石陽陽,江遠智,,李瑞,嚴利文,趙建新,陳衛(wèi),3,張灝,,杭鋒*

1(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(揚州)食品生物技術研究所,江蘇 揚州,225004) 3(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)

植物乳桿菌是一類嗜溫、革蘭氏陽性、兼性厭氧、兼性異型發(fā)酵的乳酸菌,在植物、土壤、人類或動物的排泄物及發(fā)酵食品(發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵肉制品、發(fā)酵魚制品、干酪)等中均存在,且該菌是人體腸道的原籍菌[1]。植物乳桿菌已被報道可耐酸耐膽鹽并在腸道中定殖[2]，具有改善腸道菌群紊亂[3]、顯著降低空腸彎曲菌毒力基因的轉(zhuǎn)錄并抑制其在腸道的感染[4]、緩解高糖高脂飲食導致的代謝綜合征[5]等健康功能。

盡管植物乳桿菌已被報道具有多種益生功能,但在發(fā)酵乳中的應用并不常見,因為大多數(shù)菌株在牛乳中生長不良、難以凝乳。研究表明,植物乳桿菌蛋白水解系統(tǒng)存在缺陷,雖存在胞內(nèi)肽酶及肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng),但缺乏胞壁蛋白酶(cell-envelope proteinase,CEP)[6]。這意味著植物乳桿菌不能將牛乳中酪蛋白降解為肽,且天然牛乳中的肽含量太低,無法滿足植物乳桿菌的生長要求[7]。協(xié)同發(fā)酵是解決這一問題的有效途徑,利用發(fā)酵過程中的微生物間互利共生和偏利共生關系,以達到更好的發(fā)酵效果,已被用于酸奶和奶酪生產(chǎn)[8]。植物乳桿菌也已被報道在干酪中與其他乳酸菌協(xié)同發(fā)酵[9-10],但對于發(fā)酵乳中植物乳桿菌與其他乳酸菌的協(xié)同發(fā)酵卻知之甚少。

前期研究已證明了植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) CCFM8661具有減輕重金屬鉛毒害的健康功能[11],且在酸豆乳中也有較好的應用[12],另外發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵乳中添加麥芽、燕麥提取物是刺激植物乳桿菌生長的一種方法[13]。本研究通過將蛋白水解菌株與植物乳桿菌協(xié)同發(fā)酵,并對產(chǎn)酸能力、活菌數(shù)、抗氧化能力、發(fā)酵乳色澤、持水力、黏度、感官評價進行測定,對進一步促進植物乳桿菌在發(fā)酵乳中的應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

脫脂奶粉(0.8%脂肪、33.4%蛋白質(zhì)、54.1%乳糖、7.9%礦物質(zhì)和3.8%水分，質(zhì)量分數(shù))、濃縮乳清蛋白WPC80，新西蘭恒天然公司；低酯果膠，美國CP Kelco公司；白砂糖，上海上棠食品；2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ，ABTS)，BBI生命科學有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ，DPPH)，上海沃凱；環(huán)丙沙星，北京索寶來公司；其余試劑為分析純，國藥試劑平臺。

1.1.2 實驗儀器

MS 3振蕩器、C-MAG HS 7恒溫電熱板磁力攪拌器,德國IKA公司；YXQ-LS-70A高壓釜、BSP-150生化培養(yǎng)箱、BAC-1300ⅡA2生物安全柜,蘇州安泰；Sorvall LYNX 4000離心機(A24-8×50轉(zhuǎn)子),Thermo Science公司(美國)；DW-86L388 J超低溫冰箱、DW-25L262醫(yī)用低溫保藏箱、BCD-268STCV冰箱,海爾公司；VE-60LH-AI超純水機,深圳宏森公司；ST3100數(shù)字pH計,奧豪斯儀器(常州)；BHS-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,江陰市保利科研器械；C0000622水系0.22 μm針筒式濾膜、C0000623 水系0.45 μm針筒式濾膜Alllabware Scientific公司(中國)；UV-1800分光光度計,翱藝儀器；Brookfield DV2T LV黏度儀,Brookfield公司(美國)；CR-400色差計,Konica Minolta 公司(日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 復原乳的配制

脫脂乳粉100 g/L,溶解后攪拌均勻,4 ℃靜置過夜。添加輔料的復原乳：脫脂乳粉100 g/L,蔗糖70 g/L,低酯果膠1.5 g/L,天然乳清2 g/L[13]。將配制好的復原乳在108 ℃滅菌15 min備用。

1.2.2 活化菌種與接種

前期實驗已篩選出具有蛋白水解能力的菌株,如表1所示,所有菌種都保藏于江南大學食品學院生物技術中心。

表1 實驗所用菌種Table 1 Strains used in this study

瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌(MRS培養(yǎng)基,37 ℃),腸膜明串珠菌(MRS培養(yǎng)基,30 ℃),乳酸乳球菌(M17+10 g/L乳糖培養(yǎng)基,30 ℃),嗜熱鏈球菌(M17+10 g/L乳糖培養(yǎng)基,42 ℃),保加利亞乳桿菌(MRS培養(yǎng)基,42 ℃)分別活化。傳代3次后,將最后一代菌液稀釋到合適濃度,在600 nm處測定其吸光度值,根據(jù)吸光度值與活菌數(shù)的對應關系,用磷酸鹽緩沖液對菌液進行調(diào)整,使最終活菌數(shù)達到1×109CFU/mL。將菌液接種于滅菌復原乳中,單一發(fā)酵接種量是植物乳桿菌1.0×107CFU/mL,協(xié)同發(fā)酵接種量是植物乳桿菌、蛋白水解菌株分別為1.0×107CFU/mL。接種完畢后,輕輕搖動玻璃瓶以分散發(fā)酵劑,水浴加熱至 35 ℃,于37 ℃靜置培養(yǎng)。

1.2.3 產(chǎn)酸能力及活菌數(shù)測定

用pH計測量不同時間點的發(fā)酵乳的pH值。在12、24、36、48 h分別取發(fā)酵乳樣品,使用植物乳桿菌選擇培養(yǎng)基(LPSM)計數(shù)[14],在37 ℃培養(yǎng)48 h,3次平行。已通過驗證試驗表明,本實驗所用瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌、腸膜明串珠菌、乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌在LPSM中均不能生長,而植物乳桿菌在LPSM中正常生長。

1.2.4 ABTS陽離子自由基清除能力測定

通過ABTS溶液與酸奶樣品反應評估樣品抗氧化能力[15]。酸奶樣品處理：離心(4 ℃,5 000×g,20 min),后用0.44 μm濾膜過濾。用體積分數(shù)為96%乙醇溶液將ABTS溶液稀釋到A734 nm=0.700±0.020(A0)。將150 μL樣品與3 mL ABTS溶液混合搖勻,黑暗中反應30 min后,在734 nm處測吸光度Ai,通過添加150 μL去離子水代替樣品來制備試劑空白,測得吸光度為A0,每個樣品平行測定 3次。ABTS陽離子自由基清除能力按公式(1)計算：

(1)

式中：A0為未添加樣品的吸光度值；Ai添加不同樣品反應后的吸光度值。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測定

酸奶樣品處理：離心(4 ℃,5 000×g,20 min)后用0.44 μm濾膜過濾。對處理好的樣品測定DPPH自由基清除能力[16],每個樣品平行測定 3 次。DPPH自由基清除能力按公式(2)計算：

(2)

式中：A0,未添加樣品的吸光度值；Ai,為添加不同樣品反應后的吸光度值。

1.2.6 發(fā)酵乳持水力測定

取 20 g接種后的發(fā)酵乳,在離心管中 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)至發(fā)酵終點,將樣品在4 ℃下 500×g離心 15 min,去除乳清后稱重。每個樣品平行測定 3 次,按照公式(3)計算持水力：

(3)

式中：m1,離心后樣品的質(zhì)量,g；m2,離心前樣品的質(zhì)量,g。

1.2.7 發(fā)酵乳黏度測定

在發(fā)酵乳pH值為4.3時終止發(fā)酵,用黏度儀測定黏度,溫度20 ℃,轉(zhuǎn)子63#,轉(zhuǎn)速2 r/min,每10 s讀數(shù)1次。

1.2.8 發(fā)酵乳色澤測定

用色差計測定發(fā)酵乳的L*值、a*值和b*值(L*值代表亮度值；a*值代表紅綠值；b*值代表黃藍值)。每次測定前先用白板矯正。每個樣品平行測定 3次。

1.2.9 感官評定

對發(fā)酵乳的口感、氣味、風味、酸甜度進行感官評定,按照9分刺激法進行評價(1=極端討厭,9=極端喜歡)[17]。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理及分析方法

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準誤差。使用IBM SPSS 23對獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用方差分析(ANOVA)的鄧肯多重檢驗比較數(shù)據(jù)平均值的差異顯著性,顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)酸能力與活菌數(shù)

如圖1-a所示,不同發(fā)酵劑產(chǎn)酸能力存在差別。在24 h,Lc15/Lp、Lc24/Lp、LL6/Lp、Lh1/Lp、Lh2/Lp都能使發(fā)酵乳pH降到4.5以下,其中Lh1/Lp產(chǎn)酸能力最強,達到4.04±0.07。在36 h,Lm10/Lp、Lb6/Lp可使發(fā)酵乳pH值降到4.5以下。而St13/Lp、St16/Lp、Lb7/Lp都要在48 h才能使pH降到4.5以下,這是由于發(fā)酵溫度為37 ℃,不是嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌最適生長的溫度,故其產(chǎn)酸緩慢。另外,單一的植物乳桿菌產(chǎn)酸緩慢,在48 h的pH始終在5.5以上,這表明其生長不良。

a-不同菌種的產(chǎn)酸水平；b-協(xié)同發(fā)酵乳中的植物乳桿菌活菌數(shù)圖1 協(xié)同發(fā)酵中的產(chǎn)酸水平和植物乳桿菌活菌數(shù)Fig.1 Acidification of different starters and viable counts of L.plantarum in different co-fermented milk注：不同字母表示不同組間的顯著性差異(P<0.05)(下同)

根據(jù)圖1-b,在協(xié)同發(fā)酵過程中,植物乳桿菌活菌數(shù)顯著增長。在12 h,協(xié)同發(fā)酵乳中植物乳桿菌活菌數(shù)優(yōu)勢并不明顯,這是由于蛋白水解菌株需要將牛乳中本身的多肽利用完全,才能產(chǎn)生蛋白水解作用[18]。而在24 h,可以看到植物乳桿菌活菌數(shù)快速增長,最高達到(8.72±0.05)lg CFU/g,這是由于蛋白水解菌株水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生多肽,被植物乳桿菌利用,從而生長受到促進。其中植物乳桿菌活菌數(shù)最高的是Lc15/Lp、Lc24/Lp、Lh1/Lp、Lh2/Lp發(fā)酵乳,其次是LL6/Lp發(fā)酵乳。在36 h,各組仍保持較高的活菌數(shù)。在48 h,Lb6/Lp、Lb7/Lp、St13/Lp、St16/Lp發(fā)酵乳中植物乳桿菌活菌數(shù)都達到頂峰。而對于單一的植物乳桿菌發(fā)酵乳,活菌數(shù)最高僅有(8.08±0.01)lg CFU/g,且隨著發(fā)酵進行,活菌數(shù)逐漸下降,這是植物乳桿菌不能水解蛋白質(zhì),且牛乳中本身的多肽物質(zhì)不能滿足其生長需求?？偟膩碚f,協(xié)同發(fā)酵明顯促進了植物乳桿菌在發(fā)酵乳中的生長,活菌數(shù)顯著高于單一的植物乳桿菌發(fā)酵乳。

2.2 ABTS陽離子自由基清除能力

發(fā)酵乳的抗氧化能力通過測定ABTS陽離子自由基清除能力,用普通發(fā)酵乳(嗜熱鏈球菌+保加利亞乳桿菌)作為對照組(下同)。由圖2可知,普通發(fā)酵乳發(fā)酵過程中ABTS陽離子自由基清除能力變化較小,最高為(62.9±0.39)%。而協(xié)同發(fā)酵乳ABTS陽離子自由基清除能力各組間差異較大。Lc15/Lp、Lc24/Lp、Lh1/Lp、Lh2/Lp協(xié)同發(fā)酵乳始終保持較高的ABTS陽離子自由基清除能力,均高于對照組(P<0.05),最高達到(78.57±1.9)%。LL6/Lp、Lb6/Lp協(xié)同發(fā)酵乳的ABTS陽離子自由基清除能力隨時間變化,在36 h達到最高,明顯高于對照組,而在48 h略有下降。St13/Lp、St16/Lp、Lb7/Lp協(xié)同發(fā)酵乳的ABTS陽離子自由基清除能力變化較小,略高于對照組。總的來說,協(xié)同發(fā)酵乳的ABTS陽離子自由基清除能力高于普通發(fā)酵乳,其中Lc15/Lp、Lc24/Lp、Lh1/Lp、Lh2/Lp協(xié)同發(fā)酵乳最為突出。

圖2 協(xié)同發(fā)酵乳的ABTS陽離子自由基清除能力Fig.2 ABTS cation radical scavenging ability of different co-fermented milk

2.3 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力也用來表示發(fā)酵乳的抗氧化能力。如圖3所示,普通發(fā)酵乳的DPPH自由基清除能力同樣在發(fā)酵時間內(nèi)變化較小,最高在(48.62±0.38)%。協(xié)同發(fā)酵乳不同組別間差距較大,且隨著發(fā)酵時間進行發(fā)生較大變化。Lc15/Lp、Lc24/Lp、Lh2/Lp協(xié)同發(fā)酵乳在36 h增長到較高水平,Lc24/Lp協(xié)同發(fā)酵乳達到(81.99±0.56)%,且在48 h仍維持較高的清除能力。Lh1/Lp協(xié)同發(fā)酵乳DPPH自由基清除能力在24 h已達到(75.67±0.80)%,明顯高于對照組,且在36 h仍保持增長。其余組別DPPH自由基清除能力都隨著發(fā)酵時間增長,在48 h達到最高值。LL6/Lp、St16/Lp協(xié)同發(fā)酵乳在48 h也展現(xiàn)了較高的清除能力,高于對照組(P<0.05)。總的來說,協(xié)同發(fā)酵乳清除DPPH自由基能力明顯高于普通發(fā)酵乳,且受發(fā)酵時間影響明顯,基本上與清除ABTS陽離子自由基能力一致。

圖3 協(xié)同發(fā)酵乳DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging ability of different co-fermented milk

2.4 發(fā)酵乳色澤

總體來看,不同發(fā)酵劑生產(chǎn)的發(fā)酵乳主要在L*、b*有差別,而a*幾乎無差別。因此在亮度-黃藍值圖中顯示各組發(fā)酵乳位置(圖4)。L*最直觀地顯示發(fā)酵乳的明亮程度,與對照組相比,大多數(shù)協(xié)同發(fā)酵乳亮度值增加,LL6/Lp、Lc15/Lp、Lc24/Lp、St13/Lp、St16/Lp發(fā)酵乳亮度值最高,達到84.02±0.13。Lc15/Lp、Lc24/Lp、LL6/Lp發(fā)酵乳提高了b*,最高達到-0.69±0.08,使發(fā)酵乳呈現(xiàn)令人愉悅的明亮淡黃色。

圖4 不同菌種生產(chǎn)發(fā)酵乳的亮度-黃藍值位置圖Fig.4 Position of fermented milk by different starters on a lightness-yellow ness diagram

2.5 持水力

酸性條件下,酪蛋白分子形成三維空間膠體結構,可容納更多的水分。持水力受總固形物、蛋白含量、種類的影響,對發(fā)酵乳的口感影響巨大。根據(jù)前期試驗,發(fā)酵乳在pH值4.2～4.3時,發(fā)酵乳的感官品質(zhì)最好,所以選擇pH值4.2～4.3作為發(fā)酵終點。添加2 g/L乳清蛋白,1.5 g/L低脂果膠作為穩(wěn)定劑。如圖5所示,各組持水力達到較高水平(90%左右),這是由于濃縮乳清蛋白、果膠幫助形成凝膠,使三維空間結構更加穩(wěn)固[19]。各組持水力趨向于一致,與對照組區(qū)別較小,表明在添加穩(wěn)定劑的情況下,協(xié)同發(fā)酵方法對發(fā)酵乳的持水力影響較小,與普通發(fā)酵乳差別不大,可滿足感官品質(zhì)要求。

圖5 不同菌種生產(chǎn)發(fā)酵乳的持水力Fig.5 Water retention of different co-fermented milk

2.6 黏度

選擇pH值4.2～4.3作為發(fā)酵終點。添加2 g/L 乳清蛋白,1.5 g/L低脂果膠作為穩(wěn)定劑。如圖6所示,總體上各組黏度都高于對照組。Lc15/Lp發(fā)酵乳黏度最高,其次是LL6/Lp、Lh2/Lp、Lm10/Lp,而其他發(fā)酵乳黏度與對照組差別不大。這表明在添加穩(wěn)定劑的情況下,協(xié)同發(fā)酵生產(chǎn)的植物乳桿菌發(fā)酵乳能達到普通發(fā)酵乳的黏度,部分組別黏度可以更高,完全滿足感官品質(zhì)要求。

圖6 不同發(fā)酵乳黏度Fig.6 Viscosity of different co-fermented milk

2.7 發(fā)酵乳感官品質(zhì)

如表2所示,Lc15/Lp、Lc24/Lp、Lh1/Lp、Lh2/Lp發(fā)酵乳的口感、酸甜度都較優(yōu)良,考慮到其出色的抗氧化能力及較高的植物乳桿菌活菌數(shù),可通過在后續(xù)工藝中添加香精香料進一步調(diào)節(jié)其風味,滿足應用需求。而LL6/Lp發(fā)酵乳感官評價較為優(yōu)良,總體評分為8.6±0.1,具有良好的口感、風味、酸甜度。Lb6/Lp、St16/Lp、Lb7/Lp發(fā)酵乳也具有較好的感官評價。

表2 協(xié)同發(fā)酵乳感官品質(zhì)評價Table 2 Sensory evaluation of co-fermented milk

3 結論

本實驗通過將前期篩選得到的具有一定蛋白水解能力的乳酸菌菌株與植物乳桿菌協(xié)同發(fā)酵,并對產(chǎn)酸能力、植物乳桿菌活菌數(shù)、抗氧化能力、發(fā)酵乳色澤、持水力、黏度、感官評價進行測定。整體來看,協(xié)同發(fā)酵方法生產(chǎn)的植物乳桿菌發(fā)酵乳品質(zhì)優(yōu)良,發(fā)酵乳中植物乳桿菌活菌數(shù)顯著增高。其中Lc15/Lp 發(fā)酵乳中植物乳桿菌活菌數(shù)達到(8.72±0.05)lg CFU/g,Lc24/Lp發(fā)酵乳植物乳桿菌活菌數(shù)達到(8.60±0.08) lg CFU/g。Lc24/Lp發(fā)酵乳還具有ABTS陽離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力分別為(78.57±1.9)%、(81.99±0.56%),其感官品質(zhì)良好的特點,Lc15/Lp、Lh1/Lp、Lh2/Lp發(fā)酵乳也具有類似的性質(zhì)。LL6/Lp發(fā)酵乳抗氧化能力中等,但感官品質(zhì)優(yōu)良。此研究解決了植物乳桿菌在發(fā)酵乳中生長不良、難以凝乳的問題,有利于植物乳桿菌在發(fā)酵乳產(chǎn)業(yè)中的廣泛應用。