王娟，楊旭，趙越勤，丁驍，夏海濱，趙逾涵*（1.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 基因治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710119；.中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所 植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 65001）

乳腺癌（breast cancer）是女性中常見(jiàn)的惡性腫瘤，是女性癌癥死亡的第二大主要原因[1]。目前乳腺癌的治療方法主要包括顯微外科切除術(shù)，放射療法和化學(xué)療法[2]。在乳腺癌中，三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）通常是指缺乏雌激素受體（estrogen receptor，ER），孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）表達(dá)的乳腺癌，占所有乳腺癌的15%～20%，更容易轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)，惡性程度更高，容易產(chǎn)生化學(xué)耐藥性，因此目前TNBC的標(biāo)準(zhǔn)治療方法主要是化學(xué)療法和放射療法。但是，盡管經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化治療，患者的平均總生存期僅為12～18個(gè)月[3-4]。因此尋找更多對(duì)TNBC有效的藥物一直是世界范圍內(nèi)學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

Tagitinin F（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）屬于倍半萜內(nèi)酯類天然小分子化合物，在菊科植物腫柄菊中大量存在[5]，其具有抗炎、抗微生物、抗寄生蟲(chóng)、抗腫瘤[5-6]等活性，其類似物tagitinin C能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞caspase依賴性凋亡，甚至導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自噬死亡，而且tagitinin C衍生物對(duì)治療癌癥具有巨大潛力[7]。但是對(duì)tagitinin F的抗腫瘤活性的具體作用機(jī)制研究較少，故本研究擬對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。

圖1 Tagitinin F的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structure of tagitinin F

1 材料

1.1 細(xì)胞來(lái)源

人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所活性篩選中心孔清華老師惠贈(zèng)。

1.2 儀器

成像型微孔板檢測(cè)儀（BioTek Cytationl），全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（tanon，5200），流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur Flow Cytometer），CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific），生物顯微鏡（Olympus，CKX31），血球計(jì)數(shù)板（上海市求精生化試劑儀器有限公司），電泳儀（Bio-Rad），冷凍離心機(jī)（Eppendorf，5415R）等。

1.3 試藥

Tagitinin F（云南西力生物技術(shù)有限公司，純度：98%，貨號(hào)：BBP00166），紫杉醇（Meilunbio，貨號(hào)：MB1178），衣霉素（Abcam，貨號(hào)：ab120296），碘化丙啶（PI，BioFroxx公司，貨號(hào)：1246），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，BioFroxx公司，貨號(hào)：3580），Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（四正柏生物，貨號(hào)：FXP018），胰蛋白酶（Biological Industries，貨號(hào)：03-050-1A），100×青鏈霉素混合液（Biosharp，青霉素10 000 U·mL－1、鏈霉素10 000 μg·mL－1，貨號(hào)：P1400），RNase A溶液（Solarbio）無(wú)水乙醇，Bip、PDI、Calnexin、Ero1-Lα、IRE1α抗體（Cell Signaling Technology，貨號(hào)：9956T），β-actin（Cell Signaling Technology，貨號(hào)：3700S）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS（胎牛血清），1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測(cè)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的用DMSO配制的tagitinin F（1.25、2.5、5、10、20 μmol·L－1）或TAXOL（0.05 μmol·L－1）繼續(xù)培養(yǎng)72 h，棄上清液，每孔加入100 μL的MTT溶液（1 mg·mL－1），孵育4 h，每孔加入100 μL DMSO，用成像型微孔板檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.3 Tagitinin F對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響的觀察

將細(xì)胞消化后接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的tagitinin F（5、10、20 μmol·L－1），設(shè)DMSO（0.1%）對(duì)照組，隨后將6孔板放置于Incucyte S3自帶培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每隔12 h拍照記錄細(xì)胞的形態(tài)。

2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于12孔板中。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的tagitinin F（1、2 μmol·L－1），紫杉醇（0.02 μmol·L－1）以及0.1%的DMSO處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)12 d，棄去培養(yǎng)基，每孔加入500 μL考馬斯亮藍(lán)R250（2.5 mg·mL－1）染色2 h，棄去染色液，PBS清洗3遍，拍照。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

將細(xì)胞消化后接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的tagitinin F（5、10 μmol·L－1）、紫杉醇（0.05 μmol·L－1）以及0.1%的DMSO處理24 h。收集細(xì)胞，加入70%乙醇在－20℃過(guò)夜固定。加入2.5 μL RNase A（10 mg·mL－1），使其終質(zhì)量濃度為50 μg·mL－1，37℃孵育30 min，再加入25 μL PI在室溫下孵育30 min后過(guò)濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞消化后接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加 入20 μmol·L－1的tagitinin F以 及0.1%的DMSO分別處理不同時(shí)間（24、48、72 h），收集細(xì)胞，按凋亡試劑盒說(shuō)明書分別加入試劑，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.7 DCFH-DA探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧變化

將細(xì)胞消化后接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的tagitinin F（5、10、20 μmol·L－1）、H2O2（2 mmol·L－1）以及0.1%的DMSO處理12 h，棄培養(yǎng)基，加入無(wú)血清培養(yǎng)基配制的DCFH-DA（20 μmol·L－1），室溫孵育15 min，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，拍照，收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.8 Western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)

將細(xì)胞消化后接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入5 μmol·L－1的tagitinin F、2 μmol·L－1的衣霉素以及0.1%DMSO分別處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞制備蛋白樣品，10%聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST洗3次，加入二抗室溫孵育1 h，PBST洗3次。加入ECL化學(xué)發(fā)光液后放入全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中曝光。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，用Graph-Pad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 Tagitinin F對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響

如圖2所示，將DMSO組的細(xì)胞存活率定義為100%，與DMSO組相比，tagitinin F不同濃度處理組細(xì)胞存活率均降低（P＜0.05，P＜0.001），說(shuō)明tagitinin F對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的活力有明顯的抑制作用，IC50為（5.07±0.19）μmol·L－1。

圖2 Tagitinin F對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的抑制作用Fig 2 Inhibit viability on MDA-MB-231 cells of tagitinin F

3.2 Tagitinin F對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖3所示，對(duì)照組DMSO處理的細(xì)胞貼壁良好，連接緊密，細(xì)胞呈梭形且邊緣清晰，間質(zhì)飽滿。而tagitinin F處理后，隨著藥物濃度以及處理時(shí)間的增加，細(xì)胞貼壁能力變?nèi)酰w積變小，細(xì)胞之間的間隙逐漸增大，細(xì)胞固縮變圓，漂浮細(xì)胞增多，失去正常細(xì)胞的形態(tài)。說(shuō)明tagitinin F能夠改變細(xì)胞形態(tài)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖3 Tagitinin F對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)的影響Fig 3 Effect of tagitinin F on the morphology of MDA-MB-231 cells

3.3 Tagitinin F對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞體外克隆形成能力的影響

如圖4A所示，與DMSO組相比，不同濃度的tagitinin F（1.2 μmol·L－1）以及紫杉醇（0.02 μmol·L－1）作用于MDA-MB-231細(xì)胞12 d后，克隆球數(shù)量以及大小都明顯降低（見(jiàn)圖4B），說(shuō)明tagitinin F能夠濃度依賴性地抑制MDAMB-231細(xì)胞的體外克隆形成能力。

圖4 Tagitinin F對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞體外克隆形成能力的抑制作用Fig 4 Inhibition of tagitinin F on the colony formation of MDAMB-231 cells

3.4 Tagitinin F對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響

如圖5A所示，隨著tagitinin F處理濃度的增加，細(xì)胞的G0/G1期比例由43.2%下降到34.7%，S期比例由37.3%下降到6.01%，G2/M期比例由19.5%升高到59.2%。隨著處理濃度的增加，處于G2/M期的細(xì)胞也隨之增多，與DMSO組（19.68%）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖5B），說(shuō)明tagitinin F能夠濃度依賴性地將MDA-MB-231細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。

圖5 Tagitinin F對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞G2/M期的影響Fig 5 Effect of tagitinin F on cell cycle of MDA-MB-231 cells

3.5 Tagitinin F對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

如圖6A所示，隨著tagitinin F處理時(shí)間的增加，細(xì)胞凋亡率（早期凋亡＋晚期凋亡）增加，分別為7.53%、23.86%、57.2%，與DMSO組（4.81%）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖6B）。說(shuō)明tagitinin F誘導(dǎo)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡具有時(shí)間依賴性。

圖6 Tagitinin F對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響Fig 6 Effect of tagitinin F on the apoptosis of MDA-MB-231 cells

3.6 Tagitinin F對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響

如圖7所示，H2O2作為陽(yáng)性對(duì)照，與DMSO組相比，隨著Tagitinin F處理濃度的增加，成像型微孔板檢測(cè)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度（見(jiàn)圖7A）以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度（見(jiàn)圖7B）均逐漸增強(qiáng)；當(dāng)tagitinin F與活性氧清除劑NAC聯(lián)用處理后，熒光強(qiáng)度以及平均熒光強(qiáng)度均減弱。說(shuō)明tagitinin F能顯著引起細(xì)胞內(nèi)源性活性氧的積累。

圖7 Tagitinin F對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響Fig 7 Effect of tagitinin F on the endogenous ROS levels in MDA-MB-231 cells

3.7 Tagitinin F對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路蛋白的影響

如圖8所示，衣霉素作為陽(yáng)性對(duì)照化合物，當(dāng)tagitinin F處理濃度為5 μmol·L－1時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Bip、PDI、Calnexin、Ero1-Lα、IRE1α的表達(dá)量升高。說(shuō)明tagitinin F能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路，而當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)激活時(shí)，細(xì)胞程序性凋亡。

圖8 Tagitinin F（A）及衣霉素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（B）的影響Fig 8 Effect of tagitinin F（A）and tunicamycin（B）on endoplasmic reticulum stress

4 結(jié)論與討論

乳腺癌是女性中普遍存在的癌癥類型，并且是女性癌癥死亡的第二大主要原因[1]。而其中TNBC又非常容易轉(zhuǎn)移并產(chǎn)生化學(xué)耐藥性，所以其臨床預(yù)后通常較差[4]。由于抗腫瘤藥物的局限性，迫切需要從不同的方向?qū)ふ腋嗟幕熕幬铩奶烊恢参镏刑崛》蛛x得到的小分子化合物因其來(lái)源豐富，結(jié)構(gòu)種類繁多，具有更多的生物活性，毒副作用較小，是抗腫瘤新藥研發(fā)的重要來(lái)源。本文主要從細(xì)胞活力、細(xì)胞體外克隆形成能力，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡以及相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的影響來(lái)研究天然小分子化合物tagitinin F對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡作用及其機(jī)制。

本研究中，首先采用了MTT法檢測(cè)tagitinin F對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)與DMSO組相比，隨著tagitinin F濃度的增加，細(xì)胞活力也隨之下降；細(xì)胞形態(tài)表明，tagitinin F能夠改變細(xì)胞形態(tài)并殺死細(xì)胞；通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與DMSO組相比，隨著處理濃度的增加，克隆球的大小及數(shù)量減少；流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，與DMSO組相比，處理組的G2/M期細(xì)胞比例增加，細(xì)胞的早期凋亡以及晚期凋亡數(shù)目都增加，以上結(jié)果表明tagitinin F能顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，并且誘導(dǎo)其細(xì)胞周期阻滯和凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種多功能細(xì)胞器，參與許多包括新生的蛋白質(zhì)折疊和修飾，鈣儲(chǔ)存，液體生物合成和排毒等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。細(xì)胞在諸如缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏、藥物誘導(dǎo)的毒性，遺傳突變等各種細(xì)胞內(nèi)外的刺激下，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中蛋白質(zhì)的積累或者折疊錯(cuò)誤，此時(shí)，腫瘤細(xì)胞會(huì)觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來(lái)重建細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)并促進(jìn)細(xì)胞存活[8]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與活性氧的產(chǎn)生有關(guān)，而且一旦這種應(yīng)激狀態(tài)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號(hào)誘發(fā)細(xì)胞凋亡[9]。而在本文中，我們用 DCFH-DA探針檢測(cè)活性氧的變化，經(jīng)過(guò)tagitinin F處理后，細(xì)胞內(nèi)活性氧增加；Western blot結(jié)果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Bip、PDI、Calnexin、Ero1-Lα、IRE1α的表達(dá)量升高。說(shuō)明tagitinin F能夠通過(guò)使活性氧累積激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路發(fā)揮作用。

綜上所述，tagitinin F能夠抑制人TNBC MDA-MB-231細(xì)胞的增殖以及體外克隆形成能力，改變其正常的細(xì)胞形態(tài)；誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G2/M期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；同時(shí)使細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增加來(lái)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路發(fā)揮抑腫瘤作用。