王娟，楊旭，趙越勤，丁驍，夏海濱，趙逾涵*（1.陜西師范大學生命科學學院 基因治療重點實驗室，西安 710119；.中國科學院昆明植物研究所 植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，昆明 65001）

乳腺癌（breast cancer）是女性中常見的惡性腫瘤，是女性癌癥死亡的第二大主要原因[1]。目前乳腺癌的治療方法主要包括顯微外科切除術，放射療法和化學療法[2]。在乳腺癌中，三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）通常是指缺乏雌激素受體（estrogen receptor，ER），孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）表達的乳腺癌，占所有乳腺癌的15%～20%，更容易轉(zhuǎn)移和浸潤，惡性程度更高，容易產(chǎn)生化學耐藥性，因此目前TNBC的標準治療方法主要是化學療法和放射療法。但是，盡管經(jīng)過標準化治療，患者的平均總生存期僅為12～18個月[3-4]。因此尋找更多對TNBC有效的藥物一直是世界范圍內(nèi)學者研究的熱點。

Tagitinin F（結構式見圖1）屬于倍半萜內(nèi)酯類天然小分子化合物，在菊科植物腫柄菊中大量存在[5]，其具有抗炎、抗微生物、抗寄生蟲、抗腫瘤[5-6]等活性，其類似物tagitinin C能夠誘導腫瘤細胞caspase依賴性凋亡，甚至導致腫瘤細胞自噬死亡，而且tagitinin C衍生物對治療癌癥具有巨大潛力[7]。但是對tagitinin F的抗腫瘤活性的具體作用機制研究較少，故本研究擬對其機制進行探討。

圖1 Tagitinin F的化學結構Fig 1 Chemical structure of tagitinin F

1 材料

1.1 細胞來源

人乳腺癌MDA-MB-231細胞株由中國科學院昆明植物研究所活性篩選中心孔清華老師惠贈。

1.2 儀器

成像型微孔板檢測儀（BioTek Cytationl），全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（tanon，5200），流式細胞儀（BD FACSCalibur Flow Cytometer），CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific），生物顯微鏡（Olympus，CKX31），血球計數(shù)板（上海市求精生化試劑儀器有限公司），電泳儀（Bio-Rad），冷凍離心機（Eppendorf，5415R）等。

1.3 試藥

Tagitinin F（云南西力生物技術有限公司，純度：98%，貨號：BBP00166），紫杉醇（Meilunbio，貨號：MB1178），衣霉素（Abcam，貨號：ab120296），碘化丙啶（PI，BioFroxx公司，貨號：1246），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，BioFroxx公司，貨號：3580），Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（四正柏生物，貨號：FXP018），胰蛋白酶（Biological Industries，貨號：03-050-1A），100×青鏈霉素混合液（Biosharp，青霉素10 000 U·mL－1、鏈霉素10 000 μg·mL－1，貨號：P1400），RNase A溶液（Solarbio）無水乙醇，Bip、PDI、Calnexin、Ero1-Lα、IRE1α抗體（Cell Signaling Technology，貨號：9956T），β-actin（Cell Signaling Technology，貨號：3700S）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將細胞培養(yǎng)于含10% FBS（胎牛血清），1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，取處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗。

2.2 MTT法檢測人乳腺癌MDA-MB-231細胞活力

取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞接種于96孔板中。待細胞貼壁后，加入不同濃度的用DMSO配制的tagitinin F（1.25、2.5、5、10、20 μmol·L－1）或TAXOL（0.05 μmol·L－1）繼續(xù)培養(yǎng)72 h，棄上清液，每孔加入100 μL的MTT溶液（1 mg·mL－1），孵育4 h，每孔加入100 μL DMSO，用成像型微孔板檢測儀在490 nm波長下測量各孔的吸光度（OD）值，計算細胞存活率。

2.3 Tagitinin F對細胞形態(tài)影響的觀察

將細胞消化后接種于6孔板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度的tagitinin F（5、10、20 μmol·L－1），設DMSO（0.1%）對照組，隨后將6孔板放置于Incucyte S3自帶培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每隔12 h拍照記錄細胞的形態(tài)。

2.4 克隆形成實驗

取處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞接種于12孔板中。待細胞貼壁后，加入不同濃度的tagitinin F（1、2 μmol·L－1），紫杉醇（0.02 μmol·L－1）以及0.1%的DMSO處理細胞，繼續(xù)培養(yǎng)12 d，棄去培養(yǎng)基，每孔加入500 μL考馬斯亮藍R250（2.5 mg·mL－1）染色2 h，棄去染色液，PBS清洗3遍，拍照。

2.5 流式細胞儀檢測細胞周期

將細胞消化后接種于6孔板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度的tagitinin F（5、10 μmol·L－1）、紫杉醇（0.05 μmol·L－1）以及0.1%的DMSO處理24 h。收集細胞，加入70%乙醇在－20℃過夜固定。加入2.5 μL RNase A（10 mg·mL－1），使其終質(zhì)量濃度為50 μg·mL－1，37℃孵育30 min，再加入25 μL PI在室溫下孵育30 min后過濾，流式細胞儀檢測細胞周期。

2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

將細胞消化后接種于6孔板中，待細胞貼壁后，加 入20 μmol·L－1的tagitinin F以 及0.1%的DMSO分別處理不同時間（24、48、72 h），收集細胞，按凋亡試劑盒說明書分別加入試劑，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.7 DCFH-DA探針檢測細胞內(nèi)活性氧變化

將細胞消化后接種于6孔板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度的tagitinin F（5、10、20 μmol·L－1）、H2O2（2 mmol·L－1）以及0.1%的DMSO處理12 h，棄培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基配制的DCFH-DA（20 μmol·L－1），室溫孵育15 min，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，拍照，收集細胞用流式細胞儀檢測熒光強度。

2.8 Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白表達

將細胞消化后接種于6孔板中，待細胞貼壁后，加入5 μmol·L－1的tagitinin F、2 μmol·L－1的衣霉素以及0.1%DMSO分別處理細胞24 h，收集細胞制備蛋白樣品，10%聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，PBST洗3次，加入二抗室溫孵育1 h，PBST洗3次。加入ECL化學發(fā)光液后放入全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中曝光。

2.9 統(tǒng)計學分析

每組實驗獨立重復3次，用Graph-Pad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析處理，結果以均值±標準差表示，用t檢驗進行組間差異分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果與分析

3.1 Tagitinin F對人乳腺癌MDA-MB-231細胞活力的影響

如圖2所示，將DMSO組的細胞存活率定義為100%，與DMSO組相比，tagitinin F不同濃度處理組細胞存活率均降低（P＜0.05，P＜0.001），說明tagitinin F對MDA-MB-231細胞的活力有明顯的抑制作用，IC50為（5.07±0.19）μmol·L－1。

圖2 Tagitinin F對MDA-MB-231細胞活力的抑制作用Fig 2 Inhibit viability on MDA-MB-231 cells of tagitinin F

3.2 Tagitinin F對人乳腺癌MDA-MB-231細胞形態(tài)的影響

如圖3所示，對照組DMSO處理的細胞貼壁良好，連接緊密，細胞呈梭形且邊緣清晰，間質(zhì)飽滿。而tagitinin F處理后，隨著藥物濃度以及處理時間的增加，細胞貼壁能力變?nèi)?，體積變小，細胞之間的間隙逐漸增大，細胞固縮變圓，漂浮細胞增多，失去正常細胞的形態(tài)。說明tagitinin F能夠改變細胞形態(tài)并促進細胞凋亡。

圖3 Tagitinin F對MDA-MB-231細胞形態(tài)的影響Fig 3 Effect of tagitinin F on the morphology of MDA-MB-231 cells

3.3 Tagitinin F對人乳腺癌MDA-MB-231細胞體外克隆形成能力的影響

如圖4A所示，與DMSO組相比，不同濃度的tagitinin F（1.2 μmol·L－1）以及紫杉醇（0.02 μmol·L－1）作用于MDA-MB-231細胞12 d后，克隆球數(shù)量以及大小都明顯降低（見圖4B），說明tagitinin F能夠濃度依賴性地抑制MDAMB-231細胞的體外克隆形成能力。

圖4 Tagitinin F對MDA-MB-231細胞體外克隆形成能力的抑制作用Fig 4 Inhibition of tagitinin F on the colony formation of MDAMB-231 cells

3.4 Tagitinin F對人乳腺癌MDA-MB-231細胞周期的影響

如圖5A所示，隨著tagitinin F處理濃度的增加，細胞的G0/G1期比例由43.2%下降到34.7%，S期比例由37.3%下降到6.01%，G2/M期比例由19.5%升高到59.2%。隨著處理濃度的增加，處于G2/M期的細胞也隨之增多，與DMSO組（19.68%）相比，差異有統(tǒng)計學意義（見圖5B），說明tagitinin F能夠濃度依賴性地將MDA-MB-231細胞周期阻滯在G2/M期。

圖5 Tagitinin F對MDA-MB-231細胞G2/M期的影響Fig 5 Effect of tagitinin F on cell cycle of MDA-MB-231 cells

3.5 Tagitinin F對人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響

如圖6A所示，隨著tagitinin F處理時間的增加，細胞凋亡率（早期凋亡＋晚期凋亡）增加，分別為7.53%、23.86%、57.2%，與DMSO組（4.81%）相比，差異有統(tǒng)計學意義（見圖6B）。說明tagitinin F誘導人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡具有時間依賴性。

圖6 Tagitinin F對MDA-MB-231細胞凋亡的影響Fig 6 Effect of tagitinin F on the apoptosis of MDA-MB-231 cells

3.6 Tagitinin F對人乳腺癌MDA-MB-231細胞內(nèi)活性氧的影響

如圖7所示，H2O2作為陽性對照，與DMSO組相比，隨著Tagitinin F處理濃度的增加，成像型微孔板檢測儀檢測熒光強度（見圖7A）以及流式細胞儀檢測平均熒光強度（見圖7B）均逐漸增強；當tagitinin F與活性氧清除劑NAC聯(lián)用處理后，熒光強度以及平均熒光強度均減弱。說明tagitinin F能顯著引起細胞內(nèi)源性活性氧的積累。

圖7 Tagitinin F對MDA-MB-231細胞內(nèi)活性氧的影響Fig 7 Effect of tagitinin F on the endogenous ROS levels in MDA-MB-231 cells

3.7 Tagitinin F對人乳腺癌MDA-MB-231細胞相關內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路蛋白的影響

如圖8所示，衣霉素作為陽性對照化合物，當tagitinin F處理濃度為5 μmol·L－1時，隨著處理時間的增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白Bip、PDI、Calnexin、Ero1-Lα、IRE1α的表達量升高。說明tagitinin F能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路，而當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激持續(xù)激活時，細胞程序性凋亡。

圖8 Tagitinin F（A）及衣霉素對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（B）的影響Fig 8 Effect of tagitinin F（A）and tunicamycin（B）on endoplasmic reticulum stress

4 結論與討論

乳腺癌是女性中普遍存在的癌癥類型，并且是女性癌癥死亡的第二大主要原因[1]。而其中TNBC又非常容易轉(zhuǎn)移并產(chǎn)生化學耐藥性，所以其臨床預后通常較差[4]。由于抗腫瘤藥物的局限性，迫切需要從不同的方向?qū)ふ腋嗟幕熕幬?。從天然植物中提取分離得到的小分子化合物因其來源豐富，結構種類繁多，具有更多的生物活性，毒副作用較小，是抗腫瘤新藥研發(fā)的重要來源。本文主要從細胞活力、細胞體外克隆形成能力，誘導細胞周期阻滯和凋亡以及相關內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路的影響來研究天然小分子化合物tagitinin F對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、誘導凋亡作用及其機制。

本研究中，首先采用了MTT法檢測tagitinin F對人乳腺癌MDA-MB-231細胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)與DMSO組相比，隨著tagitinin F濃度的增加，細胞活力也隨之下降；細胞形態(tài)表明，tagitinin F能夠改變細胞形態(tài)并殺死細胞；通過克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，與DMSO組相比，隨著處理濃度的增加，克隆球的大小及數(shù)量減少；流式細胞儀檢測表明，與DMSO組相比，處理組的G2/M期細胞比例增加，細胞的早期凋亡以及晚期凋亡數(shù)目都增加，以上結果表明tagitinin F能顯著抑制MDA-MB-231細胞增殖，并且誘導其細胞周期阻滯和凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種多功能細胞器，參與許多包括新生的蛋白質(zhì)折疊和修飾，鈣儲存，液體生物合成和排毒等細胞生物學過程。細胞在諸如缺氧、營養(yǎng)缺乏、藥物誘導的毒性，遺傳突變等各種細胞內(nèi)外的刺激下，會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中蛋白質(zhì)的積累或者折疊錯誤，此時，腫瘤細胞會觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激來重建細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)并促進細胞存活[8]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與活性氧的產(chǎn)生有關，而且一旦這種應激狀態(tài)時間過長會激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號誘發(fā)細胞凋亡[9]。而在本文中，我們用 DCFH-DA探針檢測活性氧的變化，經(jīng)過tagitinin F處理后，細胞內(nèi)活性氧增加；Western blot結果顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白Bip、PDI、Calnexin、Ero1-Lα、IRE1α的表達量升高。說明tagitinin F能夠通過使活性氧累積激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述，tagitinin F能夠抑制人TNBC MDA-MB-231細胞的增殖以及體外克隆形成能力，改變其正常的細胞形態(tài)；誘導細胞周期阻滯在G2/M期并誘導細胞凋亡；同時使細胞內(nèi)活性氧水平增加來激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路發(fā)揮抑腫瘤作用。