨(dú)提取。生地黃與鹽知母以處方比例合提對(duì)新芒果苷提取率影響最大。地骨皮與鹽知母以處方比例合提對(duì)芒果苷提取率影響最大。方中各藥味與鹽知母以處方比例配伍合提后異芒果苷溶出均增加，提取率均高于鹽知母單獨(dú)提取。生地黃與鹽知母以處方比例配伍合提后，3種成分的總提取率低于鹽知母單獨(dú)提取，方中其余藥味與鹽知母配伍合提后，3種成分的總提取率均大于鹽知母單獨(dú)提取。關(guān)黃柏、麥芽與鹽知母以處方比例配伍合提后，3種成分的總提取率大于復(fù)幼方整方合提，方中其余藥味與鹽知母配伍合提后，3種成分的總提取率均低于復(fù)幼方整方合提。

2.3 藥味配伍對(duì)3種成分穩(wěn)定性的影響

為進(jìn)一步考察藥味配伍對(duì)新芒果苷、芒果苷、異芒果苷穩(wěn)定性的影響，將方中各藥材分別與鹽知母配伍提取，并對(duì)復(fù)幼方進(jìn)行合提，水提液放冷后定容至等體積，平行操作兩份。測(cè)定不同配伍組合水提液在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24、48 h后新芒果苷、芒果苷、異芒果苷的含量，取平均值。按照下式計(jì)算與0 h測(cè)得含量相比，48 h內(nèi)各組水提液中的3種成分的含量，以百分比計(jì)。結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。含量（%）＝不同時(shí)間點(diǎn)各組樣品測(cè)得含量/0時(shí)各組樣品測(cè)得含量×100%。

圖3 不同水提液放置48 h時(shí)3種成分的含量（n＝2）Fig 3 Contents of the 3 components in different water extracts placed for 48 h（n＝2）

圖4 不同水提液放置48 h時(shí)3種成分的含量（n＝2）Fig 4 Contents of the 3 components in different water extracts placed for 48 h（n＝2）

結(jié)果表明復(fù)幼方水提液放置48 h后新芒果苷含量較穩(wěn)定，芒果苷穩(wěn)定性降低，含量下降15.96%，異芒果苷含量增加約23%。關(guān)黃柏-鹽知母組水提液中新芒果苷的含量下降約6%，地骨皮-鹽知母組水提液放置48 h后芒果苷、異芒果苷最不穩(wěn)定，下降約8%和10%。對(duì)不同組別配伍提取后3種成分的總含量進(jìn)行整體分析，夏枯草-鹽知母組和地骨皮-鹽知母組水提液中3種成分的總含量下降最明顯，分別為19.0%和20.3%。提示關(guān)黃柏、夏枯草、地骨皮可能對(duì)復(fù)幼方中新芒果苷、芒果苷、異芒果苷的穩(wěn)定性存在影響。

3 討論

3.1 新芒果苷、芒果苷、異芒果苷在復(fù)幼方提取過(guò)程中的穩(wěn)定性

知母作為清熱瀉火類(lèi)中藥在臨床應(yīng)用廣泛，在前期提取工藝研究中，不同溫度條件下，鹽知母中3種雙苯吡酮類(lèi)成分新芒果苷、芒果苷和異芒果苷在單體溶液及鹽知母水提液中穩(wěn)定性良好，而在復(fù)幼方提取過(guò)程中受溫度、加熱時(shí)間和放置時(shí)間的影響，在超過(guò)60℃的提取條件下，3種成分的含量隨加熱溫度的升高和受熱時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，提示復(fù)幼方在生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)該注意控制溫度和受熱時(shí)間，溫度不宜過(guò)高，不宜長(zhǎng)時(shí)間加熱且提取后不宜長(zhǎng)時(shí)間放置。有文獻(xiàn)報(bào)道芒果苷在中性和微酸性條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，堿性條件下分子結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化[12]，測(cè)定3種雙苯吡酮類(lèi)成分對(duì)照溶液、鹽知母飲片水提液、復(fù)幼方水提液的pH，結(jié)果顯示3種雙苯吡酮類(lèi)成分對(duì)照品溶液pH基本一致，鹽知母水提液和復(fù)幼方水提液pH接近，分別為4.88和5.12，因此排除復(fù)幼方水提液整體pH的影響，猜測(cè)為復(fù)方中藥味配伍的作用。

3.2 復(fù)幼方藥味配伍對(duì)新芒果苷、芒果苷、異芒果苷提取率的影響

中藥復(fù)方配伍是以中醫(yī)藥學(xué)理論為指導(dǎo)進(jìn)行臨床用藥的主要形式，藥味中的有效成分是其發(fā)揮臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過(guò)現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段探究中藥復(fù)方中有效成分的變化，對(duì)中藥復(fù)方的配伍和合理應(yīng)用具有指導(dǎo)意義[13]。中藥復(fù)方煎煮過(guò)程中，由于藥味配伍的不同，溶液中的復(fù)雜成分可能由于形成締合物、復(fù)合物等而使提取率發(fā)生變化。在本研究中，將復(fù)幼方中各味藥材與鹽知母按處方比例一一配伍后提取，結(jié)果顯示不同的藥味配伍會(huì)影響新芒果苷、芒果苷和異芒果苷的提取率，與方中其他配伍組合相比，生地黃、地骨皮與鹽知母以處方比例配伍提取后，3種成分提取率均偏低。有文獻(xiàn)報(bào)道[14]，知母與堿基類(lèi)中藥（地骨皮、桑白皮）、酚酸類(lèi)中藥（橘紅、丹參）配伍合提，芒果苷提取率顯著降低，生物堿類(lèi)成分、氨基酸類(lèi)成分對(duì)芒果苷提取率均有影響，這一報(bào)道與本文研究結(jié)果相符。另有研究表明，鹽知母與關(guān)黃柏按1∶1比例配伍時(shí)，水提液中新芒果苷含量高于知母單煎，芒果苷含量降低[15]。本研究中鹽知母與關(guān)黃柏的處方比例為3∶1，3種雙苯吡酮類(lèi)成分的提取率均大于鹽知母單獨(dú)提取，且異芒果苷＞芒果苷＞新芒果苷，說(shuō)明不同的配伍比例同樣會(huì)對(duì)有效成分提取率造成不同的影響。

3.3 復(fù)幼方藥味配伍對(duì)新芒果苷、芒果苷、異芒果苷穩(wěn)定性的影響

為進(jìn)一步考察藥味配伍對(duì)3種成分穩(wěn)定性的影響，將方中10味藥與鹽知母按處方比例配伍提取，并對(duì)復(fù)幼方進(jìn)行全方提取，測(cè)定不同配伍組合水提液和復(fù)幼方水提液在48 h內(nèi)3種成分的含量，結(jié)果表明地骨皮、夏枯草與鹽知母配伍使芒果苷、異芒果苷穩(wěn)定性降低，新芒果苷在復(fù)幼方水提液中較穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)樣品自然發(fā)霉后產(chǎn)生的菌株能夠產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，使新芒果苷中β-葡萄糖鍵斷裂轉(zhuǎn)化為芒果苷[16]，復(fù)幼方水提液于室溫下放置易發(fā)霉產(chǎn)生沉淀，48 h后芒果苷與異芒果苷含量變化呈相反趨勢(shì)，猜測(cè)可能存在成分之間的轉(zhuǎn)化，應(yīng)進(jìn)一步深入研究。

3.4 小結(jié)

本研究建立的新芒果苷、芒果苷、異芒果苷HPLC含量測(cè)定方法穩(wěn)定可行，通過(guò)研究復(fù)幼方中藥味配伍對(duì)3種成分提取率和穩(wěn)定性的作用，闡明不同的藥味配伍及配伍比例是影響復(fù)幼方中有效成分含量的關(guān)鍵因素。中藥之間復(fù)雜的配伍作用不僅會(huì)對(duì)提取率造成影響，還會(huì)影響復(fù)方中有效成分在溶液中的穩(wěn)定性?？筛鶕?jù)發(fā)揮藥效的有效成分不同，對(duì)藥味配伍及配伍比例進(jìn)行科學(xué)地調(diào)整，使復(fù)方發(fā)揮更好的功效。