蔡藝菲 ，趙鑫陽 ，田曉靜 ，2*，宋 禮 ，羅 麗 ，丁功濤 ，2，曹 竑 ，2，陳士恩 ，2

（1. 西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730124；2. 西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心中國-馬來西亞國家聯(lián)合實驗室，甘肅蘭州730030；3. 甘南牦牛乳研究院，甘肅甘南747000）

我國年出欄生豬約7 億頭，屠宰生豬產(chǎn)生的副產(chǎn)物豬血約有200萬t[1]。豬血中含有大量的蛋白質(zhì)和豐富的氨基酸，包括人體所必需的8 種氨基酸在內(nèi)的18 種氨基酸，特別是賴氨酸、亮氨酸含量豐富[2]。豬血除少量直接食用外，其余豬血資源的利用率很低。血液排放后，極易腐爛變質(zhì)，滋生大量微生物，導(dǎo)致水源污染和農(nóng)田土質(zhì)惡化等問題。用酶解法對豬血紅蛋白進行處理，可以有效提高血蛋白的利用率[3]。研究表明，可以利用酶解豬血血紅蛋白制備血紅素、螯合肽、抗氧化肽、氨基酸液體肥等[4-8]。液體肥料又稱流體肥料，是含有一種或多種農(nóng)作物生長必需營養(yǎng)元素的液體肥。氨基酸是其主要成分之一。氨基酸液體肥生產(chǎn)成本低、高效、無污染。因此，研究豬血血紅蛋白的水解可以有效利用豬血，獲得巨大的經(jīng)濟效益，同時緩解廢棄血液帶來的環(huán)境污染。目前，國內(nèi)對利用酶解法水解豬血蛋白制備氨基酸液體肥的研究較少。因此，為了獲得更高效的水解工藝，本研究利用風(fēng)味蛋白酶水解豬血中的蛋白，優(yōu)化氨基酸液體肥的制備工藝的條件，研究較佳水解豬血蛋白的參數(shù)，為利用豬血生產(chǎn)氨基酸液體肥加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料與試劑：干燥豬血粉、風(fēng)味蛋白酶、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氫氧化鈉、對硝基苯酚、乙酸鈉、無水乙酸鈉、乙酸、37%甲醛、乙酰丙酮、酚酞、乙醇、鄰苯二甲酸氫鉀基準物質(zhì)。

儀器：SL-1001電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）、PHS-3C pH計（上海雷磁有限公司）、L3S可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）、恒溫干燥箱（日本日立公司）、722E型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

新鮮豬血抗凝處理，真空冷凍干燥制成豬血粉。

1.2.2 總氮的測定

參照GB 5009.5—2016，采用分光光度計法測定總氮（Nt）的含量。采用分光光度計法測定總蛋白（TP）含量。

1.2.3 氨基態(tài)氮測定

參照GB 5009.235—2016中酸度計法測定氨基態(tài)氮（N0）。

1.2.4 水解率測定

用甲醛滴定法測氨基態(tài)氮含量，按下式計算水解率（DH）。

1.2.5 單因素試驗

以水解率為指標，通過單因素試驗研究料液比（1∶6、1∶7.5、1∶9、1∶10.5、1∶12 g/mL）、酶添加量（4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g 蛋白）、pH 值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、溫度(40、45、50、55、60 ℃）和水解時間(2、3、4、5、6 h)對血液水解率的影響。

1.2.6 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用5 因素3 水平正交試驗優(yōu)化提取工藝，正交試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 Factor level table of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對血液水解率的影響（見圖1）

圖1 料液比對血液水解率的影響Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on blood hydrolysis rate

豬血紅蛋白的水解率起初隨著底物質(zhì)量濃度的增加而增加，之后水解率隨底物質(zhì)量濃度的增加有所降低，即此時酶與底物結(jié)合達到飽和，底物質(zhì)量濃度的增加不再提高反應(yīng)效率，反而因底物濃度過大，降低酶在溶液中的擴散能力；另一方面，過量底物可能通過分子間作用力與酶結(jié)合形成中間產(chǎn)物，抑制酶解反應(yīng)的進行，使得水解率降低[9]。在 pH 值7、酶濃度 8 000 U/g、溫度50 ℃、時間 4 h 的條件下，研究血液水解率隨料液比（1∶6.0、1∶7.5、1∶9.0、1∶10.5、1∶12.0 g/mL）的變化規(guī)律。由圖1 可知，料液比在1∶6.0~1∶7.5 g/mL 范圍內(nèi)，血液水解率隨料液比的減小而減小。料液比在1∶7.5~1∶9.0 g/mL 范圍內(nèi)，血液水解率隨料液比的減小而提高。料液比在1∶9.0~1∶10.5 g/mL 范圍內(nèi)，血液水解率隨料液比的減小而降低。料液比在1∶10.5~1∶12.0 g/mL 范圍內(nèi)，血液水解率隨料液比的減小而增大。在料液比為1∶9.0 g/mL 時，血液水解率最高。因此，選擇料液比為1∶9.0 g/mL作為較佳的料液比。

2.1.2 酶添加量對血液水解率的影響（見圖2）

蛋白酶促進蛋白的降解本質(zhì)是酶結(jié)合部位與蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基結(jié)合后，酶催化部位降低蛋白水解發(fā)生的活化能，會有酶的飽和與底物飽和的狀態(tài)。當?shù)孜锏牧窟^大，酶結(jié)合部位達到飽和，底物濃度增大不會增加水解的發(fā)生。當?shù)孜餄舛冗^飽和時，酶量的增加不會增加水解的發(fā)生，隨酶量的增加水解率效果與成本不成正比[10]。在料液比1∶9.0 g/mL、pH值7、溫度50 ℃、時間4 h的條件下，研究血液水解率隨酶添加量（4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g 蛋白）的變化規(guī)律。由圖2 可知，酶添加量在4 000~10 000 U/g 蛋白范圍內(nèi)，血液水解率隨酶添加量的增加而提高。酶添加量在10 000~12 000 U/g蛋白范圍內(nèi)，血液水解率隨酶添加量的增加而降低。在酶添加量10 000 U/g蛋白時，血液水解率最高。因此，選用酶添加量為10 000 U/g蛋白作為較佳的酶添加量。

圖2 酶添加量對血液水解率的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on blood hydrolysis rate

2.1.3 pH值對血液水解率的影響（見圖3）

蛋白酶只有在一定pH值范圍下才能達到較高的水解率，pH值偏低或偏高都會對水解效果產(chǎn)生較大的影響。過酸或過堿都會使蛋白酶逐漸變性失活，影響酶解效果[11]。在料液比 1∶9 g/mL、溫度 50 ℃、時間 4 h、酶添加量1 000 U/g 蛋白的條件下，研究血液水解率隨pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的變化規(guī)律。由圖3可知，pH值在6.0~6.5范圍內(nèi)，血液水解率隨pH 值的增大而提高。pH 值在6.5~8.0 范圍內(nèi)，血液水解率隨pH 值的增大而降低。在pH值為6.5時，血液水解率最高。因此，選用pH值為6.5時作為較佳的pH值。

圖3 pH值對血液水解率的影響Fig.3 Effect of pH on enzymatic hydrolysis

2.1.4 時間對血液水解率的影響（見圖4）

在水解前期蛋白酶的活力比較高，與底物結(jié)合水解率較大。隨著水解時間的延長，蛋白酶的活力下降，水解率也難以提高。在料液比1∶9 g/mL，溫度50 ℃，pH值6.5，酶添加量1 000 U/g蛋白的條件下，研究血液水解率隨水解時間（2、3、4、5、6 h)的變化規(guī)律。由圖4可知，時間在2~6 h范圍內(nèi)，血液水解率隨時間的增加而提高。在2~5 h 范圍內(nèi)水解率上升趨勢較明顯。在5~6 h 內(nèi)，水解率上升趨勢較小，此時間范圍內(nèi)水解率變化較小?？紤]節(jié)省時間成本和其他消耗成本，選用水解時間為5 h 作為較佳的水解時間。

圖4 時間對血液水解率的影響Fig.4 Effect of time on blood hydrolysis rate

2.1.5 溫度對血液水解率的影響（見圖5）

在蛋白酶的適宜溫度范圍內(nèi)有助于酶解反應(yīng)的進行，這是因為酶的作用速度隨溫度升高而加速，但溫度升高到一定限度后，酶的活性就要鈍化，直至完全失活。在料液比1∶9.0 g/mL、時間5 h、pH值6.5、酶添加量1 000 U/g蛋白的條件下，研究血液水解率隨水解溫度（40、45、50、55、60 ℃）的變化規(guī)律。由圖5可知，溫度在40~50 ℃范圍內(nèi)，血液水解率隨水解溫度的增大而提高。溫度在50~60 ℃范圍內(nèi)，血液水解率隨水解溫度的升高而降低。在水解溫度為50 ℃時，水解率最高。因此，選用水解溫度為50 ℃時作為較佳的水解溫度。

圖5 溫度對血液水解率的影響Fig.5 Effect of temperature on blood hydrolysis rate

2.2 正交試驗結(jié)果

本研究以pH 值、酶添加量、料液比、溫度、時間為因素，以水解率為指標，采用5因素3水平正交試驗優(yōu)化。正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。由表2可知，極差分析的結(jié)果表明，各因素影響順序依次為A>C>E>D>B，即pH 值對血紅蛋白酶水解產(chǎn)生主要作用，其次是料液比、時間、酶添加量和溫度。較佳提取參數(shù)為A?B?C?D?E?，即得到水解較佳條件為料液比1∶10.5 g/mL、pH 值6、水解溫度50 ℃、酶濃度12 000 U/g 蛋白、水解時間7 h，此時水解率為40.42%。由于酶種類不同，此試驗各項結(jié)果均高于其他文獻，同時水解率也略高。

表2 L18（35）正交試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.2 L18（35）orthogonal experimental design and results

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，各因素對血液水解影響的重要性順序為：pH值>料液比>時間>酶添加量>溫度。綜合考慮，風(fēng)味蛋白酶水解豬血紅蛋白制備氨基酸液體肥的最佳工藝條件為：料液比 1∶10.5、pH 值6、水解溫度50 ℃、酶濃度12 000 U/g蛋白、水解時間7 h。