龐遠(yuǎn)祥,謝遠(yuǎn)紅,金君華,劉慧,張紅星

(北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院,食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,102206)

納豆激酶(nattokianse，NK)是在納豆發(fā)酵過(guò)程中由納豆枯草桿菌(Bacillussubtilisnatto)產(chǎn)生的一種具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶[1]，因可用于治療血栓、高血壓、阿爾茨海默氏病和玻璃體視網(wǎng)膜等領(lǐng)域而被廣泛關(guān)注[2-9]。

食物中主要含有4種嘌呤，分別為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤，而人體痛風(fēng)是由于長(zhǎng)期嘌呤代謝障礙、血尿酸升高引起組織損傷的一類疾病[10]。然而，多種NK凍干粉產(chǎn)品中均具有較高含量的嘌呤類物質(zhì)，不利于痛風(fēng)患者的食用。目前，對(duì)NK研究主要集中在具有高酶活性微生物的篩選[11]、新型酶的純化以及特性研究[12-13]。因此，篩選出一種具有高NK酶活性、低嘌呤含量的發(fā)酵菌株，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高NK酶活性、低嘌呤產(chǎn)量的枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)品奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大醬,四川大涼山農(nóng)戶。

1.2 培養(yǎng)基

酪蛋白平板培養(yǎng)基(g/L)：酪蛋白胨20,葡萄糖5,K2HPO4·3H2O 1,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.1,瓊脂15,pH 7.0,121 ℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl 10(固體培養(yǎng)基加15 g/L 瓊脂),121 ℃滅菌15 min。

初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20,乳糖20,Na2HPO4·12H2O 5,NaH2PO4·2H2O 1,CaCl20.2,MgSO4·7H2O 0.5,pH 7.0,121 ℃滅菌15 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌的篩選

產(chǎn)NK菌株篩選：取1 g大醬,放入裝有9 mL 無(wú)菌生理鹽水的試管中振蕩5 min,沸水浴加熱10 min,10 000 r/min離心5 min,取上清液進(jìn)行梯度稀釋,以劃線分離法將上清液涂布于酪蛋白平板上,放入恒溫培養(yǎng)箱中,37 ℃培養(yǎng)24 h觀察平板透明圈直徑大小并進(jìn)行測(cè)量,選取透明圈直徑大者轉(zhuǎn)接LB斜面培養(yǎng)。

搖瓶篩選：取初篩所得菌株接種于LB 培養(yǎng)基中,37 ℃,180 r/min 恒溫培養(yǎng)12 h,接入液體種子培養(yǎng)基,37 ℃,180 r/min 恒溫培養(yǎng)12 h。按2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量將種子液接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃,180 r/min 恒溫培養(yǎng)24 h,測(cè)定發(fā)酵液NK酶活力及嘌呤含量。

1.3.2 NK酶活力及嘌呤含量測(cè)定方法

1.3.2.1 NK酶活力測(cè)定

采用酪蛋白消化法[14]測(cè)定發(fā)酵液中NK酶活力。

粗酶液制備：將發(fā)酵獲得的菌液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min,取上清液經(jīng)過(guò)0.22 μm膜過(guò)濾即為粗酶液。

酶反應(yīng)：取1 mL粗酶液,加入2 mL 0.5%酪蛋白,混合均勻,40 ℃ 孵育10 min；加入3 mL 10% 三氯乙酸終止反應(yīng),8 000 r/min離心5 min。設(shè)立對(duì)照組,對(duì)照組為加入酶液前加入3 mL 三氯乙酸。

顯色反應(yīng)：取1 mL酶反應(yīng)液,加入5 mL 0.55 mol/L NaCO3溶液和1 mL福林酚溶液,迅速混勻,40 ℃ 恒溫水浴中顯色20 min,測(cè)定吸光度(A680)。

酶活力定義：1 min內(nèi)形成1 μg酪氨酸所需的NK劑量。

1.3.2.2 嘌呤含量測(cè)定

采用高效液相色譜法[15]對(duì)發(fā)酵液中的嘌呤含量進(jìn)行檢測(cè)。

前處理：取2 mL發(fā)酵上清液于25 mL具塞管中,加入2 mL 3 mol/L硫酸溶液,加塞后立即置于沸水浴水解10 min,冰浴冷卻,調(diào)pH至2.0～8.0,定容至10 mL。再以0.22 μm針式過(guò)濾頭過(guò)濾,即得待測(cè)樣品,備用。

色譜條件：色譜柱：ZORBAX NH2(4.6 mm×250 mm,5.0 μm)；流動(dòng)相：A相,10 mmol/L乙酸銨,B相,乙腈；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

1.3.3 菌種鑒定

通過(guò)16S rRNA序列對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。采用TIANamp細(xì)菌DNA試劑盒提取總DNA。使用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,退火溫度55 ℃,復(fù)性30 s,72 ℃延伸5 min,進(jìn)行34個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST(NCBI)比對(duì)分析。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

(1)培養(yǎng)基碳源優(yōu)化：以初始培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉和甘油為碳源,測(cè)定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(2)培養(yǎng)基氮源優(yōu)化：在現(xiàn)有優(yōu)化基礎(chǔ)上,分別使用胰蛋白胨、酪蛋白胨、大豆蛋白胨和蛋白胨,測(cè)定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(3)培養(yǎng)基接種量?jī)?yōu)化：以初始培養(yǎng)基為基礎(chǔ),將種子液以不同接種量(體積分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,測(cè)定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(4)培養(yǎng)基初始pH優(yōu)化：在現(xiàn)有優(yōu)化基礎(chǔ)上,改變發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH(5、6、7、8、9),測(cè)定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(5)培養(yǎng)溫度優(yōu)化：在現(xiàn)有優(yōu)化基礎(chǔ)上,調(diào)整發(fā)酵溫度(31、33、35、37、39 ℃),測(cè)定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(6)培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化：在現(xiàn)有優(yōu)化基礎(chǔ)上,調(diào)整發(fā)酵時(shí)間(24、36、48、60、72 h),測(cè)定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

1.3.5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Design-expert軟件進(jìn)行n=12的 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì),其各因素與水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.3.6 最陡爬坡試驗(yàn)

爬坡試驗(yàn)依據(jù) Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果確定各顯著影響因素及正負(fù)效應(yīng),設(shè)定步長(zhǎng)及變化方向,以快速逼近最佳區(qū)域。

1.3.7 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)

利用最陡爬坡試驗(yàn)得出中心點(diǎn),設(shè)計(jì)3因素3水平優(yōu)化試驗(yàn),采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各因素與水平如表2所示。

表2 Box-Behnken design 試驗(yàn)因素與水平Table 2 Levels and factors of Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

酪蛋白平板篩選得到3株產(chǎn)透明圈菌株,搖瓶發(fā)酵分別測(cè)定其NK酶活力和嘌呤含量,SH21酶活力最高,嘌呤含量最低(表3)。

表3 三種菌株發(fā)酵液中納豆激酶活性和嘌呤含量的比較Table 3 Comparison of nattokinase activity and purine of the three strains

對(duì)SH21進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)生了一段1 378 bp的DNA片段。經(jīng)BLAST比對(duì),發(fā)現(xiàn)與枯草芽孢桿菌(Genbank：MK860024)和枯草芽孢桿菌(Genbank：KP717559)的16S rDNA基因序列具有100%的同源性,結(jié)合其形態(tài)和生理特性,SH21被鑒定為枯草芽孢桿菌(Genbank：MN756647)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 最佳碳源的確定

不同碳源對(duì)NK酶活力及嘌呤含量的影響如圖1-a所示。當(dāng)碳源為葡萄糖時(shí)酶活力最高,為165.77 U/mL,嘌呤含量為91.54 mg/L；而碳源為蔗糖時(shí)嘌呤含量?jī)H為43.01 mg/L,酶活力為134.04 U/mL,綜合考慮選擇蔗糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

a-碳源種類對(duì)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶和嘌呤的影響；b-氮源種類對(duì)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶和嘌呤的影響；c-pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶和嘌呤的影響；d-接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶和嘌呤的影響；e-溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶和嘌呤的影響；f-時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶和嘌呤的影響圖1 各因素對(duì)酶活力以及嘌呤含量的影響Fig.1 The influence of various factors on enzyme activity and purine content

2.2.2 最佳氮源的確定

對(duì)于氮源而言(圖1-b),酶活力最高為酪蛋白胨，其值達(dá)到160.07 U/mL。其主要原因在于前期篩菌時(shí)采用的氮源為酪蛋白胨,因此對(duì)菌株具有一定的馴化作用[16],故以酪蛋白胨為氮源時(shí)酶活力較為顯著。而嘌呤含量雖以胰蛋白胨為氮源時(shí)嘌呤含量最低,但其相差不是很大,在21.78～39.33 mg/L之間,綜合比較選取酪蛋白胨作為最佳氮源。

2.2.3 最佳pH的確定

pH對(duì)酶活力和嘌呤影響如圖1-c所示。隨著pH的升高,酶活力先上升后下降,而嘌呤先下降然后上升后下降。當(dāng)pH為7時(shí),酶活力最高,為119.19 U/mL,而嘌呤含量雖然以pH為9時(shí)其嘌呤含量最低,但其差異不顯著,同時(shí)考慮到NK在中性條件下酶活力較為穩(wěn)定[17],且該 pH 條件下適宜枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng),故pH取7。

2.2.4 最佳接種量的確定

接種量在1%～3% 時(shí),酶活力逐漸增加,嘌呤含量下降。當(dāng)接種量大于3%,酶活性降低,嘌呤含量增加(圖1-d)。接種量在1%～3% 時(shí),隨著接種量的增加,菌體繁殖速度加快,酶活也相應(yīng)增加,當(dāng)接種量大于3% 后,由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏導(dǎo)致其生命活力逐漸降低,酶活力也相應(yīng)降低[16]。故接種量設(shè)為3%。

2.2.5 最佳發(fā)酵溫度的確定

溫度對(duì)酶活力和嘌呤影響如圖1-e所示。隨著溫度的提高,酶活力逐漸增加,在37 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值(128.96 U/mL),此時(shí)嘌呤含量為45.77 mg/L,隨后酶活力開(kāi)始下降,嘌呤含量開(kāi)始增加。故發(fā)酵溫度設(shè)為37 ℃。

2.2.6 最佳發(fā)酵時(shí)間的確定

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)NK酶活力及嘌呤含量的影響如圖1-f所示。在24～48 h時(shí),酶活力逐漸增加,嘌呤含量逐漸下降。之后,隨著時(shí)間增加,酶活力降低,嘌呤含量增加,推測(cè)發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng),菌體生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期,甚至產(chǎn)生自溶,使得大量DNA釋放,導(dǎo)致酶活力下降,進(jìn)而產(chǎn)生更多的嘌呤類物質(zhì)[18]。因此最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果與分析

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表5方差分析結(jié)果可知,酶活力模型的P值 0.001<0.05,模型選擇正確。接種量、pH、發(fā)酵溫度的P值均小于0.05,對(duì)NK酶活力影響顯著,發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活力影響不顯著；嘌呤模型的P值為0.010 6<0.05,模型選擇正確,各變量P值均小于0.05,對(duì)嘌呤影響均顯著。綜合考慮選擇接種量、pH和發(fā)酵溫度進(jìn)行下一步的優(yōu)化。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of Plackett-Burman experiments

表5 方差分析結(jié)果Table 5 The results of ANOVA

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

以接種量、pH和發(fā)酵溫度為自變量,各因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表6所示。接種量2.5%,pH 6.5,發(fā)酵溫度38 ℃時(shí),酶活力最高,嘌呤含量最低。因此,以第4組試驗(yàn)水平作為 Box-Behnken中心點(diǎn),進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of steepest ascent experiment

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

表7 Box-Behnken design 試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of Box-Behnken design experiments

方差分析結(jié)果如表8和表9所示。所選模型P值均小于0.01,差異極顯著,說(shuō)明回歸方程模型具有高度顯著性；失擬項(xiàng)P值均大于0.05,差異不顯著,說(shuō)明模型對(duì)試驗(yàn)擬合程度良好；相關(guān)系數(shù)R2均在0.9以上,可以預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表8 酶活力回歸模型的方差分析Table 8 Variance analysis (ANOVA) of enzyme activity regression model

表9 嘌呤回歸模型的方差分析Table 9 Variance analysis (ANOVA) of purine content regression model

2.5.2 模型預(yù)測(cè)與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design-expert軟件,分析3種顯著因素(接種量、pH、溫度)的響應(yīng)面和等高線。預(yù)測(cè)得到發(fā)酵培養(yǎng)基最佳參數(shù)為接種量3%,pH 6.0,溫度37.93 ℃,理論最高酶活力可達(dá)到202.53 U/mL,嘌呤含量最低為50.068 mg/L?？紤]實(shí)際限制,將發(fā)酵溫度調(diào)整為38 ℃。為了驗(yàn)證響應(yīng)面分析的可靠性,利用上述最佳參數(shù)進(jìn)行3次平行驗(yàn)證,實(shí)際測(cè)定酶活力為204.52 U/mL,嘌呤含量為51.27 mg/L,接近模型預(yù)測(cè)。

3 結(jié)論

通過(guò)兩步法從大醬中篩選得到1株低嘌呤、高酶活力的枯草芽孢桿菌SH21,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選得到pH、接種量和發(fā)酵溫度這3個(gè)顯著因素,利用 Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)確定最優(yōu)發(fā)酵條件,確定了優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為20 g/L蔗糖、20 g/L酪蛋白胨、5 g/L Na2HPO4·12H2O、1 g/L NaH2PO4·2H2O、0.2 g/L CaCl2、0.5 g/L MgSO4·7H2O；優(yōu)化后的發(fā)酵條件為pH 6.0,接種量3%,發(fā)酵溫度38 ℃,發(fā)酵時(shí)間 48 h,在此條件下,NK酶活力提高了1.22倍,嘌呤含量降低了32%,本研究提高了產(chǎn)酶水平并降低了生產(chǎn)成本,為開(kāi)發(fā)高NK酶活性、低嘌呤產(chǎn)量的枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)品奠定研究基礎(chǔ)。