趙琳，宋瑞瑞，吳琦，吳希，云振宇

（中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院農(nóng)業(yè)食品標(biāo)準(zhǔn)化研究所，北京100191）

納米材料因其結(jié)構(gòu)單元小、表面積大，在機(jī)械、光學(xué)、化學(xué)及生物學(xué)等方面具有良好的特性，在能源、電子、新材料、生物醫(yī)學(xué)、組織工程等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，由于植物納米組學(xué)的發(fā)展，納米材料的研究和應(yīng)用延伸至農(nóng)業(yè)，如納米肥料、納米農(nóng)藥、納米土壤改良產(chǎn)品等，納米材料的大量生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸及應(yīng)用，導(dǎo)致其不可避免的進(jìn)入了環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)[1-2]，不同程度地釋放并積累于土壤中，影響植物微生態(tài)環(huán)境，干擾正常的物質(zhì)代謝過(guò)程[3-5]。因此，納米材料對(duì)植物生長(zhǎng)的影響逐漸成為一門新興的農(nóng)業(yè)研究方向。

石墨烯（Graphene）是一種由碳原子以sp2雜化方式形成的六角型呈蜂巢晶格的二維碳納米材料，是由英國(guó)曼徹斯特大學(xué)物理學(xué)家安德烈·蓋姆和康斯坦丁·諾沃肖洛夫采用微機(jī)械剝離法從石墨中分離出來(lái)的[6]。基于不同的功能基團(tuán)，石墨烯又衍生出氧化石墨烯、磺化石墨烯、熒光石墨烯等[7]。由于石墨烯及其衍生材料具有優(yōu)異的物理性質(zhì)，在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用不斷被挖掘，已經(jīng)涉及到農(nóng)藥、肥料、吸附劑等方面[8-10]。氧化石墨烯（GO）是在石墨烯蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，表面連接羧基、環(huán)氧基、羥基、羰基、酯基等含氧官能團(tuán)，其具有較高的親水性和表面活性，在催化、儲(chǔ)能、過(guò)濾等方面具有廣闊的應(yīng)用空間[11-15]。隨著GO的大量生產(chǎn)及在環(huán)保、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域中的研究和應(yīng)用，其廢物最終會(huì)進(jìn)入到土壤中，并隨著地表徑流和降水等水流在土壤中遷移，從而影響地下水、土壤微生物、土壤動(dòng)物、土壤植物等[16-17]。

農(nóng)作物的質(zhì)量和安全與人體健康息息相關(guān)，因此GO的生物學(xué)效應(yīng)得到了廣泛關(guān)注，大量研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育均有不同程度的影響。Chen等[18]研究了0～2 000μg·mL-1濃度下GO對(duì)小麥幼苗萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明在125μg·mL-1和250μg·mL-1濃度時(shí)，GO對(duì)小麥幼苗的根生長(zhǎng)具有不同程度的促進(jìn)作用，而當(dāng)GO濃度在1 000μg·mL-1以上時(shí)，則對(duì)小麥幼苗的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且抑制作用隨著濃度的增加而增大，2 000μg·mL-1濃度下小麥幼苗根部的表皮細(xì)胞和皮層細(xì)胞出現(xiàn)顯著的崩解和疏松，大部分細(xì)胞破裂，且根表面吸附有石墨烯，對(duì)植物組織結(jié)構(gòu)有顯著損傷；Park等[19]研究發(fā)現(xiàn)適量的GO對(duì)擬南芥生長(zhǎng)有積極的影響，可以增加根的長(zhǎng)度和葉的數(shù)量，促進(jìn)花芽的形成，同時(shí)GO還會(huì)影響西瓜的成熟度，增加西瓜的周長(zhǎng)和糖分含量；還有研究發(fā)現(xiàn)GO能夠促進(jìn)甘藍(lán)型油菜種子的萌發(fā)，并顯著影響幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育[20]。玉米是優(yōu)良的糧食作物，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，在我國(guó)各個(gè)地區(qū)都有種植。GO是否對(duì)玉米的生長(zhǎng)發(fā)育有影響，目前還沒(méi)有確切的結(jié)論。本研究以玉米幼苗作為供試植物，檢測(cè)分析了不同濃度的GO對(duì)玉米生長(zhǎng)狀態(tài)、光合作用及酶活力的影響，旨在為石墨烯材料的毒性評(píng)價(jià)、生態(tài)環(huán)境效應(yīng)等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

GO分散液采購(gòu)于江蘇先豐納米材料科技有限公司，為黑色或褐色液體，厚度為1～6層（TEM），片徑0.5～5μm（TEM），濃度10 mg·mL-1。玉米種子采購(gòu)于北京大京九農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，品種為鄭單958，種子發(fā)芽率大于90%。

1.2 試驗(yàn)處理

選擇籽粒飽滿、大小均勻的玉米種子于1 000 mL燒杯中，用H2O2對(duì)種子消毒10 min，蒸餾水沖洗3遍，將種子放置到鋪有濕潤(rùn)紗布的培養(yǎng)皿中發(fā)芽，每顆種子之間的距離約為3 cm，加水至玉米種子高度的1/2處，于室溫黑暗條件下培養(yǎng)，90%的種子根長(zhǎng)長(zhǎng)到3～4 cm時(shí)，轉(zhuǎn)移至1 000 mL的燒杯中水培，自然環(huán)境下培養(yǎng)24 h后分別轉(zhuǎn)移至500 mL濃度為0（對(duì)照）、25、50、100、200 mg·L-1的GO分散液中培養(yǎng)9 d，每種濃度GO溶液培養(yǎng)的玉米苗不少于8株，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)量

將幼苗用GO處理9 d后，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選5株幼苗用清水洗干凈附著的GO，并用吸水紙輕輕擦干水分，測(cè)量主根根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)和葉長(zhǎng)，并測(cè)定根鮮質(zhì)量和地上部分鮮質(zhì)量。

1.4 電鏡表征

取GO處理過(guò)的玉米幼苗的根部，用蒸餾水沖洗干凈，再用pH7.2的磷酸緩沖液（PBS）沖洗3次，將根系分散于2.5%的戊二醛中，4℃下固定12 h，用PBS漂洗20 min完成固定，樣品依次經(jīng)過(guò)30%、50%、70%、80%、95%、100%的乙醇各20 min進(jìn)行處理，再用濃度為100%的乙醇處理2次各20 min進(jìn)行脫水，然后在乙醇∶叔丁醇=1∶1溶液中處理20 min，純叔丁醇30 min，再用純叔丁醇重復(fù)1次，將樣品放入-20℃的冰箱冷凍室30 min后，用冷凍干燥儀干燥樣品約4 h，樣品置于樣品臺(tái)上，噴金（120 s），用掃描電子顯微鏡觀察（SEM，S-3400N，HITACHI，日本）。

1.5 生化指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 葉綠素含量測(cè)定

取葉片0.2 g，剪碎，放置于50 mL離心管中，加入25 mL 95%的乙醇，封閉后避光放置24 h待葉片全部變白，使用分光光度計(jì)檢測(cè)663、645 nm處的吸光值（A值），計(jì)算葉綠素a（Ca）、葉綠素b（Cb），總?cè)~綠素（Ct）的含量（mg·g-1），計(jì)算公式為：

式中：A663、A645分別為在波長(zhǎng)663、645 nm處的吸光值；V為提取液的總體積，mL；W為葉片鮮質(zhì)量，g。

1.5.2 酶活性測(cè)定

稱取一定質(zhì)量的根置于預(yù)冷的研缽中，按1∶15（g·mL-1）的比例加入含有1%（m/V）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和0.2 mmol·L-1乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS（pH 7.8）溶液，研磨至勻漿，12 000 r·min-1、4℃離心30 min，取上清液備用。

酶活性測(cè)定方法：超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑法，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法，過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法進(jìn)行測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，作圖軟件為

Origin。

2 結(jié)果與分析

2.1 GO對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響

從圖1可以看出，GO處理9 d后，相對(duì)于對(duì)照組，不同濃度GO處理的玉米幼苗根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)和葉長(zhǎng)均有不同程度的降低。GO濃度為25 mg·L-1時(shí)，玉米幼苗的總體生長(zhǎng)減緩情況并不顯著。而當(dāng)GO濃度達(dá)到50、100 mg·L-1和200 mg·L-1時(shí)，玉米幼苗的主根根長(zhǎng)相對(duì)于對(duì)照分別降低了39.0%、67.6%和79.8%；葉長(zhǎng)分別降低了15.9%、47.5%和49.0%。在GO濃度為100 mg·L-1和200 mg·L-1時(shí)，莖的伸長(zhǎng)受到顯著影響，相對(duì)于對(duì)照分別降低26.5%和32.0%。

同樣，GO處理9 d后玉米幼苗各部分的質(zhì)量也呈現(xiàn)類似的變化（圖2A）。尤其是根鮮質(zhì)量，隨著GO濃度增加，處理組相對(duì)于對(duì)照組依次有39.3%、46.4%、71.4%、82.1%的降低。根系生長(zhǎng)受到抑制時(shí)，根冠比通常會(huì)表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。如圖2B所示，在各濃度GO處理下，玉米幼苗的根冠比與對(duì)照相比顯著下降，分別下降29.3%、39%、53.7%和65.9%。這些結(jié)果表明GO在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)能抑制玉米幼苗的生長(zhǎng)，尤其在GO濃度超過(guò)100 mg·L-1時(shí)，對(duì)玉米幼苗根部的生長(zhǎng)抑制效果更加明顯。

2.2 GO對(duì)玉米幼苗根部形態(tài)的影響

使用SEM對(duì)玉米根系的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)一步觀察，與對(duì)照組（圖3A和圖3B）相比，50 mg·L-1GO處理9 d后，玉米幼苗根尖未見(jiàn)明顯結(jié)構(gòu)變化（圖3C），成熟區(qū)部分表面光滑、有根毛（圖3D），總體上未見(jiàn)有明顯損傷。而200 mg·L-1GO處理組的玉米幼苗根尖部分有明顯的結(jié)構(gòu)變化，根冠與分生區(qū)之間界限消失（圖3E），成熟區(qū)表面褶皺且破損，出現(xiàn)明顯的損傷痕跡（圖3F）。SEM結(jié)果與生理指標(biāo)測(cè)試結(jié)果相符，證實(shí)了高濃度的GO對(duì)玉米幼苗根部生長(zhǎng)發(fā)育有明顯影響。

2.3 GO對(duì)玉米幼苗光合作用的影響

葉綠素是高等植物進(jìn)行光合作用的主要色素，主要有葉綠素a和葉綠素b兩種。葉綠素含量會(huì)影響植物的光反應(yīng)，進(jìn)而影響光合效率。如圖4所示，Ca、Cb、Ct含量均隨著GO濃度的增加表現(xiàn)出類似的規(guī)律，即先增加后降低。在25 mg·L-1時(shí)，Ca、Cb、Ct含量較對(duì)照分別增加18.5%、22.9%和20.0%，而當(dāng)GO濃度達(dá)到200 mg·L-1時(shí)，各指標(biāo)較對(duì)照分別下降了21.2%、8.6%和17.8%?？傮w來(lái)看，Ca、Cb、Ct含量水平只有在高濃度GO處理?xiàng)l件下才有所降低，表明高濃度的GO才會(huì)影響玉米幼苗葉綠素的合成。

2.4 GO對(duì)玉米幼苗根部SOD、POD和CAT活性的影響

SOD、POD和CAT是生物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中重要的保護(hù)性酶。如圖5A和圖5B所示，不同GO濃度處理玉米幼苗9 d后，根部SOD和POD的活性較對(duì)照組均未發(fā)生顯著變化。而CAT的活性隨著GO濃度的增加出現(xiàn)了顯著的升高趨勢(shì)，尤其在100 mg·L-1和200 mg·L-1高濃度GO條件下，CAT活性分別升高145.8%和187.5%（圖5C）。

2.5 GO對(duì)玉米幼苗根部MDA含量的影響

MDA是膜質(zhì)過(guò)氧化作用的重要產(chǎn)物之一，通過(guò)測(cè)定MDA含量可評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化程度。MDA含量檢測(cè)結(jié)果顯示（圖5D），隨著GO處理濃度的升高，MDA含量也逐漸增加，在GO濃度為25、50、100 mg·L-1和200 mg·L-1時(shí)，相較于對(duì)照組MDA含量分別增加57.5%、158.9%、189.0%和335.6%。

3 討論

石墨烯材料與植物的相互作用已經(jīng)開(kāi)始被廣泛研究。但不同石墨烯材料的物理化學(xué)性質(zhì)存在巨大差異，因此對(duì)植物生長(zhǎng)的效應(yīng)也有所不同[21]。已有研究表明石墨烯能夠抑制黃瓜和玉米幼苗的生長(zhǎng)，且隨著石墨烯濃度及暴露時(shí)間的增加，毒性也明顯增強(qiáng)[22]。低濃度磺化石墨烯（SG）能清除玉米幼苗根部活性氧（ROS），提高幼苗的健康狀態(tài)，而高濃度的SG則會(huì)促使根部ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[23]。胺功能化氧化石墨烯（G-NH2）的暴露引起了小麥幼苗根長(zhǎng)與莖長(zhǎng)的增加，促進(jìn)了小麥的生長(zhǎng)[18]?，F(xiàn)階段石墨烯材料對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究主要集中在小麥、水稻、玉米、黃瓜、番茄等可食作物上。關(guān)于GO對(duì)植物的影響大多表現(xiàn)為抑制作用，包括抑制種子的發(fā)芽、根的生長(zhǎng)等。然而，由于植物種類和暴露濃度的不同，GO對(duì)某些植物的生長(zhǎng)也表現(xiàn)出促進(jìn)作用[24]。因此，GO對(duì)植物生長(zhǎng)效應(yīng)的評(píng)價(jià)研究需要精確細(xì)分濃度梯度。本研究測(cè)試濃度范圍內(nèi)，GO能夠抑制玉米幼苗根系的生長(zhǎng)，降低根冠比，并隨著濃度的升高，根部形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)性損傷，生長(zhǎng)抑制趨勢(shì)更加顯著。本研究所選試驗(yàn)濃度基于現(xiàn)有相關(guān)研究，接近實(shí)際的環(huán)境濃度，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

葉綠素作為植物主要的光合色素，其含量反映了植物光合性能的強(qiáng)弱，而且在一定程度上能表征植物受逆境脅迫的狀況[25-26]。葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量表現(xiàn)出類似的變化規(guī)律，即隨著GO濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。本研究的試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明25 mg·L-1GO處理在一定程度上能刺激光和色素的生成，GO濃度超過(guò)50 mg·L-1時(shí)，玉米幼苗的光合性能才會(huì)受到影響，高濃度的GO可能使葉綠體結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而限制了葉綠素的合成。這一結(jié)果與Hu等[27]發(fā)現(xiàn)200 mg·L-1石墨烯對(duì)植物葉綠素a和葉綠素b的合成有不利影響相一致。

目前，有關(guān)納米材料的毒性機(jī)制，較為認(rèn)可的是納米材料能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過(guò)量的ROS，引起氧化脅迫和脂質(zhì)過(guò)氧化，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞、DNA損傷，甚至細(xì)胞死亡[28-30]。面對(duì)氧化脅迫，植物會(huì)通過(guò)刺激抗氧化酶（SOD、POD、CAT）的活性來(lái)抵抗氧化應(yīng)激，但在強(qiáng)氧化條件下，抗氧化系統(tǒng)一旦被破壞，抗氧化酶的活性也會(huì)降低[31]。石墨烯材料的植物毒性很可能也與氧化應(yīng)激有關(guān)，Zhang等[32]的研究結(jié)果顯示，在250～1 500 mg·L-1石墨烯濃度范圍內(nèi)，小麥葉片中SOD和POD活性有顯著升高。GO誘導(dǎo)了高羊茅SOD、POD和CAT活性升高，同時(shí)產(chǎn)生膜質(zhì)過(guò)氧化損傷，MDA含量增加[33]。

SOD、POD和CAT是植物在逆境條件下酶促防御反應(yīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，能減輕活性氧對(duì)植物的傷害[34]。在測(cè)試的25～200 mg·L-1GO濃度范圍內(nèi)，玉米幼苗根部SOD和POD的活性較對(duì)照組并未出現(xiàn)顯著變化，可能與石墨烯材料種類、暴露濃度及植物物種有關(guān)。CAT作為調(diào)節(jié)植物體內(nèi)氧化還原動(dòng)態(tài)平衡的重要酶，與抗逆性及氧化衰老等生理過(guò)程相關(guān)，在植物抗毒害方面起著重要作用[35]。本研究測(cè)試濃度范圍內(nèi)，CAT活性隨著GO濃度的增加出現(xiàn)顯著的升高趨勢(shì)，CAT參與了抵抗GO脅迫。MDA作為膜質(zhì)過(guò)氧化的標(biāo)志物，其含量是一種重要的逆境生理指標(biāo)[36-37]。玉米幼苗根部MDA含量與CAT活性有著類似的變化趨勢(shì)，即隨著GO濃度的增加而顯著升高，表明玉米幼苗根系ROS大量產(chǎn)生，細(xì)胞膜的完整性遭受損傷，這與Ren等[23]高濃度磺化石墨烯處理玉米幼苗的結(jié)果相符。GO處理玉米幼苗產(chǎn)生的抑制效應(yīng)可能是GO通過(guò)胞外覆蓋、胞內(nèi)氧化脅迫或者直接破壞細(xì)胞膜等方式對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生危害[1，24]，但不同濃度GO對(duì)玉米幼苗產(chǎn)生不同效應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制還不清楚，我們將在下一步的研究中針對(duì)相關(guān)信號(hào)通路及基因表達(dá)進(jìn)行深入的研究與探討，從而為石墨烯的毒性評(píng)價(jià)和生態(tài)環(huán)境效應(yīng)提供基礎(chǔ)資料和科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

（1）GO脅迫不同程度地抑制了玉米幼苗的生長(zhǎng)，在25～200 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，GO能夠抑制玉米幼苗根系的生長(zhǎng)、降低根冠比，并隨著濃度的升高，抑制趨勢(shì)更加顯著。

（2）玉米幼苗葉綠素含量水平只有在濃度超過(guò)50 mg·L-1GO處理?xiàng)l件下才有所降低，表明較高濃度GO對(duì)葉綠素的合成有不利影響。

（3）不同GO濃度處理下，玉米幼苗根部SOD和POD的活性較對(duì)照組均未發(fā)生顯著變化，而CAT的活性和MDA含量隨著GO濃度增加而升高。