付春艷,吳殿輝,謝廣發(fā),陸健*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 4(浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州,310015)

黃酒是以糯米、粳米等為原料,麥曲等糖化劑和酵母等發(fā)酵劑為輔料,經(jīng)雙邊發(fā)酵釀造而成的低酒精度飲料酒[1]。麥曲為黃酒的釀造過程提供淀粉酶和蛋白酶等豐富的酶系,還含有豐富的微生物及其代謝產(chǎn)物[2-4]。然而,麥曲的苦澀味影響了消費者飲用的舒適度[5]。因此,需要一種酒體清亮、口感清爽、風(fēng)味柔和的清爽型黃酒來滿足現(xiàn)代人的消費喜好。

由于傳統(tǒng)黃酒工藝十分復(fù)雜,生產(chǎn)周期較長,出酒率低[6],將酶制劑和液化法相結(jié)合生產(chǎn)黃酒的方式已成為生產(chǎn)黃酒的新工藝[7-8]。但在液化法生產(chǎn)黃酒的過程中,不僅缺少了含酸的漿水來調(diào)節(jié)酒醅的酸度,而且在發(fā)酵過程未添加麥曲,缺少了產(chǎn)酸微生物,這就需要接種調(diào)酸微生物來調(diào)節(jié)黃酒中的總酸含量。黃酒中有機(jī)酸主要是由乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸菌與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)共同參與黃酒的發(fā)酵,是黃酒釀造的最重要的2種微生物[9-10]。

本試驗以液態(tài)法黃酒釀造工藝為研究基礎(chǔ)[11],開發(fā)一種不添加麥曲,而是利用生物酶制劑對釀造原料先進(jìn)行糖化,再接種微生物進(jìn)行發(fā)酵的新型黃酒釀造方法。以黃酒的基本理化指標(biāo)及感官評價為依據(jù),篩選黃酒釀造用乳酸菌,優(yōu)化淀粉的液化、蛋白休止、糖化、釀酒酵母和乳酸菌協(xié)同混合發(fā)酵工藝,釀造一種酒體清亮、口感清爽、風(fēng)味柔和、符合現(xiàn)代人消費嗜好的清爽型干黃酒,為黃酒釀造提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米,無錫當(dāng)?shù)爻校荒透邷卅?淀粉酶、中性蛋白酶、糖化酶,帝斯曼(中國)有限公司；生麥曲、黃酒發(fā)酵液,紹興某酒廠；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)N85,中國黃酒國家工程研究中心(紹興)。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離

取黃酒后酵時期的發(fā)酵醪液,在含有CaCO3指示劑的MRS固體培養(yǎng)基上,37 ℃厭氧培養(yǎng)3 d；可由有無透明圈來判斷是否為產(chǎn)酸菌,再挑取不同形態(tài)特征的單菌落進(jìn)行純化。

1.2.2 黃酒釀造用乳酸菌的篩選

將分離篩選出的乳酸菌進(jìn)行黃酒釀造,以黃酒的理化指標(biāo)和感官評價[12]為依據(jù),選取最適的黃酒釀造用乳酸菌。

1.2.3 乳酸菌的分子學(xué)鑒定

將乳酸菌的16S rDNA序列通過NCBI BLAST與Gene bank中已知細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對,再利用MEGA6軟件建立該菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹[13]。

1.2.4 黃酒釀造工藝的單因素試驗

黃酒初始釀造工藝：2目的糯米粉,料水比為1∶2.5(g∶mL),α-淀粉酶添加量10 U/g,95 ℃液化70 min；中性蛋白酶添加量為1 050 U/g,50 ℃酶解120 min；糖化酶添加量60 U/g,60 ℃糖化2.5 h。向米汁中接入1.2×107CFU/mL釀酒酵母N85和4.8×105CFU/mL植物乳桿菌,30 ℃發(fā)酵。當(dāng)酒體失重<0.2 g時,黃酒前酵完成,再轉(zhuǎn)入15 ℃生化培養(yǎng)箱,靜置發(fā)酵14 d。

從料水比、α-淀粉酶添加量、液化時間、糖化酶添加量、糖化時間、釀酒酵母接種時間、釀酒酵母接種量、乳酸菌接種量8個因素對黃酒工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 響應(yīng)面試驗

通過Design-Expert V8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到最優(yōu)解,再進(jìn)行驗證,確定黃酒最佳工藝參數(shù)。

1.2.6 傳統(tǒng)工藝黃酒的釀造

以黃酒最佳工藝的料水比和釀酒酵母接種量為基礎(chǔ),進(jìn)行傳統(tǒng)工藝干黃酒的釀造[12]。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 25進(jìn)行,每個試驗均重復(fù)3 次,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,并進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒釀造用乳酸菌的篩選

從黃酒發(fā)酵液中分離到形態(tài)不一,差異性較大的7株乳酸菌,編號為F1～F7。將篩選出的7株菌用于黃酒釀造,其相關(guān)指標(biāo)如表1所示。菌株F2釀造的黃酒各指標(biāo)與其他組均有顯著差異(P<0.05)。在酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮、感官得分方面,菌株F2與菌株F5均占有較大優(yōu)勢,其中,F2釀造的黃酒的氨基酸態(tài)氮和感官得分均最高。綜合整體因素,選擇菌株F2作為黃酒釀造用乳酸菌最為合適。

表1 不同乳酸菌釀造的黃酒的相關(guān)指標(biāo)Table 1 Related indexes of Huangjiu brewed by different lactic acid bacteria strains

2.2 乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹的建立

將菌株F2的16S rDNA序列與NCBI基因數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性分析,分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1。該菌株與登錄號為MT613628的植物乳桿菌處于同一分支,再根據(jù)同源性分析,該菌株與登錄號為MT613628、NR_042254、MW165843的植物乳桿菌同源性為100%。根據(jù)上述結(jié)果可知,可確定該菌株為植物乳桿菌。

圖1 乳酸菌16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria on 16S rDNA genes

2.3 單因素試驗

2.3.1 淀粉液化工藝控制點的選擇

由圖2可知,隨著料水比的減小,米汁總糖和黃酒總糖含量均呈逐漸下降的趨勢,這是由于原料稀釋倍數(shù)逐漸增加的緣故。酒精度隨料水比的減小先小幅度上升后呈下降的趨勢,這可能是由于料水比太高時,醪液粘度大,水解不徹底,導(dǎo)致發(fā)酵不徹底。米汁總糖和黃酒酒精度隨著α-淀粉酶的增加均隨之上升,當(dāng)酶量超過10.0 U/g后,兩指標(biāo)的變化不顯著(P<0.05)。在液化時間為30～50 min范圍內(nèi),隨著時間的增加,淀粉酶與糯米的接觸和反應(yīng)較充分,產(chǎn)生的寡糖含量增加,黃酒酒精度也相應(yīng)地上升；液化時間超過50 min后,兩指標(biāo)含量趨于平穩(wěn)。綜合經(jīng)濟(jì)因素,液化工藝中選定料水比為1∶2.5(g∶mL),α-淀粉酶添加量為7.5～10.0 U/g,液化時間為50 min。

a-料水比對米汁總糖和黃酒指標(biāo)的影響;b-α-淀粉酶對米汁總糖和黃酒指標(biāo)的影響;c-液化時間對米汁總糖和黃酒指標(biāo)的影響圖2 淀粉液化工藝對米汁總糖和黃酒指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of starch liquefaction process on the total sugar of rice juice and the indexes of Huangjiu

2.3.2 淀粉糖化工藝控制點的選擇

從圖3可知,米汁總糖含量隨糖化酶的增加先迅速升高,超過60 U/g后,米汁總糖含量增幅不顯著(P<0.05)。酒精度隨酶量的變化趨勢與米汁總糖相近,黃酒總糖含量隨酶量的增加在60 U/g前逐漸下降,60 U/g后無顯著差異(P<0.05)。米汁總糖含量在糖化過程中隨糖化時間的增加在3 h前逐漸升高,3 h后趨于穩(wěn)定。這表明隨著糖化時間的延長,酶與底物充分接觸,還原糖含量增加。黃酒酒精度隨糖化時間增加先迅速升高,3 h后無顯著差異(P<0.05)。綜上所述,選定60 U/g為最佳糖化酶添加量,3 h為最佳糖化時間。

a-糖化酶添加量對米汁總糖和黃酒指標(biāo)的影響;b-糖化時間對米汁總糖和黃酒指標(biāo)的影響圖3 淀粉糖化工藝對米汁總糖和黃酒指標(biāo)的影響Fig.3 Effect of starch saccharification process on the total sugar of rice juice and the indexes of Huangjiu

2.3.3 發(fā)酵工藝的單因素試驗

在黃酒發(fā)酵過程中,先向米汁中接種乳酸菌,再設(shè)定不同的釀酒酵母接種時間,研究其對黃酒指標(biāo)的影響。由圖4可知,黃酒總酸含量隨酵母接種時間的延長在12 h前迅速增加,12 h時,總酸含量達(dá)到12.82 g/L。

a-釀酒酵母接種時間對黃酒指標(biāo)的影響;b-釀酒酵母接種量對黃酒指標(biāo)的影響;c-植物乳桿菌接種量對黃酒指標(biāo)的影響圖4 發(fā)酵工藝對黃酒指標(biāo)的影響Fig.4 Effect of fermentation process on the indexes of Huangjiu

酒精度隨酵母接種時間的延長在12 h前迅速下降,12～36 h范圍內(nèi),下降幅度變緩,36 h后,變化幅度不顯著(P<0.05)。綜上所述,釀酒酵母和植物乳桿菌同時接種最佳。在釀酒酵母和植物乳桿菌同時接種的情況下,隨著釀酒酵母接種量的增加,黃酒的酒精度和總酸含量變化幅度均無顯著差異(P<0.05)。因此,采取黃酒初始釀造工藝的釀酒酵母接種量。

由圖4-c可知,黃酒總酸含量隨著植物乳桿菌的增加而升高,當(dāng)菌體超過19.2×105CFU/mL后,總酸含量增幅不顯著(P<0.05)。黃酒酒精度隨著菌體的增加而逐漸下降,這可能是由于乳酸菌的增加,總酸也逐漸增加,酵母的生長代謝受到抑制,酒精度也隨之下降[14]。根據(jù)黃酒國家標(biāo)準(zhǔn)中(GB/T 13662—2008)優(yōu)質(zhì)清爽型半干黃酒的總酸含量為2.5～7.0 g/L的規(guī)定,植物乳桿菌接種量在0.6×105～4.8×105CFU/mL范圍內(nèi)最佳。

2.4 響應(yīng)面試驗及驗證結(jié)果

以黃酒的酒精度(Y1)和總酸(Y2)為響應(yīng)值,料水比、α-淀粉酶添加量、糖化酶添加量、乳酸菌接種量為響應(yīng)因素,對黃酒的制備工藝進(jìn)一步優(yōu)化,結(jié)果如表2所示。對表2中的試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合后,得到相應(yīng)的回歸方程：

表2 黃酒制備工藝響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology of Huangjiu preparation process

Y1=13.80+1.42A+0.05B+0.50C-0.09D+0.62AB+0.17AC+0.46AD-0.27BC+0.17BD+0.03CD-0.71A2-0.47B2-0.84C2+2.50×10-3D2；

Y2=3.84-0.59A+0.20B-0.25C+0.70D+0.03AB-0.10AC-0.08AD-0.46BC-0.01BD-0.06CD+0.32A2+0.04B2+ 0.07C2-0.28D2。

通過表3可知,2個模型Y1和Y2的P值都<0.000 1,表明2回歸模型差異極顯著。失擬誤差在0.05水平上不顯著(P= 0.261 0>0.05和P=0.106 2>0.05),表明試驗結(jié)果與回歸模型之間具有良好的擬合度。相關(guān)系數(shù)R2分別為0.942 4和0.961 9,表明該模型與實際試驗的擬合度較好。F值越大,各因素對酒精度和總酸的影響越強。因此,4個因素對黃酒酒精度和總酸的影響次序分別為A>C>D>B和D>A>C>B。

表3 響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果

通過Design-Expert V 8.0.6軟件對黃酒的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化分析后,得到最佳條件為：料水比為1∶2.0(g∶mL),α-淀粉酶添加量為12.5 U/g,糖化酶添加量為41.36 U/g,植物乳桿菌接種量為 2.4×105CFU/mL,黃酒酒精度和總酸含量的預(yù)測值分別為14.13%和5.04 g/L。利用上述條件進(jìn)行3組平行驗證試驗后,得到的黃酒酒精度和總酸的實際值分別為(13.96±0.18)%和(5.12±0.10)g/L,與預(yù)測值的相對誤差分別為1.20%和1.59%,進(jìn)一步說明本模型的擬合度較好。

采用優(yōu)化工藝釀制的黃酒酒精度為13.96%,總酸為5.12 g/L,總糖為8.80 g/L,氨基酸態(tài)氮為0.32 g/L,非糖固形物為26.38 g/L。從表4可知,清爽型干黃酒的總高級醇和總酯分別為6 303.42 μg/L和967.04 μg/L,與黃酒1相比,總酯提高了15.35%,與黃酒2相比,總高級醇提高了57.73%。其中,癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、棕櫚酸乙酯相比黃酒1和黃酒2較高,這主要是由于在發(fā)酵過程中,酸性物質(zhì)在釀酒酵母中的乙酰轉(zhuǎn)移酶等酶類作用下與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成的。清爽型干黃酒的酒體清亮,口感清爽,柔凈醇和,符合黃酒國標(biāo)GB/T 13662—2018中清爽型干黃酒的要求。

表4 不同清爽型干黃酒的揮發(fā)性物質(zhì)濃度及感官評價Table 4 Concentration of volatile compounds and sensory evaluation in different Huangjiu with light aroma

3 結(jié)論

從黃酒發(fā)酵液中分離出7株乳酸菌,根據(jù)黃酒的理化指標(biāo)和感官評價為依據(jù),進(jìn)一步篩選出最適黃酒釀造用乳酸菌菌株F2(植物乳桿菌)。以糯米為原料,采用液態(tài)法釀造黃酒,通過單因素和中心組合試驗,獲得最佳釀造工藝條件為：料水比為1∶2.0、α-淀粉酶添加量為12.5 U/g,液化50 min；中性蛋白酶添加量為1 050 U/g,酶解120 min；糖化酶添加量為41.36 U/g,糖化3 h；釀酒酵母和植物乳桿菌同時接種,接種量分別為1.2×107CFU/mL 和2.4×105CFU/mL。優(yōu)化后的黃酒柔凈醇和,清爽,無異味,符合黃酒國標(biāo)中清爽型干黃酒的要求。