郭 婕， 王 歡， 張 祁， 宋 科

(吉首大學(xué) 林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000)

竹柏(Nageianagi(Thunberg) Kuntze)是羅漢松科竹柏屬植物，多分布于長(zhǎng)江以南各省區(qū)[1]，是常見(jiàn)的園林綠化用樹種。竹柏中含有黃酮類、去甲基二萜雙內(nèi)酯類、揮發(fā)油等多種類型的活性化合物[2-5]，其中雙黃酮類化合物廣泛存在于松柏綱和銀杏綱等植物中，是由兩分子相同或不同類型的黃酮及其衍生物為單元聚合而成的二聚物，在抗腫瘤和治療心血管疾病等方面活性顯著[6-8]。穗花杉雙黃酮是一種在松柏綱植物中分布廣泛的雙黃酮類化合物，以卷柏科卷柏屬(Selaginella)植物中含量最高，具有抗炎、抗氧化和抑菌等生理功能，在緩解動(dòng)物應(yīng)激、減少炎癥損傷、提高動(dòng)物抵抗致病菌的能力等方面具有巨大潛力[9-10]，已在醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域有所應(yīng)用[11-12]，有望在畜禽生產(chǎn)中得以開發(fā)利用。目前，關(guān)于大孔樹脂分離純化藥用植物中總黃酮的工藝研究[13-15]屢見(jiàn)報(bào)道，但有關(guān)竹柏總黃酮和其中穗花杉雙黃酮的分離純化工藝卻鮮有報(bào)道。本課題組前期對(duì)竹柏枝葉提取物中的總黃酮進(jìn)行定量研究[16]，結(jié)果顯示竹柏枝葉粗提物中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)13.6%，且各部位有著顯著的差異，葉15.5%>莖10.4%>根8.5%>種子0.15%。在此基礎(chǔ)上，本研究比較了大孔吸附樹脂和聚酰胺(PLA)樹脂對(duì)竹柏總黃酮的吸附-解吸性能，確立AB-8大孔吸附樹脂對(duì)竹柏總黃酮的分離富集工藝，并進(jìn)一步對(duì)竹柏總黃酮進(jìn)行純化，從竹柏葉正丁醇萃取物中分離得到8個(gè)單體化合物，通過(guò)各種波譜手段鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，以期為竹柏提取物的組成成分和生物活性研究提供參考，為尋找雙黃酮的替代藥源提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、試劑及儀器

竹柏葉于2014年12月采自湖南省張家界國(guó)家森林公園，由吉首大學(xué)谷伏安副教授鑒定為竹柏(Nageianagi(Thunberg) Kuntze)，50 ℃烘干，粉碎后放入干燥器內(nèi)備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：Y10A6S1，純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：MUST-15012505，純度≥99.05%)，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；色譜甲醇試劑，天津康科德科技有限公司；乙醇(體積分?jǐn)?shù)75%)、石油醚、氯仿、丙酮、正丁醇、甲醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉和硝酸鋁等，均為市售分析純。

ZF-I型三用紫外(UV)分析儀，日本日立公司；Nicolet Is 10型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀，DSQ Ⅱ EI質(zhì)譜(MS)儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；Agilent 1260型高效液相色譜(HPLC)儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；Bruker AVANCE Ⅲ HD 500型核磁共振波譜(NMR)儀(TMS為內(nèi)標(biāo))。

各種規(guī)格的玻璃層析柱，北京欣維爾玻璃儀器有限公司；AB-8大孔吸附樹脂、D101大孔吸附樹脂、聚酰胺樹脂-1號(hào)(PLA-1)和聚酰胺樹脂-2號(hào)(PLA-2)，鄭州勤實(shí)科技有限公司；硅膠(150～180 μm、48～75 μm和38～48 μm)和GF254薄層層析硅膠，青島海洋化工廠；凝膠SephadexLH-20(40～70 μm)，瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司；反相填充材料YMC*GEL (ODS-A-HG，S-50 μm)，日本YMC株式會(huì)社。

1.2 竹柏葉總黃酮的提取

1.2.1竹柏葉提取物的制備 取干燥的竹柏葉5.0 kg，粉碎，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇超聲波提取5次，合并提取液，減壓濃縮得到浸膏。

1.2.2竹柏葉總黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定 稱取干燥的竹柏葉40 g，加入1 000 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇于60 ℃水浴中超聲波提取30 min，提取3次，合并提取液，減壓濃縮至干燥。然后用蒸餾水溶解、過(guò)濾后，配制成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，備用。精確稱取經(jīng)105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品21.2 mg，用適量的體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶解，加水定容至50 mL容量瓶中，配制成0.424 g/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品母液。分別量取0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0和1.2 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品母液于10 mL容量瓶中，加入2.0 mL無(wú)水甲醇，搖勻，各加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻后靜置6 min，再分別加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻后靜置6 min，再分別加入4 mL 1 mol/mL氫氧化鈉溶液，搖勻后靜置15 min，加水定容至刻度，搖勻后置于比色皿中，于506 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(C，g/L)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程：A=11.0C+0.024 8(R2=0.999 1)，線性范圍0.013～0.076 g/L[16]。

準(zhǔn)確量取一定量的樣品溶液，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算竹柏葉總黃酮的質(zhì)量濃度。

1.2.3穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定 精確稱取穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品2.1 mg，用5.0 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶解，定容至10 mL的容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.21 g/L穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品母液，過(guò)0.45 μm濾膜，備用。分別量取0.1、 0.2、 0.4、 0.8、 1.0、 2.0和4.0 mL穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品母液于10 mL的容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇定容至刻度線處，搖勻。采用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件為：色譜柱Kromasil C18柱(4.6×250 mm, 5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)335 nm，柱溫箱35 ℃，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相使用0.2%磷酸緩沖溶液(A)/甲醇(B)進(jìn)行梯度洗脫(0～15 min，40% A；15～30 min，15% A)，記錄標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積，繪制穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中穗花杉雙黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(X，g/L)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程為：Y=678 23X-31.297(R2=0.999 5)，線性范圍0.002 1～0.084 0 g/L。

1.3 樹脂的篩選

1.3.1靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1吸附率及解吸率的計(jì)算 分別稱取經(jīng)預(yù)處理的4種型號(hào)(聚酰胺1號(hào)、聚酰胺2號(hào)、D101，AB-8)的樹脂各1.0 g(干質(zhì)量)，置于50 mL的錐形瓶中，分別加入總黃酮質(zhì)量濃度為8.78 g/L竹柏乙醇提取液(1.2.2節(jié)中制備)20 mL，密封，置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，靜置后過(guò)濾，測(cè)定溶液中總黃酮和穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度，并按照式(1)～(2)分別計(jì)算吸附量和吸附率。

(1)

(2)

式中：qa—吸附量，mg/g；Ea—吸附率，%；C0—吸附前初始質(zhì)量濃度，g/L；Ce—吸附后的質(zhì)量濃度，g/L；V—吸附液體積，mL；m—樹脂質(zhì)量，g。

將吸附飽和的4種型號(hào)樹脂，用一定量的蒸餾水沖洗，抽干，置于50 mL的錐形瓶中，分別加入20 mL 體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，密封，置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，靜置后過(guò)濾，測(cè)定濾液中總黃酮和穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度，并按照式(3)～(4)分別計(jì)算解吸量和解吸率。

(3)

(4)

式中：qd—解吸量，mg/g；Ed—解吸率，%；Cd—解吸液的質(zhì)量濃度，g/L；V—解吸液體積，mL；m—樹脂質(zhì)量，g。

1.3.1.2上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響 分別稱取經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹脂、聚酰胺樹脂各1.0 g(干質(zhì)量)，置于50 mL的錐形瓶中，分別加入總黃酮質(zhì)量濃度為0.5、 1.0、 1.5、 3.0和4.0 g/L (其中穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度7.15、 12.56、 13.90、 32.36和43.97 mg/L)的樣品溶液20 mL，密封，置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，靜置，過(guò)濾，考察不同上樣溶液質(zhì)量濃度對(duì)竹柏總黃酮吸附量和吸附率的影響。

1.3.1.3洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響 將吸附飽和的AB-8大孔吸附樹脂和聚酰胺樹脂，用一定量的蒸餾水沖洗除去表面殘留的溶液，抽干，置于50 mL的錐形瓶中，分別加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為50%、 60%、 70%、 80%和90%的乙醇溶液，密封，置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，靜置后過(guò)濾，考察不同體積分?jǐn)?shù)的洗脫劑對(duì)竹柏總黃酮解吸量和解吸率的影響。

1.3.2動(dòng)態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1吸附流速對(duì)吸附效果的影響 按照1.3.1節(jié)的條件，將200 mL樣品溶液以22、 44 和88 mL/h的吸附流速上樣，每10 mL收集1管流出液，定容，分別測(cè)定流出液中總黃酮和穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度，考察不同吸附流速對(duì)吸附效果的影響。

1.3.2.2上樣量對(duì)吸附效果的影響 按照1.3.1節(jié)的條件，將樹脂濕法裝柱后，取一定量的樣品溶液以22 mL/h的流速吸附上樣，每10 mL收集1管流出液，定容，分別測(cè)定流出液中總黃酮和穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度。

1.3.2.3洗脫流速對(duì)解吸效果的影響 將吸附飽和的AB-8大孔吸附樹脂柱，用蒸餾水沖洗去除表面殘留的溶液，之后將洗脫劑分別以22、 44和88 mL/h的流速解吸，每10 mL收集1管洗脫液，定容，分別測(cè)定洗脫液中總黃酮和穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度。

1.3.2.4洗脫劑用量對(duì)解吸效果的影響 按前述條件將樹脂柱吸附至飽和，蒸餾水沖洗去除表面殘留的溶液，之后用一定量的洗脫劑以44和88 mL/h的流速洗脫，每10 mL收集1管洗脫液，定容，分別測(cè)定洗脫液中總黃酮和穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度。

1.4 竹柏葉黃酮化合物的純化

將竹柏葉提取物的浸膏加水制成懸浮液后，依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取。得到石油醚萃取部分(20 g)，氯仿萃取部分(30 g)，正丁醇萃取部分(200 g)。將竹柏葉正丁醇萃取物用水溶解、過(guò)濾后，通過(guò)AB-8大孔吸附樹脂分離，乙醇/水(體積比0 ∶1～1 ∶0)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，經(jīng)硅膠薄層板點(diǎn)樣檢測(cè)劃分得到6部分：Fr.1(20.5 g)，F(xiàn)r.2(26.6 g)，F(xiàn)r.3(36.1 g)，F(xiàn)r.4(42.3 g)，F(xiàn)r.5(30.7 g)，F(xiàn)r.6(19.5 g)。Fr.2組分濃縮后，采用硅膠柱色譜，用氯仿/甲醇梯度洗脫(體積比0 ∶1～1 ∶0)，收集洗脫液流分。經(jīng)薄層層析跟蹤合并從Fr.2組分中得到4個(gè)洗脫部分(Fr.2.1～Fr.2.4)。然后將Fr.2.3用甲醇/水溶液梯度洗脫(體積比7 ∶3～1 ∶1)，分別經(jīng)過(guò)聚酰胺柱層析、凝膠柱層析、ODS反相柱色譜和重結(jié)晶反復(fù)分離純化，收集流分得到化合物1(25 mg)和化合物3(5 mg)。Fr.3組分濃縮后，采用硅膠柱色譜，用氯仿/甲醇溶液梯度洗脫，收集洗脫液流分。經(jīng)薄層層析跟蹤合并從Fr.3組分中得到5個(gè)洗脫部分(Fr.3.1～Fr.3.5)。然后將Fr.3.4用甲醇/水溶液梯度洗脫，分別經(jīng)過(guò)ODS反相柱色譜、凝膠柱層析、重結(jié)晶和制備薄層反復(fù)分離純化，得到化合物2(50 mg)、化合物4(13 mg)和化合物6(4 mg)。Fr.4組分濃縮后，采用硅膠柱色譜，用氯仿/甲醇溶液梯度洗脫，收集洗脫液流分。經(jīng)薄層層析跟蹤合并從Fr.4組分中得到4個(gè)洗脫部分(Fr.4.1～Fr.4.4)。然后將Fr.4.2用甲醇/水溶液梯度洗脫，分別經(jīng)過(guò)制備薄層、重結(jié)晶和ODS反相柱色譜反復(fù)分離純化，得到化合物5(15 mg)、化合物7(6 mg)和化合物8(33 mg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂的篩選

由表1可知，聚酰胺樹脂的吸附率明顯高于大孔吸附樹脂，而大孔吸附樹脂解吸率明顯優(yōu)于聚酰胺樹脂。因此，選取吸附率相對(duì)較高的聚酰胺樹脂(PLA-2)和解吸率較高的AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行后續(xù)靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)研究。

表1 不同樹脂的靜態(tài)吸附-解吸性能

2.2 樹脂的靜態(tài)吸附-解吸

2.2.1上樣液質(zhì)量濃度的影響 從表2可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著上樣液質(zhì)量濃度的不斷增加，兩種樹脂對(duì)竹柏黃酮的吸附率均隨之增大，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為1.5 g/L時(shí)，對(duì)竹柏黃酮的吸附率達(dá)最大值分別為94.88%和90.13%。當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為3.0 g/L時(shí)，穗花杉雙黃酮的吸附率達(dá)到最大，分別為98.57%和94.68%。因此，為了從竹柏中獲取更多的黃酮類化合物，選取上樣液質(zhì)量濃度為1.5～3.0 g/L較為適宜。

表2 不同質(zhì)量濃度的溶液對(duì)吸附率的影響

2.2.2洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 由表3可知，兩種樹脂對(duì)穗花杉雙黃酮的解吸率隨著洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而逐漸變大，當(dāng)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，繼續(xù)增大洗脫劑體積分?jǐn)?shù)，對(duì)竹柏黃酮的洗脫率減小，因此選取體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇作為洗脫劑較好。

表3 不同濃度洗脫劑對(duì)解吸率的影響

2.3 樹脂的動(dòng)態(tài)吸附-解吸

2.3.1上樣流速對(duì)吸附效果的影響 如圖1可知，在上樣量200 mL時(shí)，隨著上樣流速的加快，總黃酮泄露速度加快，分析原因可能是上樣流速過(guò)快導(dǎo)致樹脂與樣品溶液接觸時(shí)間較短，不利于吸附。因此，選取上樣流速22 mL/h較適宜。

圖1 不同上樣流速對(duì)吸附效果的影響

2.3.2上樣量對(duì)吸附效果的影響 由圖2可知，隨著上樣量的逐漸增加，流出液中總黃酮的質(zhì)量濃度增加，樹脂吸附效果逐漸下降。當(dāng)上樣量少于200 mL時(shí)，雖然流出液中總黃酮和穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度均明顯增加，但是大部分的總黃酮仍然能被樹脂吸附。繼續(xù)加大上樣量至220 mL時(shí)，流出液中總黃酮質(zhì)量濃度接近上樣液質(zhì)量濃度，樹脂吸附能力明顯降低，表明樹脂已接近吸附飽和。因此，為減少樣液中總黃酮大量泄露使純化得率降低，選取220 mL為最佳上樣量。

2.3.3洗脫流速對(duì)解吸效果的影響 如圖3可知，在洗脫劑200 mL時(shí)，隨著洗脫流速的加快，樹脂與洗脫劑接觸時(shí)間較短不利于洗脫，導(dǎo)致解吸率降低。但是，洗脫流速為44 mL/h時(shí)與流速為22 mL/h時(shí)，洗脫效果相差較小。因此，為了提高工作效率，選取洗脫流速為44 mL/h較適宜。

圖3 不同洗脫流速對(duì)解吸效果的影響

2.3.4洗脫劑用量對(duì)解吸效果的影響 由圖4可以看出，隨著洗脫劑用量的逐漸增加，洗脫液中總黃酮的質(zhì)量濃度增加。當(dāng)洗脫劑用量達(dá)到140 mL時(shí)，洗脫液中幾乎檢測(cè)不到總黃酮和穗花杉雙黃酮，表明此時(shí)已接近洗脫極限。因此，為減少溶劑的浪費(fèi)，選取140 mL為最佳洗脫劑用量。

2.3.5驗(yàn)證試驗(yàn) 綜合靜態(tài)吸附-解吸及動(dòng)態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確立了竹柏總黃酮的最佳純化工藝條件為：采用AB-8大孔吸附樹脂以22 mL/h的流速吸附質(zhì)量濃度為3.0 g/L的竹柏粗提液220 mL，達(dá)到吸附平衡后，用140 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇以44 mL/h的流速進(jìn)行洗脫，測(cè)得在該條件下純化得到的樣品中總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.8%，穗花杉雙黃酮的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.37%。

2.4 單體化合物結(jié)構(gòu)表征

化合物1，淺褐色結(jié)晶，分子式為：C15H14O6，經(jīng)薄層色譜展開，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱后呈黃棕色斑點(diǎn)，熔點(diǎn)為174～175 ℃。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)：δ4.5(1H，d，J=7.5 Hz, H-2)，3.8(1H, m, H-3)，2.7(1H, dd,J=4.6 Hz, 16.3 Hz, H- 4a)，2.4(1H, dd,J=8.1 Hz, 16.2 Hz, H- 4b)，5.7(1H, d,J=2.2 Hz, H- 6)，5.7(1H, d,J=2.2 Hz, H-8)，6.7(1H, d,J=1.9 Hz, H-2′)，6.6(1H, d,J=8.1 Hz, H-5′)，6.6(1H, dd,J=1.9 Hz, 8.1 Hz, H- 6′)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)：δ81.0(C-2)，66.3(C-3)，28.2(C- 4)，156.3(C-5)，95.2(C- 6)，155.8(C-7)，94.1(C-8)，156.6(C-9)，99.1(C-10)，130.7(C-1′)，114.8(C-2′)，144.9(C-3′)，144.5(C- 4′)，115.1(C-5′)，118.4(C- 6′)。綜合以上理化常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)，且化合物1與兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品共薄層多體系展開，呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，并與文獻(xiàn)[17～18]對(duì)照，確定該化合物為兒茶素(catechin)。

化合物2，黃色粉末，分子式為：C15H10O5，經(jīng)薄層色譜展開，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱后呈黃色斑點(diǎn)，于365 nm下呈現(xiàn)亮黃色熒光。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)：δ7.9(2H, d,J=8.8 Hz, H-2′, H- 6′)，6.9(2H, d,J=8.8 Hz, H-3′, H-5′)，6.7(1H, s, H-3)，6.0(1H, s, H- 6)，6.3(1H, s, H-8)，12.9(1H, br.s, 5-OH)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)：δ163.1(C-2)，102.5(C-3)，181.1(C- 4)，161.3(C-5)，99.6(C- 6)，163.6(C-7)，94.4(C-8)，157.5(C-9)，105.2(C-10)，121.1(C-1′)，128.2(C-2′, C- 6′)，116.0(C-3′, C-5′)，δ162.4(C- 4′)。綜合以上波譜數(shù)據(jù)，推斷該化合物為5,7,4′-三羥基黃酮，與文獻(xiàn)[19～20]報(bào)道芹菜素的數(shù)據(jù)一致，因此，確定該化合物為芹菜素(apigenin)。

化合物3，白色結(jié)晶，分子式為：C15H14O6，經(jīng)薄層色譜展開，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱后呈黃棕色斑點(diǎn)，熔點(diǎn)為244～245 ℃。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)：δ4.7(1H, br.s, H-2)，4.0(1H, m, H-3)，2.7(1H, dd,J=5.3 Hz, 16.4 Hz, H- 4a)，2.5(1H, dd,J=8.1 Hz, 16.1 Hz, H- 4b)，5.7(1H, d,J=2.2 Hz, H- 6)，5.9(1H, d,J=2.1 Hz, H-8)，6.9(1H, d,J=1.5 Hz, H-2′)，6.7(1H, d,J=8.0 Hz, H-5′)，6.6(1H, dd,J=1.7 Hz, 8.2 Hz, H- 6′)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)：δ78.1(C-2)，65.0(C-3)，27.9(C- 4)，156.2(C-5)，95.1(C- 6)，155.4(C-7)，93.9(C-8)，156.5(C-9)，98.5(C-10)，130.6(C-1′)，114.6(C-2′)，144.5(C-3′)，144.5(C- 4′)，115.0(C-5′)，118.0(C- 6′)。綜合以上理化常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)[18, 21]對(duì)照，確定該化合物為表兒茶素(epi-catechin)。

化合物4，淺黃色粉末，分子式為：C21H20O10，經(jīng)薄層色譜展開，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱后呈黃色斑點(diǎn)，于365 nm下呈現(xiàn)亮黃色熒光。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)：δ8.0(2H, d,J=8.2 Hz, H-2′, H- 6′)，6.9(2H, d,J=8.2 Hz, H-3′, H-5′)，6.8(1H, s, H-3)，6.3(1H, s, H- 6)，13.2(1H, br.s, 5-OH)，葡萄糖的端基氫為δ4.7(1H, d,J=9.8 Hz, H-1″)，3.2～4.0(6H, m)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)：δ164.0(C-2)，102.5(C-3)，182.1(C- 4)，160.4(C-5)，98.2(C- 6)，161.2(C-7)，104.6(C-8)，156.1(C-9)，104.0(C-10)，121.6(C-1′)，129.0(C-2′, C- 6′)，115.9(C-3′, C- 5′ )，162.8(C- 4′)，葡萄糖：δ73.4(C-1″)，70.9(C-2″)，78.7(C-3″)，70.6(C- 4″)，81.9(C-5″)，61.3(C- 6″)。1H NMR譜與化合物2相比，多了δ4.7(1H, d,J=9.8 Hz)葡萄糖的端基質(zhì)子，推測(cè)該化合物為黃酮碳苷類化合物，同時(shí)13C NMR(125MHz, DMSO-d6)中δ104.7也證實(shí)為黃酮碳苷C-8的特征信號(hào)，δ98.2為C- 6的特征信號(hào)；糖端基碳δ73.4，與黃酮氧苷中糖端基碳δ98～112有明顯的差別，根據(jù)δ73.4，70.9，78.7，70.8，81.9，61.3的一組碳信號(hào)，推測(cè)糖基為未被取代的β-D-葡萄糖。綜合以上波譜數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)[22～23]對(duì)照，確定該化合物為芹菜素-8-C-β-D-葡萄糖，即牡荊苷(vitexin)。

化合物5，黃色粉末，分子式為：C27H30O14，經(jīng)薄層色譜展開，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱后呈黃色斑點(diǎn)，于365 nm下呈現(xiàn)亮黃色熒光。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)：δ8.1(2H, d,J=8.8 Hz, H-2′, H- 6′)，7.0(2H, d,J=8.7 Hz, H-3′, H-5′)，6.8(1H, s, H-3)，6.2(1H, s, H- 6)，13.1(1H, br.s, 5-OH)，葡萄糖：δ4.8(1H, d,J=10.1 Hz, H-1″)，3.3(1H, m)，3.4(2H, m)，3.5(1H, m)，3.8(1H, m)，4.0(1H, m)，鼠李糖：δ5.0(1H, s, H-1?)，2.0～4.0(4H, m)，0.5(3H, d,J=6.2 Hz)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)：δ164.0(C-2)，103.7(C-3), 182.0(C- 4)，160.7(C-5)，98.1(C- 6)，162.3(C-7)，105.8(C-8)，155.8(C-9)，104.5(C-10)，121.6(C-1′)，129.0(C-2′, 6′)，115.9(C-3′, 5′)，161.2(C- 4′)，葡萄糖：δ71.7(C-1″)，75.0(C-2″)，78.3(C-3″)，70.3(C- 4″)，80.9(C-5″)，61.2(C- 6″)，鼠李糖：δ100.3(C-1?)，70.4(C-2?)，70.1(C-3?)，71.5(C- 4?)，68.2(C-5?)，17.7(C- 6?)。1H NMR譜顯示該化合物母體結(jié)構(gòu)為牡荊苷(化合物4)。根據(jù)1H NMR譜中出現(xiàn)的甲基的質(zhì)子信號(hào)δ0.5(3H, d,J=6.2 Hz)和糖的端基氫信號(hào)δ5.0(1H, s, H-1?)，以及13C NMR譜中一組信號(hào)δ100.3，70.4，70.1，71.5，68.2，17.7，推測(cè)該化合物中還連有α-L-鼠李糖。綜合以上波譜數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)[20,24]對(duì)照，確定該化合物為牡荊苷-2″-O-α-L-鼠李糖，即牡荊苷鼠李糖苷(vitexin rhamnoside)。

化合物6，黃色粉末，分子式為：C30H18O10，經(jīng)薄層色譜展開，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱后呈黃色斑點(diǎn)，于365 nm下呈現(xiàn)亮黃色熒光。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)：δ6.8(1H, s, H-3)，6.5(1H, d,J=2.1 Hz, H- 6)，6.2(1H, d,J=2.1 Hz, H-8)，8.0(1H, br.s, H-2′)，7.16(1H, d,J=8.4 Hz, H-5′)，8.0(1H, d,J=2.4 Hz, 8.5 Hz, H- 6′)，6.8(1H, s, H-3″)，6.4(1H, s, H- 6″)，7.6(2H, d,J=8.8 Hz, H-2?, H- 6?)，6.7(2H, d,J=8.9 Hz, H-3?, H-5?)，13.1(1H, br.s, 5-OH)，13.0(1H, br.s, 5″-OH),10.8(1H, br.s, 7-OH), 10.3(1H, br.s, 7″-OH)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)：δ164.1(C-2)，103.0(C-3)，182.1(C- 4)，161.9(C-5)，98.8(C- 6)，163.7(C-7)，94.0(C-8)，157.4(C-9)，104.0(C-10)，121.4(C-1′)，131.4(C-2′)，116.1(C-3′)，160.5(C- 4′)，119.9(C-5′)，127.8(C- 6′)，163.8(C-2″)，102.6(C-3″)，181.7(C- 4″)，161.4(C-5″)，98.6(C- 6″)，159.5(C-7″)，103.6(C-8″)，154.5(C-9″)，103.7(C-10″)，120.9(C-1?)，128.2(C-2?, C- 6?)，115.7(C-3?, C-5?)，161.0(C- 4?)。綜合以上理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)品共薄層檢測(cè)，并與文獻(xiàn)[9,25]對(duì)照，且化合物6與穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品共薄層多體系展開，呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，進(jìn)一步確定該化合物為穗花杉雙黃酮(amentoflavone)。

化合物7，淡黃色粉末，分子式為：C31H20O10，經(jīng)薄層色譜展開，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱1min后呈黃色斑點(diǎn)。1H NMR(500MHz, DMSO-d6):δ6.8(1H, s, H-3), 6.2(1H, d,J=2.0 Hz, H- 6), 6.3(1H, d,J=1.6 Hz, H-8), 8.2(1H, d,J=2.1 Hz, H-2′), 7.0(1H, d,J=8.7 Hz, H-5′), 7.9(1H, dd,J=2.3, 8.6 Hz, H- 6′), 6.9(1H, s, H-3″), 6.2(1H, s, H- 6″), 7.8(2H, d,J=8.9 Hz, H-2?, 6?), 6.8(2H, d,J=7.4 Hz, H-3?, 5?), 13.1(1H, br.s, 5-OH), 13.0(1H, br.s, 5″-OH), 3.67(3H, s, 4?-OMe)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6):δ164.0(C-2), 102.6(C-3), 181.7(C- 4), 161.4(C-5), 98.8(C- 6), 164.0(C-7), 94.0(C-8), 157.3(C-9), 103.6(C-10), 119.3(C-1′), 131.4(C-2′), 121.9(C-3′), 162.7(C- 4′), 118.0(C-5′), 127.1(C- 6′), 164.3(C-2″), 103.1(C-3″), 181.8(C- 4″), 160.5(C-5″), 102.5(C- 6″), 162.6(C-7″), 100.4(C-8″), 154.7(C-9″), 105.6(C-10″), 123.2(C-1?), 128.0(C-2?,C- 6?), 114.3(C-3?,C-5?), 162.0(C- 4?), 55.3(4?-OMe)。從HMBC譜可知甲氧基上的氫信號(hào)δ3.7(3H, s)與δ161.9處C- 4?相連，綜合以上波譜數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)[17,26]對(duì)照，確定該化合物為羅漢松雙黃酮A(podocarpus flavone A)。

化合物8，淡黃色粉末，分子式為：C31H20O10，經(jīng)薄層色譜展開，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱1 min后呈黃色斑點(diǎn)。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6):δ6.9(1H, s, H-3), 6.2(1H, d,J=2.8 Hz, H- 6), 6.5(1H, d,J=2.0 Hz, H-8), 8.2(1H, d,J=2.8 Hz, H-2′), 7.2(1H, d,J=8.5 Hz, H-5′), 8.0(1H, dd,J=2.8, 8.8 Hz, H- 6′), 6.8(1H, s, H-3″), 6.4(1H, s, H- 6″), 7.7(2H, d,J=8.9 Hz, H-2?,6?), 6.9(2H, d,J=8.8 Hz, H-3?,5?), 3.8(3H, s, 4′-OMe), 13.1(1H, s, 5-OH), 10.8(1H, s, 7-OH), 13.0(1H, s, 5″-OH), 10.4(1H, s, 7″-OH)；13C NMR(100 MHz, DMSO-d6):δ164.4(C-2), 103.7(C-3), 182.6(C- 4), 159.96(C-5), 99.1(C- 6), 163.7(C-7), 94.5(C-8), 157.8(C-9), 103.7(C-10), 123.4(C-1′), 128.3(C-2′), 121.4(C-3′), 161.9(C- 4′), 116.6(C-5′), 131.8(C- 6′), 164.3(C-2″)，103.4(C-3″), 182.2(C- 4″), 161.0(C-5″), 104.1(C- 6″), 162.7(C-7″), 104.1(C-8″), 155.0(C-9″), 103.4(C-10″), 120.4(C-1?), 128.4(C-2?,C- 6?), 114.9(C-3?,C-5?), 161.0(C- 4?), 55.9(4′-OMe)。綜合以上波譜數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)[26～27]對(duì)照，且化合物8與白果黃素標(biāo)準(zhǔn)品共薄層多體系展開，呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，進(jìn)一步確定該化合物為白果黃素(bilobetin)。

通過(guò)對(duì)竹柏葉化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離得到了8個(gè)化合物(化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5)，均為黃酮類化合物，其中黃烷類化合物2個(gè)(化合物1和3)，黃酮碳苷2個(gè)(化合物4和5)，雙黃酮3個(gè)(化合物6、7、8)和黃酮類化合物1個(gè)(化合物2)。除化合物2、6和7外，其他5個(gè)化合物均為首次從竹柏中分離得到，化合物4、5和8為首次從竹柏屬植物中分離得到。

圖5 分離的竹柏葉化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)

3 結(jié) 論

3.1以吸附率和解吸率為指標(biāo)，比較了聚酰胺樹脂(PLA-1和PLA-2)和大孔吸附樹脂(AB-8和D101)對(duì)竹柏總黃酮的吸附-解吸性能，結(jié)合靜態(tài)及動(dòng)態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)，得出AB-8大孔樹脂分離純化竹柏總黃酮的最佳工藝為：上樣液總黃酮質(zhì)量濃度為1.5～3.0 g/L，上樣流速22 mL/h，上樣量220 mL；洗脫劑為體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇，洗脫流速44 mL/h，洗脫劑用量140 mL，竹柏總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從13.6%提高到52.8%，穗花杉雙黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.1%提高到2.37%，較純化前有明顯的提高。

3.2從竹柏枝葉提取物正丁醇萃取部位分離得到8個(gè)黃酮類化合物，分別為兒茶素(1)、芹菜素(2)、表兒茶素(3)、牡荊苷(4)、牡荊苷鼠李糖苷(5)、穗花杉雙黃酮(6)、羅漢松雙黃酮A(7)和白果黃素(8)。其中化合物4、5和8為首次從竹柏屬植物中分離得到，這為今后對(duì)竹柏中黃酮類化合物的定量研究和定性分析提供了參考依據(jù)。