程越，邵騰飛，黃麗麗，楊丹，徐運(yùn)

氯吡格雷等P2Y12受體拮抗劑是臨床常用的缺血性卒中治療和二級(jí)預(yù)防的抗血小板藥物，不過患者在服藥后殘留的血小板反應(yīng)性差別較大[1]。研究表明，血小板的高反應(yīng)性與缺血性卒中患者缺血性事件復(fù)發(fā)密切相關(guān)[2-6]。血小板功能實(shí)驗(yàn)對(duì)殘留血小板反應(yīng)性的評(píng)價(jià)有助于臨床調(diào)整用藥以降低血小板反應(yīng)性。目前，關(guān)于最佳定量血小板反應(yīng)性的方法還在探索中，臨床常用的血小板功能檢測(cè)方法有透射光法血小板聚集實(shí)驗(yàn)（light transmittance aggregometry，LTA）、血栓彈力圖（thromboelastography，TEG）和血小板功能分析儀法（platelet function analyzer，PFA）[4]。本課題組前期的研究對(duì)三種血小板功能實(shí)驗(yàn)的表現(xiàn)進(jìn)行了分析，但由于前期研究未收錄預(yù)后數(shù)據(jù)，無法評(píng)價(jià)不同血小板功能實(shí)驗(yàn)對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值[7]。本研究對(duì)患者進(jìn)行隨訪并收集預(yù)后信息，以評(píng)價(jià)LTA、TEG和PFA三種血小板功能實(shí)驗(yàn)對(duì)輕型缺血性卒中預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，為卒中的精準(zhǔn)二級(jí)預(yù)防提供更多依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 前瞻性連續(xù)入組2017年5月-2019年2月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治的急性輕型缺血性卒中患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病7 d內(nèi)的缺血性卒中[8]；②輕型卒中，NIHSS≤3分；③使用氯吡格雷（75 mg/d）作為抗血小板治療藥物，且隨訪中服藥依從性良好，堅(jiān)持以氯吡格雷作為二級(jí)預(yù)防用藥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①血小板計(jì)數(shù)＞450×109/L或＜100×109/L；②有已知的血小板功能障礙；③使用已知對(duì)血小板功能有影響的協(xié)同藥物，如肝素、低分子肝素、替格瑞洛、西洛他唑、華法林或其他新型口服抗凝劑等。

本研究經(jīng)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 分組和資料收集 收集患者的年齡、性別等一般資料，既往卒中、冠心病、心房顫動(dòng)、高血壓、糖尿病等病史及吸煙史，實(shí)驗(yàn)室測(cè)定患者的CYP2C19基因型、血小板功能結(jié)果。2019年8月通過門診或電話對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪。隨訪的主要終點(diǎn)事件為缺血性卒中（不包括TIA）復(fù)發(fā)。安全性終點(diǎn)為出血事件，定義為經(jīng)過兩名臨床醫(yī)師檢查認(rèn)為同抗血小板藥物相關(guān)，且排除其他因素所致的消化道、口鼻腔、尿路出血及皮下瘀斑。

根據(jù)是否有缺血性卒中復(fù)發(fā)分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組；根據(jù)是否有出血事件分為出血組和未出血組。采用熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行CYP2C19基因檢測(cè)，按照結(jié)果分別3組：①快代謝組，包括快代謝型和超快代謝型（*1/*1和*1/*17）；②中等代謝型（*1/*2和*1/*3）為中等代謝組；③慢代謝型（*2/*2、*2/*3和*3/*3）為慢代謝組。

1.3 血小板功能檢測(cè)方法 采集患者服用氯吡格雷5 d后的空腹靜脈血，分別采用LTA、TEG和PFA三種血小板功能實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)患者的血小板反應(yīng)性。

LTA的原理是在富集血小板的血漿中，血小板在誘導(dǎo)劑刺激下發(fā)生活化聚集，聚集物形成降低了懸浮液的濁度，以致透光性增加。以20 μmol/L的ADP作為誘導(dǎo)劑，檢測(cè)氯吡格雷抗血小板聚集的效果。血小板反應(yīng)性，即聚集程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)表示為聚集率（范圍是0～100%），血小板高反應(yīng)性的界值為60%，即＞60%表示對(duì)氯吡格雷呈現(xiàn)抵抗作用，血小板功能呈高反應(yīng)性。

TEG是采用抗凝的全血直接進(jìn)行血小板聚集功能檢測(cè)。在體外模擬血栓的形成，加入誘導(dǎo)劑激活后，血液凝固為血栓，感受器測(cè)定血栓扭力并傳遞給電腦生成凝血速度和強(qiáng)度曲線。ADP作為誘導(dǎo)劑激活血小板，測(cè)定的凝血速度曲線和強(qiáng)度曲線反映氯吡格雷抗血小板聚集的效果。ADP作為誘導(dǎo)劑反應(yīng)氯吡格雷抗血小板聚集的效果。血小板功能以血小板抑制率（范圍是0～100%）表示，＜50%說明對(duì)氯吡格雷呈現(xiàn)低反應(yīng)性，血小板功能呈高反應(yīng)性。

PFA使用西門子INNOVANCE PFA-200血小板功能分析儀檢測(cè)，其原理是在血流條件下，模擬血栓形成，測(cè)定血栓封閉孔隙的時(shí)間（閉合時(shí)間）反映血小板聚集率。使用P2Y試劑盒（孔隙薄膜表面涂有ADP、前列腺素和Ca2+）誘導(dǎo)氯吡格雷服藥后血小板活性，閉合時(shí)間范圍為0～300 s，低于141 s說明對(duì)氯吡格雷呈現(xiàn)低反應(yīng)性，血小板功能呈高反應(yīng)性。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的基線和隨訪信息 研究共納入76例符合入排標(biāo)準(zhǔn)的患者，年齡39～89歲，平均66.95±11.26歲；男性50例（65.79%）；中位隨訪時(shí)間為13個(gè)月。至觀察終點(diǎn)時(shí)，5例（6.58%）患者缺血性卒中復(fù)發(fā)；17例（22.37%）患者有出血事件，包括消化道出血4例、口鼻出血3例、尿路出血6例及皮下瘀斑4例；無死亡病例。

2.2 終點(diǎn)事件相關(guān)因素分析 對(duì)于主要終點(diǎn)事件，缺血性卒中復(fù)發(fā)組LTA和TEG實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的血小板聚集率高于未復(fù)發(fā)組，血小板抑制率低于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PFA檢測(cè)的殘留血小板反應(yīng)性在兩組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組間CYP2C19基因型的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，基線資料中，復(fù)發(fā)組的年齡高于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 卒中復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組數(shù)據(jù)比較

對(duì)于安全性終點(diǎn)，出血組和未出血組CYP2C19基因型和三種血小板功能實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，出血組和未出血組的基線資料差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 出血組與未出血組數(shù)據(jù)比較

2.3CYP2C19基因型與不同血小板功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系 快、中等和慢代謝組三組間LTA和PFA所檢測(cè)到的血小板反應(yīng)性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中LTA的結(jié)果在快代謝組中最低，慢代謝組最高；PFA結(jié)果在快代謝組中最高，慢代謝組最低。TEG檢測(cè)結(jié)果在快、中等、慢代謝組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表3 不同CYP2C19基因型與血小板反應(yīng)性

2.4 不同血小板功能實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)缺血性卒中復(fù)發(fā)的價(jià)值 ROC分析發(fā)現(xiàn)，LTA和TEG能夠識(shí)別缺血性卒中復(fù)發(fā)的曲線下面積（area under the curve，AUC）分別為0.88（95%CI0.73～1.00）和0.79（95%CI0.61～0.97），對(duì)缺血性卒中復(fù)發(fā)有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值（圖1）。LTA和TEG預(yù)測(cè)缺血性卒中復(fù)發(fā)的最佳截?cái)嘀捣謩e為75.00%和64.60%，靈敏度和特異度分別為80.00%、87.30%和100%、56.30%。PFA預(yù)測(cè)缺血性卒中復(fù)發(fā)的AUC為0.74（95%CI0.44～1.00），包含0.5（表4）。

表4 預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的ROC曲線

圖1 三種血小板功能實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)缺血性卒中復(fù)發(fā)的ROC曲線

3 討論

基于76例規(guī)范使用氯吡格雷二級(jí)預(yù)防的急性輕型缺血性卒中患者的數(shù)據(jù)，本研究結(jié)果表明LTA和TEG對(duì)缺血性卒中復(fù)發(fā)有較好預(yù)測(cè)能力，而PFA所檢測(cè)的血小板反應(yīng)性以及CYP2C19基因型與缺血性卒中復(fù)發(fā)結(jié)局無關(guān)。CYP2C19基因型與LTA和PFA測(cè)得的血小板反應(yīng)性有關(guān)，與TEG所檢測(cè)的血小板反應(yīng)性無關(guān)。對(duì)于服用氯吡格雷可能會(huì)出血的安全性問題，三種血小板功能檢測(cè)結(jié)果以及CYP2C19基因型均與抗血小板藥物相關(guān)出血事件的發(fā)生無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，無法提供可靠的參考。

有關(guān)血小板功能檢測(cè)對(duì)缺血性卒中二級(jí)預(yù)防用藥的指導(dǎo)價(jià)值一直是臨床研究的熱點(diǎn)。血管成形術(shù)治療中使用抗血小板藥物降低心肌損傷-血小板反應(yīng)性預(yù)測(cè)結(jié)局（Antiplatelet therapy for Reduction of MYocardial Damage during Angioplasty-Platelet Reactivity Predicts Outcome，ARMYDA-PRO）研究及血小板功能實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)提前使用氯吡格雷抗血小板治療的經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療患者的臨床結(jié)局（Do Pointof-care Platelet Function Assays Predict Clinical Outcomes in Clopidogrel Pretreated Patients Undergoing Elective PCI，POPular）研究結(jié)果均表明血小板功能呈現(xiàn)高反應(yīng)性與缺血性事件的臨床復(fù)發(fā)相關(guān)[9-10]。2020年一項(xiàng)關(guān)于中國漢族人群急性缺血性卒中服用氯吡格雷用于二級(jí)預(yù)防的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，LTA實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)到的殘留血小板高反應(yīng)性會(huì)增加缺血性事件復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，而CYP2C19功能缺失性等位基因攜帶者（*2、*3）與卒中復(fù)發(fā)無關(guān)[11]。Yi等[12]通過375例缺血性卒中患者的隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LTA檢測(cè)血小板高反應(yīng)性是復(fù)發(fā)性缺血事件（缺血性卒中、心肌梗死）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前進(jìn)一步利用缺血性事件復(fù)發(fā)或者出血事件發(fā)生的預(yù)后數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)血小板功能實(shí)驗(yàn)的靈敏度和特異度的研究較少，因此仍需進(jìn)一步積累證據(jù)以供臨床參考。

本研究增加了LTA對(duì)缺血性卒中復(fù)發(fā)具有良好臨床預(yù)測(cè)價(jià)值的證據(jù)，與目前所認(rèn)為的LTA是評(píng)估血小板功能的金標(biāo)準(zhǔn)的觀點(diǎn)一致[13]。氯吡格雷治療急性非致殘性腦血管事件高危人群研究（Clopidogrel in High-risk Patients with Acute Non-disabling Cerebrovascular Events，CHANCE）的子研究（265例）顯示TEG檢測(cè)的最大振幅越大，缺血性事件（包括缺血性卒中、TIA、心肌梗死）的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)越高，最大振幅≥48 mm可以預(yù)測(cè)缺血性事件的復(fù)發(fā)，這有助于輕型卒中和高危型TIA患者的臨床用藥決策[14]。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院對(duì)286例非心源性缺血性卒中患者隨訪一年的研究顯示TEG所檢測(cè)的血小板抑制率對(duì)缺血性事件的預(yù)測(cè)能力較好，AUC達(dá)到0.800，這與本研究結(jié)果相近[15]。上海長海醫(yī)院關(guān)于急性缺血性卒中患者CYP2C19基因型和血小板功能以及一年預(yù)后情況的分析與本研究結(jié)果相似，基因型與氯吡格雷抵抗有顯著的關(guān)聯(lián)，但是與一年卒中復(fù)發(fā)事件的聯(lián)系未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[16]。雖然本研究結(jié)果說明TEG具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，但最佳截?cái)嘀档奶禺惗戎挥?6.30%，可能會(huì)造成假陽性結(jié)果。

PFA-200實(shí)驗(yàn)對(duì)既往的PFA-100法在用戶操作界面和電子智能化方面進(jìn)行了改進(jìn)，目前關(guān)于PFA-200應(yīng)用于缺血性卒中患者的研究報(bào)道較少[17]。Breet團(tuán)隊(duì)[18]使用PFA-100檢測(cè)冠狀動(dòng)脈支架置入患者的血小板反應(yīng)性，未發(fā)現(xiàn)其與臨床結(jié)局（包括全因死亡、急性心肌梗死、支架內(nèi)血栓和缺血性卒中）有關(guān)，ROC曲線也顯示其對(duì)缺血性事件復(fù)發(fā)無預(yù)測(cè)價(jià)值。目前有關(guān)于急性冠脈綜合征患者服用氯吡格雷作為二級(jí)預(yù)防的研究發(fā)現(xiàn)，PFA-200檢測(cè)結(jié)果可以作為隨訪過程中主要不良心臟事件發(fā)生的標(biāo)志物[19]。本研究暫未發(fā)現(xiàn)PFA-200在應(yīng)用氯吡格雷作為卒中二級(jí)預(yù)防的人群中預(yù)測(cè)缺血性卒中復(fù)發(fā)的價(jià)值。

有關(guān)出血事件結(jié)局，Breet團(tuán)隊(duì)[18]的研究未發(fā)現(xiàn)LTA、PFA具有識(shí)別缺血性卒中患者出血風(fēng)險(xiǎn)的能力。針對(duì)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療的患者藥物洗脫支架置入后傳統(tǒng)抗血小板治療和血小板功能實(shí)驗(yàn)監(jiān)控指導(dǎo)下調(diào)整治療隨機(jī)對(duì)照研究（Assessment by a Double Randomization of a Conventional Antiplatelet Strategy Versus a Monitoring-Guided Strategy for Drug-Eluting Stent Implantation and of Treatment Interruption Versus Continuation One Year After Stenting，ARCTIC）采用其他的血小板檢測(cè)實(shí)驗(yàn)（VerifyNow抗血小板治療監(jiān)測(cè)系統(tǒng)）評(píng)估血小板反應(yīng)性，血小板高反應(yīng)性組出血事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)與低反應(yīng)性組間無顯著差異[20]。本研究數(shù)據(jù)也顯示血小板功能實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果與一年的抗血小板藥物相關(guān)出血事件的發(fā)生無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。關(guān)于對(duì)缺血性卒中患者服用抗血小板藥物二級(jí)預(yù)防階段出血事件的預(yù)測(cè)指標(biāo)仍需進(jìn)一步探索。

本研究存在一些不足之處，如樣本量較小，可能存在統(tǒng)計(jì)把握度不足的問題，且所有樣本來自一個(gè)中心，可能存在病例選擇偏倚；另外，當(dāng)前血小板功能實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)劑及其濃度標(biāo)準(zhǔn)未統(tǒng)一，因此本研究的結(jié)果不一定適用于所有的臨床中心。因此需要進(jìn)一步統(tǒng)一檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的多中心研究驗(yàn)證本研究的結(jié)果。

【點(diǎn)睛】本研究通過LTA、TEG和PFA三種血小板功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)輕型缺血性卒中且規(guī)律服用氯 格雷的患者在服藥5 d后的血小板反應(yīng)性，并隨訪缺血性卒中復(fù)發(fā)的情況，結(jié)果顯示LTA和TEG檢測(cè)結(jié)果對(duì)缺血性卒中復(fù)發(fā)有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。