王語聰,謝智鑫,張學(xué)艷,王英男,韓建春,

1(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱,150030) 2(黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院,黑龍江 哈爾濱,150028) 3(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱,150030)

我國2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增趨勢[1],目前普遍采用口服降糖藥和注射胰島素方法治療和緩解T2DM,但長期使用會給人類身體健康帶來不良影響。近年研究表明,糖尿病特征之一就是炎性反應(yīng),這與脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)增多有關(guān)。大量LPS進入血液循環(huán)后誘發(fā)炎癥因子釋放,進而引起炎癥失衡,導(dǎo)致胰島素抵抗(insulin resistance,IR),最終誘發(fā)2型糖尿病,現(xiàn)已證明此作用為“代謝性內(nèi)毒素血癥”。腸道堿性磷酸酶(intestinal alkaline phosphatase,IAP)可以通過對LPS進行去磷酸化作用來保護細胞[2],從而降低炎癥發(fā)生。有研究表明,在高血糖的T2DM患者的糞便中IAP水平與正常血糖的T2DM患者水平相似,說明血糖的高低或者抗糖尿病藥物不會影響IAP濃度[3]。此外,BATES等[4]探究LPS和IAP之間控制腸道炎癥水平的動態(tài)平衡反饋機制,研究LPS通過激活2條不同的途徑誘導(dǎo)炎癥(即NFκB和LPS依賴的TNF-α釋放,后者通過TNF受體起作用),上調(diào)IAP基因轉(zhuǎn)錄的表達,IAP使LPS去磷酸化。去磷酸化的LPS不再能夠觸發(fā)TLR4刺激,甚至可能阻斷該受體與完整LPS結(jié)合。當刺激加大后炎癥相關(guān)基因的上調(diào)導(dǎo)致炎癥和細菌跨黏膜通道的增加,細胞內(nèi)IAP可阻止NFκB途徑的2個關(guān)鍵蛋白磷酸化?？傊?IAP通過在2個水平下調(diào)NFκB途徑來控制炎癥：通過減少LPS對TLR4的刺激和通過阻止NFκB轉(zhuǎn)位到細胞核。因此,IAP與LPS呈負相關(guān)且對炎癥反應(yīng)具有保護作用。

納豆(natto),又稱“醬豆”,是一種大豆發(fā)酵食品,含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),例如各種有機酸和寡糖,同時還含有納豆激酶、超氧化物歧化酶、異黃酮等多種生理活性物質(zhì)。研究表明,純化后的納豆激酶能夠激活并轉(zhuǎn)化為溶纖酶來增強體內(nèi)指纖維蛋白溶解活性,在治療和預(yù)防常見的血栓疾病方面具有一定意義[5]。例如,王天琦[6]研究表明納豆中的納豆激酶可以抑制大鼠體內(nèi)血栓的形成,并且納豆激酶并未對小鼠自身產(chǎn)生傷害。除此之外,IWAI等[7]研究發(fā)現(xiàn),納豆表面黏稠部分分離出的水溶性成分(分子質(zhì)量<100 kDa)和納豆去表面的水提取物可以顯著降低血漿低密度脂蛋白含量和肝臟及主動脈過氧化脂質(zhì)含量。安秀峰等[8]通過MTT法探究納豆脂肽對人乳腺癌細胞MCF-7的影響,結(jié)果表明納豆脂肽能夠抑制細胞的增殖,從而引起人乳癌細胞MCF-7凋亡。

上述研究指出納豆及其成分具有溶血栓、抗腫瘤及抗氧化等藥理作用[9],但對納豆作為一種藥食同源的物質(zhì),直接食用能否促進IAP活性及在糖尿病模型中IAP、LPS和炎癥反應(yīng)三者之間的關(guān)系至今仍不清楚。因此,本試驗以T2DM大鼠為模型,通過灌胃納豆凍干粉水溶液,檢測大鼠體質(zhì)量變化和血糖濃度變化,采用(meso scale discovery,MSD)多因子檢測手段來探究糞便中IAP活力和LPS濃度,以及腸道中炎癥因子水平白細胞介素-6(IL-6)、TNF-α、γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-1(IL-1β)、生長調(diào)節(jié)致癌基因α(KC/GRO)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-5(IL-5)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-13(IL-13)的變化,探究納豆凍干粉對糖尿病大鼠糞便中IAP和LPS的變化及與炎癥反應(yīng)的影響,為納豆凍干粉在功能性食品開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

SPF級別SD雄性大鼠(150±20)g(合格證：No.1103241911038497),北京斯貝福生物有限公司；鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ),美國Sigma公司；堿性磷酸酶試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限責任公司；內(nèi)毒素檢測試劑盒,廈門試劑生物科技責任有限公司；Proinflammatory Panel 2(rat) Kits,Meso Scale Diagnostics LLC；AIN-93M標準飼料(NMF,總熱能3 601 kcal/kg,10% 的能量為脂肪,14.1%的能量為蛋白質(zhì))、高糖高脂飼料(1.5% 膽固醇、0.25% 膽酸鈉、10% 豬油、5% 蔗糖、83.25% 標準飼料),中國營養(yǎng)動物飼料高科技有限公司。

HERAEUS Multifuge X3R離心機,賽默飛世爾科技(中國)有限公司；1300 MESO?QuickPlex SQ 120 MULTI-ARRAY和MULTI-SPOT?微孔板、1300 MESO?QuickPlex SQ 120MSD讀板機,Meso Scale Diagnostics LLC；I14698I血糖測定儀,強生醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及干預(yù)

將大鼠飼養(yǎng)于動物籠中,并保持(50±15)% 的相對濕度,于(22±2)℃和晝夜12 h條件下單籠飼養(yǎng)。所有的試驗步驟遵循試驗動物護理以及動物協(xié)議,由西安交通大學(xué)動物倫理委員會批準[10]。將大鼠分成4組(n=10)并投喂標準飲食及高糖高脂飼料。第1組正常對照組：未經(jīng)處理,每日給予標準飼料飼喂并灌胃20 mL/kg超純水；第2組模型組：建模成功后喂飼高糖高脂飼料并灌胃20 mL/kg超純水；第3組納豆凍干粉低劑量組：建模成功后喂飼高糖高脂飼料并每天灌胃20 mL/kg劑量為4 g/kg溶液;第4組納豆凍干粉高劑量組：建模成功后喂飼高糖高脂飼料并每天灌胃20 mL/kg劑量為8 g/kg溶液。納豆凍干粉低高劑量參考文獻[11]。試驗期間小鼠自由采食和飲水,每天早上8點定時灌胃,在建模成功后第4周處死并進行各指標檢測。在適應(yīng)性喂養(yǎng)后,開始建立T2PM大鼠模型。除正常對照組外,其余組均高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周。將模型組和納豆凍干粉劑量組給予30 mg/kg STZ腹腔注射(禁食12 h),繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料；注射后第3 天和第7 天(禁食12 h),檢測空腹血糖值,以大鼠空腹血糖值≥11.1 mmol/L視為模型建立成功[12-13]。進行稱重并尾尖取血,測定其空腹血糖值(即0 h),給予2.0 g/kg BW 葡萄糖后測定0.5、1、2 h血糖值,即為空腹血糖值。在對STZ粉劑進行計算時,以30 mg/kg為計量標準,溶解于新鮮的檸檬酸鈉緩沖液中(0.1 mol/L,pH 4.3)。為保證其特性,應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配,并避光保存。

1.2.2 納豆凍干粉制備方法

豆經(jīng)清洗后浸泡24 h,于121 ℃蒸煮30 min,降至室溫后用手捏碎并均勻摻入質(zhì)量分數(shù)10% 納豆芽孢桿菌菌液,37 ℃發(fā)酵24 h后置于4 ℃后熟12 h,經(jīng)真空冷凍干燥去除水分后于超微粉碎設(shè)備研磨獲得納豆凍干粉,活菌數(shù)為1.1×1011CFU/g[14]。

1.2.3 糞便采集及制備腸液

T2DM大鼠模型建成后,分別從各組中隨機選取大鼠,通過腹部注射4 mL/kg,質(zhì)量分數(shù)20% 烏拉坦(禁食8 h后)以麻醉大鼠,隨后頸部脫臼處死大鼠,將處死后大鼠固定在超凈工作臺上,在其腹部正中進行剖腹解剖。按近胃部幽門處2～3 cm開始剪取一段腸道組織,所需組織經(jīng)過在濾紙上吸取表面水分和污垢后稱取0.2 g組織樣本。將稱量好的小腸組織放入呈有5 mL預(yù)冷PBS的組織勻漿器中,并將組織粉碎完全,立即裝入15 mL離心管中、2 000×g離心10 min,吸取上清液并置于1.5 mL EP管中,-20 ℃冷凍保存。試驗開始后采取2粒大鼠糞便,置于EP管中于-20 ℃儲存,用于檢測IAP和LPS含量。

1.2.4 大鼠體質(zhì)量和血糖值檢測

開始條件喂養(yǎng)后,每周進行尾靜脈采血并用血糖儀測定空腹血糖,并測其體質(zhì)量。

1.2.5 細菌內(nèi)毒素測定

取少量糞便,按料液比1∶10(g∶mL)添加細菌內(nèi)毒素檢驗用水,迅速3 000×g離心1 min收集上清液,利用試管定量顯色基質(zhì)法檢測細菌內(nèi)毒素濃度[15]。

1.2.6 堿性磷酸酶測定

取少量新鮮糞便,以1 mg糞便中加入50 μL PBS進行稀釋。用旋渦法制備糞便勻漿懸液,通過離心(20 min,10 000×g)收集含IAP上清液,并根據(jù)堿性磷酸酶試劑盒說明書測定IAP活性。

1.2.7 MSD多因子檢測炎癥因子含量

利用MSD電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù),以SULFO-TAGTM為標記物。在MULTI-ARRAY和MULTI-SPOT?微孔板電極表面通電后,電化學(xué)作用激發(fā)SULFO-TAGTM標記物發(fā)出強光,檢測炎癥因子含量[16]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究通過Excel、Graphpad Prism8、SPSS Statistics 20對數(shù)據(jù)進行整理分析。試驗數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準誤差,采用t檢驗進行統(tǒng)計分析,P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,即差異顯著,P<0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠血糖變化

如表1所示,建模前血糖無顯著差異(P>0.05),建模成功后的7和14 d時,與正常對照組相比,模型對照組有極顯著升高(P<0.01)；與模型對照組相比,納豆凍干粉劑量組均無顯著差異(P>0.05)。在21 d時,與正常對照組相比,模型對照組有極顯著差異(P<0.01)；與模型對照組相比,納豆凍干粉劑量組顯著降低(P<0.05)。在28 d時,與正常對照組相比,模型對照組極顯著上升(P<0.01)；與模型對照組相比,納豆凍干粉劑量組均顯著降低(P<0.05)。

表1 納豆凍干粉對2型糖尿病大鼠空腹血糖的影響Table 1 Effect of natto powder on fasting blood glucose in type 2 diabetic rats

血糖是診斷T2DM最重要標準,血糖高低標志著T2DM病情改善情況。有研究表明,納豆主要通過加強機體內(nèi)抗氧化能力和免疫能力[17],并改善IR狀況方式降低血糖,其中納豆中多種活性成分包括大豆異黃酮、激酶等有降糖作用[18]。本試驗研究結(jié)果表明,納豆讓T2DM大鼠降糖效果明顯,與模型對照組相比差異顯著。說明納豆對T2DM大鼠有輔助降糖作用,高劑量組降糖效果更好,其可能原因為納豆中含有能夠降低小腸中α-葡萄糖苷酶的物質(zhì),從而減少對單糖的吸收[19]。

2.2 大鼠體質(zhì)量變化

如圖1所示,建模完成后,與正常對照組相比,模型對照組體質(zhì)量均顯著上升(P<0.05)；與模型對照組相比,各組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量隨干預(yù)時間變化Fig.1 Changes in body mass of rats in each group with intervention time

在整個過程中,正常對照組大鼠活動正常,精神狀態(tài)良好,色澤光亮；模型對照組大鼠不活潑,精神狀態(tài)不好,被毛無光澤。納豆凍干粉組大鼠精神好轉(zhuǎn),反應(yīng)敏感度加大,頹廢狀態(tài)有所改善,活動變多,說明納豆凍干粉緩解了T2DM帶來的影響。建模成功后,模型對照組大鼠體質(zhì)量低于正常對照組,正常對照組大鼠體質(zhì)量有所增加,而模型對照組和納豆凍干粉劑量組喂飼高糖高脂飼料后,體質(zhì)量出現(xiàn)下降趨勢,原因可能是高劑量STZ與高熱量飲食聯(lián)合[20],導(dǎo)致胰島β細胞發(fā)生壞死,并致胰島素分泌不足,進而使體內(nèi)糖代謝絮亂,發(fā)生IR,大鼠攝取體內(nèi)脂肪和蛋白質(zhì)提供能量[21]。

2.3 糞便中IAP活性和LPS濃度變化

如表2所示,與正常對照組相比,模型對照組LPS濃度顯著上升(P<0.05)；與模型對照組相比,納豆凍干粉劑量組LPS顯著降低(P<0.05)。在IAP方面,與正常對照組比,模型對照組極顯著降低(P<0.01)；與模型對照組相比,納豆凍干粉劑量組均顯著升高(P<0.05)。

表2 納豆凍干粉對2型糖尿病大鼠糞便中IAP和LPS影響Table 2 Effect of natto powder on IAP and LPS in fecal of type 2 diabetic rats

2.4 炎癥因子含量測定

2.4.1 促炎因子含量變化

如圖2所示,與正常對照組相比,模型對照組TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ均顯著升高；與模型對照組相比,納豆劑量組TNF-α、IL-6和IFN-γ均顯著降低；在IL-1β方面,與模型對照組相比,納豆低劑量組無顯著差異(P>0.05),但高劑量組極顯著下降(P<0.01)。

圖2 納豆凍干粉對小鼠腸液TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ濃度影響Fig.2 Concentration of IL-6,IL-1β,TNF-α and IFN-γ in mouse serum of control and treatment groups

2.4.2 抗炎因子及趨化因子含量變化

如圖3所示,與正常對照組相比,模型對照組IL-4、IL-5、IL-10和IL-13均顯著下降；與模型對照組相比,納豆劑量組IL-4、IL-5和IL-13均顯著升高；在IL-10方面,與模型對照組相比,納豆低劑量組無顯著差異(P>0.05),納豆高劑量組顯著升高(P<0.05)；在KC/GRO方面,與正常對照組相比,模型對照組顯著升高(P<0.05)；與模型對照組相比,納豆高劑量組極顯著降低(P<0.01)。

圖3 納豆凍干粉對小鼠腸液IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和KC/GRO濃度影響Fig.3 Concentration of IL-4,IL-5,IL-10,IL-13 and KC/GRO in mouse serum of control and treatment groups

3 結(jié)論與討論

為進一步揭示納豆凍干粉對T2DM作用機制,本試驗建立了T2DM大鼠模型。T2DM主要體現(xiàn)胰島素抵抗及胰島素分泌不足。炎癥與IR聯(lián)系密切,被認為是導(dǎo)致IR發(fā)生根源,已有研究表明,腸道慢性炎癥在T2DM發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用,腸道黏膜免疫發(fā)生絮亂,就會引起腸道炎癥發(fā)生[22]。IAP是一種腸道刷狀邊界酶,其僅在近端小腸絨毛相關(guān)腸細胞中表達,可以作為腸道黏膜防御因子,維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,保護宿主免受腸道炎癥損傷，IAP可以使LPS脫磷酸從而降解LPS，降低其毒性，使其失去破壞性，從而解毒。腸道存在大量革蘭氏陰性菌,其細胞壁主要成分是LPS,當腸道中LPS濃度過高時,會破壞腸道黏膜免疫系統(tǒng),誘發(fā)腸道炎癥發(fā)生。有證據(jù)表明,T2DM有利于內(nèi)毒素(特別是LPS)在腸屏障中易位,導(dǎo)致血液中內(nèi)毒素濃度輕微升高[23]?？偟膩碚f,高水平IAP對于T2DM有保護作用[24]。KLAAS等[25]首次發(fā)現(xiàn)LPS是IAP的作用底物,因此提出IAP可以降解LPS的假說。LALLS[26]研究結(jié)果表明,腸道中IAP和LPS存在負相關(guān),當腸腔中IAP濃度增加時,對LPS作用增加,LPS毒性減少,降低腸道炎癥。實驗結(jié)果表明,納豆凍干粉可增加T2DM大鼠糞便的IAP活性,同時降低LPS濃度。

IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ可以作為炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子,在炎癥中發(fā)揮中心作用,當免疫因子被激活時釋放,機體中其含量增加,引起損傷。有研究表明T2DM高血糖可以促進TNF-α濃度升高,TNF-α濃度過高會加速胰島細胞破壞；高脂喂養(yǎng)的小鼠腸道中IL-6分泌增加,TNF-α表達升高[27]。INOOKA等[17]使用納豆凍干粉飼喂腸道菌群失衡小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠免疫得到改善且腸道菌群得到保護，炎癥因子TNF-α、IFN-γ分泌降低；曹靖文等[28]研究發(fā)現(xiàn)，納豆菌糖肽能誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細胞，從而使細胞中IL-1β、TNF-α表達受到抑制。本試驗結(jié)果表示,納豆凍干粉劑量組能夠顯著降低IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ濃度(P<0.05),與前人的研究相符合。其可能原因為促炎因子受到胰島素抵抗后分泌速度加快,導(dǎo)致胰島素細胞凋亡速度加快,因此,納豆凍干粉可通過降低相關(guān)炎癥因子濃度,從而緩解炎癥,進而緩解T2DM。

IL-4是一種在Th2細胞中具有代表性的典型炎癥因子,可以抑制炎癥因子分泌,包括IL-6、TNF-α等。IL-5同IL-4一樣在Th2細胞中發(fā)揮重要作用,可以緩解由嗜酸性粒細胞誘導(dǎo)的炎癥效應(yīng),Th2細胞屬于抗炎細胞,起到重要抗炎作用,可以使Th1介導(dǎo)炎癥受阻[29]；IL-10屬于抗炎因子,可以控制炎性反應(yīng)發(fā)生,機體組織糖、脂肪代謝可以被IL-10調(diào)節(jié),起到T2DM發(fā)生預(yù)防作用。IL-13可以使巨噬細胞活化受到抑制,減少炎性因子分泌,同時可以抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生,又可以使B細胞增殖加快及分泌抗體,起到抗炎作用[30]。沈柱英等[31]在對免疫功能低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)研究中發(fā)現(xiàn),通過灌胃納豆菌糖肽后,血清中IL-10含量顯著升高,說明納豆具有一定免疫增強作用。尚沁沁等[32]探究Caco-2細胞中細胞因子的影響,通過體外模擬實驗表明,納豆芽孢桿菌能夠有效提升IL-10。本次實驗結(jié)果表明,納豆劑量組中大鼠腸道中IL-4、IL-5、IL-10和IL-13濃度與模型對照組有顯著差異(P<0.05),與前人的研究結(jié)果相符。其可能原因是納豆凍干粉刺激抗炎因子,使其表達量增加,從而抑制促炎因子的表達量,并升高抗炎因子濃度,緩解炎癥反應(yīng)。KC/GRO是趨化因子中的一種,推測其表達與細胞生長有關(guān),與受體結(jié)合后可促進炎癥反應(yīng)[33]。本試驗中納豆凍干粉能夠有效降低糖尿病小鼠腸道中KC/GRO,進而降低腸道中促炎癥因子。其可能的原因是納豆凍干粉降低LPS及炎癥因子的濃度從而減少GRO的表達,進而有效改善T2DM。

有研究表明，腸道中IAP和LPS存在負相關(guān)，當腸腔中IAP濃度增加時，對LPS的作用增加，LPS所帶毒性減少，由此引起的腸道炎癥就會減輕[26]。本研究通過糖尿病模型大鼠實驗研究發(fā)現(xiàn),納豆凍干粉可以維持血糖穩(wěn)定,提高腸道中IAP活力,有效降低LPS濃度。通過大鼠腸道中抗炎因子、促炎因子及趨化因子水平進一步驗證LPS可能引起的炎性反應(yīng)。全面驗證了IAP與炎癥因子的關(guān)系,因此納豆凍干粉能夠有效改善T2DM的炎癥反應(yīng),其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)腸道中IAP活力刺激LPS濃度的變化調(diào)控來實現(xiàn)的。未來需要進一步研究納豆凍干粉中主要成分在腸道黏膜中是如何調(diào)控參與改善機體炎癥,緩解T2DM的發(fā)展。