王 冉，呂俊凡，吳自豪，陳 偉

（塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾843300）

腸道致病性大腸桿菌是引起奶牛乳腺炎的重要致病菌，不同地區(qū)大腸桿菌分離情況存在地區(qū)差異[1-3]。大腸桿菌內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）具有熱穩(wěn)定性，其在原料乳中的殘留可對動物性食品安全造成潛在風險，限制中國奶業(yè)的健康發(fā)展[4]。目前，大腸桿菌所引起的動物和人腸道腹瀉的致病機制已經(jīng)較為清晰，但作為奶牛乳腺致病菌的感染機制尚不清楚。

Crp（cAMP receptor protein）是 cAMP 的受體蛋白，由基因crp編碼。cAMP作為細菌中普遍存在的第一信使，可以調(diào)控毒力基因表達，調(diào)控細菌胞外多糖合成，從而影響細菌生物被膜形成[5]。Crp 與cAMP 結(jié)合后形成cAMPCrp 復合體，可促進TCA 循環(huán)，調(diào)控代謝途徑的多個基因[6]。因此，Crp蛋白在病原菌致病性、毒力因子產(chǎn)生等方面發(fā)揮重要作用。

本研究組于2017 年從患牛乳樣中分離獲得1 株大腸桿菌，命名為NJ17，是一種腸致病型大腸桿菌（EPEC）。為探究crp基因?qū)δ膛Ｈ橄僭创竽c桿菌NJ17 生物被膜形成能力的影響，本研究采用λ-Red同源重組技術(shù)，構(gòu)建crp基因缺失株，并對其生長速率和生物被膜形成能力進行分析，為后續(xù)進一步研究crp基因功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

奶牛乳腺源大腸桿菌NJ17（EPEC）由乳腺炎患牛體內(nèi)分離獲得。大腸桿菌DH5α 購自大連寶生物工程有限公司。pKD3（氯霉素抗性）、pKD46（卡那霉素抗性）由上海獸醫(yī)研究所饋贈。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基用于細菌的常規(guī)培養(yǎng)，SOC培養(yǎng)基用于電轉(zhuǎn)化后的菌株復蘇。λ-Red 重組酶誘導表達，需添加10 mmol/L阿拉伯糖。除含有質(zhì)粒pKD46的菌株培養(yǎng)溫度為30 ℃外，其余培養(yǎng)條件及質(zhì)粒pKD46的消除均在37 ℃條件下進行。

1.3 PCR擴增

試驗用于PCR擴增的引物見表1，引物由上海悉尼生物科技有限公司合成。參考文獻[7-9]，以pKD3為模板，用引物NJ17Crp-CF/CR擴增氯霉素抗性片段；以大腸桿菌NJ17基因組為模板，用引物NJ17Crp-UF/UR、NJ17Crp-DF/DR擴增crp基因上下游同源臂；片段均切膠回收，按一定比例混合后作模板，用NJ17Crp-UF/DR擴增打靶片段。

表1 大腸桿菌NJ17缺失株構(gòu)建及鑒定引物Tab.1 Primers of E.coli NJ17 crp-mutant construction and identification

1.4 電轉(zhuǎn)化與突變株鑒定

按常規(guī)方法制備感受態(tài)細胞[8]。電轉(zhuǎn)產(chǎn)物分別為含有重組酶系統(tǒng)的pKD46 和打靶片段。電轉(zhuǎn)條件為1.8 kV、1~6 ms、SOC 培養(yǎng)基 30 ℃（電轉(zhuǎn)產(chǎn)物為 pKD46）或 37 ℃（電轉(zhuǎn)產(chǎn)物為打靶片段）、復蘇1 h，涂布于適宜篩選平板。使用外側(cè)鑒定引物NJ17 Crp-UF/DR 和內(nèi)側(cè)鑒定引物NJ17 Crp-UF/CR對缺失株進行鑒定。

1.5 生長曲線及生物被膜測定

參考文獻[8,10]將大腸桿菌NJ17 野生株和crp缺失株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（OD600nm約2.0），以1∶100 接種至含有100 mL LB 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)，每 1 h 取樣測量 1 次，繪制菌株生長曲線，試驗重復3次。

生物被膜的測定方法參照文獻[8,11]，將大腸桿菌NJ17 野生株和crp缺失株在LB 培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)過夜后，離心收集菌體，LB 培養(yǎng)液稀釋調(diào)整至OD600nm為0.1，將每種菌株懸液 200 μL 加至 96 孔板，37 ℃孵育36 h 后，PBS 洗滌3 次，用0.1%結(jié)晶紫室溫染色30 min。PBS 沖洗 3 次后，加入 100 μL 95%乙醇溶解結(jié)晶紫，使用酶標儀測定595 nm 處的結(jié)晶紫溶液光密度（OD595nm），每組樣品重復6 次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 17.0的t檢驗對數(shù)據(jù)進行差異性分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛乳腺源大腸桿菌NJ17 crp 基因缺失株的鑒定（見圖1）

由圖1可知，內(nèi)側(cè)鑒定引物NJ17Crp-UF/CR可從缺失株中擴增出1 891 bp的片段，而野生株無法擴增到條帶；外側(cè)鑒定引物NJ17Crp-UF/DR 可從野生株擴增到1 857 bp片段，從缺失株擴增到2 143 bp 的片段。兩對鑒定引物PCR擴增結(jié)果與預期大小一致，表明大腸桿菌NJ17crp缺失株NJ17-Δcrp構(gòu)建成功。

圖1 奶牛乳腺源大腸桿菌NJ17 crp基因缺失株P(guān)CR鑒定Fig.1 PCR identification of E.coli NJ17 crp-mutant

2.2 野生株和缺失株生長速率檢測結(jié)果（見圖2）

由圖2 可知，突變株生長速率極顯著低于野生株（P<0.01）。野生株在2 h左右進入對數(shù)生長期，靜止期OD600nm可達6。而突變株對數(shù)生長期較平緩，最高OD600nm約3，明顯低于野生株，說明crp基因影響大腸桿菌NJ17的生長。

2.3 野生株和缺失株生物被膜形成能力檢測結(jié)果（見圖3）

由圖3可知，與野生株NJ17菌株相比，crp基因缺失株生物被膜形成能力顯著降低（P<0.05）。

圖2 野生株和缺失株的生長曲線Fig.2 Growth curve of E.coli NJ17 wildtype and crp-mutant type

圖3 野生株和缺失株生物被膜形成能力Fig.3 Biofilm formation of E.coli NJ17 wildtype and crp-mutant type

3 討論

生物被膜形成能力檢測已成為奶牛乳腺源大腸桿菌臨床分離株生物學背景研究的重要內(nèi)容。本試驗結(jié)果表明，crp基因缺失株生長速率明顯低于野生株，而細菌生長特性是影響大腸桿菌早期感染乳腺能力的一個重要因素。因此，crp基因在大腸桿菌早期感染乳腺組織可能發(fā)揮重要作用。研究表明，第二信使c-di-GMP 代謝相關(guān)基因缺失對奶牛乳腺源性大腸桿菌NJ17 的生長特性無顯著影響，說明第二信使的信號傳遞可能與大腸桿菌中、晚期感染乳腺組織有關(guān)[12]。

研究表明，同一種細菌，其生物被膜狀態(tài)下比浮游狀態(tài)下對同一種抗生素的抵抗力要高10~1 000 倍[13]。大腸桿菌生物被膜的形成會增強其對抗生素的抵抗力，導致宿主抗生素治療失敗，從而引起宿主的持續(xù)性感染[14]。而cAMP-Crp途徑調(diào)控細菌抗生素耐藥基因的表達[15]。本研究結(jié)果表明，crp基因缺失降低了奶牛源性大腸桿菌NJ17的生物被膜形成能力，說明CRP-cAMP代謝參與調(diào)控大腸桿菌生物被膜形成，所調(diào)控的代謝途徑可作為抗生物被膜制劑研發(fā)的靶標。

綜上所述，crp基因缺失影響奶牛乳腺源大腸桿菌NJ17 的生長特性和生物被膜形成。因此，crp基因?qū)Υ竽c桿菌的特性具有重要調(diào)控作用，推測其可能在大腸桿菌早期感染宿主細胞中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

通過構(gòu)建奶牛乳腺源大腸桿菌NJ17的crp突變株，crp基因缺失影響大腸桿菌NJ17 的生長，同時生物被膜形成能力明顯降低。