張維偉，趙福永

（1.長(zhǎng)江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434025；2.利川市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,湖北 恩施 445400）

銀杏是一種重要的多用途經(jīng)濟(jì)林木，其葉富含黃酮類化合物，葉提取物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品等行業(yè)［1-4］。銀杏幼苗在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，其幼嫩根莖易受到以蠐螬為主的地下害蟲的啃食，造成根莖受損，甚至腐爛，嚴(yán)重影響水分及養(yǎng)分運(yùn)輸，從而導(dǎo)致植株落葉早或萎黃，甚至死亡，不利于銀杏的規(guī)?；N植。蠐螬是金龜子類幼蟲的總稱，其防治方法主要有化學(xué)防治、物理防治及生物防治等，而生物防治因防治效果好、成本低、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，具有極大的推廣應(yīng)用前景。目前，國(guó)內(nèi)外的生物防治主要是利用昆蟲病原線蟲的侵染致病、致死作用。昆蟲病原線蟲是一類專門寄生于昆蟲體內(nèi)的線蟲，可釋放共生菌使昆蟲患敗血癥而死亡，不污染環(huán)境，且對(duì)人畜安全，可用于蠐螬等害蟲的防治［5］。

國(guó)外內(nèi)已有較多使用昆蟲病原線蟲防治蠐螬的研究與報(bào)道。李根等［6］對(duì)5 個(gè)昆蟲病原線蟲種類對(duì)小地老虎致病力的比較研究發(fā)現(xiàn)，斯氏線蟲對(duì)小地老虎致死速度最快，侵染72 h 后的死亡率為86.7%，96 h 后的死亡率達(dá)100%。武海斌等［7］利用嗜菌異小桿線蟲H06 在花生結(jié)莢期施用，對(duì)蠐螬的防治效果達(dá)80.78%。Ansari［8］和李小峰［9］分別研究了S.feltiae對(duì)鞘翅目害蟲的防治有較好效果。張中潤(rùn)［10］等研究發(fā)現(xiàn)，S.longicaudum對(duì)高爾夫球場(chǎng)的蠐螬具有較好的防治效果。然而，截止目前，國(guó)內(nèi)還未見有利用昆蟲病原線蟲防治銀杏蠐螬的相關(guān)報(bào)道。

本研究從恩施地區(qū)銀杏種植區(qū)土壤中分離獲得了2 種昆蟲病原線蟲，并探討了其在不同條件下對(duì)銀杏蠐螬的致病性，為后期利用昆蟲病原線蟲防治銀杏蠐螬技術(shù)及生物防治制劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 昆蟲病原線蟲的分離與鑒定

1.1.1 土樣采集

2018 年7 月和10 月，用土樣采集器在利川林業(yè)局甘溪山銀杏GAP 基地采集了表層土以下10～20 cm的土樣，采集地土壤質(zhì)地以壤土為主，共計(jì)30 份，每份1 kg 左右。土樣混合均勻后用密封袋封裝并帶回實(shí)驗(yàn)室，常溫保存。

1.1.2 昆蟲病原線蟲的誘集

參考White［11］和Bedding 等［12］方法，利用大蠟螟作為活體寄主誘集土樣中的昆蟲病原線蟲。具體操作步驟為：每份土樣取200 g 裝進(jìn)塑料盒（長(zhǎng)15 cm，寬8 cm，高3.5 cm）中，每塑料盒中放入5 頭大蠟螟末齡幼蟲，然后置于20～25 ℃的條件下。5 d 后收集大蠟螟尸體，并將蟲尸轉(zhuǎn)至線蟲收集盤收集昆蟲病原線蟲的侵染期幼蟲，每份土樣誘集3 次。

1.1.3 昆蟲病原線蟲的純化、保存與鑒定

將收集到的侵染期幼蟲倒入200 mL 燒杯中，加入適量滅菌水，靜置30 min；去除上層水，重復(fù)4～5 次，直至水變清澈。將凈化后的幼蟲懸浮液置于8～12 ℃保存。每隔3個(gè)月用大蠟螟末齡幼蟲重新繁殖一次線蟲［13］。

采用大蠟螟末齡幼蟲對(duì)誘集到的昆蟲病原線蟲進(jìn)行活體繁殖后，按照下列步驟和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。待大蠟螟死后第3～4 d解剖尸體，收集成蟲［14］；然后在60 ℃Ring 溶液中浸泡3 min 殺死待測(cè)成蟲，并用FA 固定液固定［15］；選取約30 只待測(cè)成蟲，在顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè)，參照Hominick 等［16］報(bào)道的參數(shù)確定線蟲種類。

1.2 致病性昆蟲病原線蟲的篩選

1.2.1 供試蟲源

供試線蟲為本試驗(yàn)通過(guò)大蠟螟末齡幼蟲誘集并純化所獲得。供試金龜子幼蟲均為本實(shí)驗(yàn)室于2019年5 月—7 月間在利川林業(yè)局甘溪山銀杏GAP 基地誘捕獲的銅綠麗金龜和暗黑鰓金龜成蟲經(jīng)飼養(yǎng)獲得。飼養(yǎng)方法：成蟲產(chǎn)卵后，將卵放置到裝有15%左右濕度土壤的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃恒溫箱中孵化，待卵孵化后，將幼蟲置于15%～18%濕度土壤的牙簽盒中，25℃環(huán)境下飼養(yǎng)，以馬鈴薯塊為飼料，飼養(yǎng)至所需齡期備用，為保證飼養(yǎng)條件穩(wěn)定，每隔20 d 左右對(duì)土壤和飼料進(jìn)行更換。

1.2.2 昆蟲病原線蟲懸浮液制備

取昆蟲病原線蟲溶于一定量蒸餾水（如100 mL）中，用磁力攪拌器攪拌均勻后取1 mL 懸浮液進(jìn)行計(jì)數(shù)，以5 次觀測(cè)的平均值計(jì)算昆蟲病原線蟲懸浮液濃度。用蒸餾水調(diào)整線蟲懸浮液終濃度至500 IJs/mL，置于8～12 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 致病性線蟲篩選

分別將20 頭金龜子1 齡幼蟲和若干0.5 cm3大小的馬鈴薯塊置于牙簽盒（直徑4 cm，高8 cm，下同）底，并加入滅菌壤土（含水量為18%，過(guò)40 目篩，下同）50 g，最后滴加濃度為500 IJs/mL 的線蟲懸浮液40 μL，以滴加等量無(wú)菌水作為對(duì)照。每處理重復(fù)3 次。為保證空氣流通，牙簽盒密封后在盒蓋上留小孔，同時(shí)各處理置于同一恒溫箱中，溫度為25 ℃、相對(duì)濕度為80%。分別于處理后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 檢查蠐螬的死亡情況并計(jì)算校正死亡率。

1.3 昆蟲病原線蟲對(duì)銀杏蠐螬的致病力測(cè)定

1.3.1 供試蟲源

選取1.2 中篩選得到的致病力較強(qiáng)的昆蟲病原線蟲進(jìn)行致病力測(cè)定，供試蠐螬為2019 年5 月—7 月間在利川林業(yè)局甘溪山銀杏GAP 基地誘捕獲得。

1.3.2 不同劑量的昆蟲病原線蟲對(duì)銅綠麗金龜?shù)闹虏×?/p>

將500 IJs/mL 的線蟲懸浮液稀釋成400 IJs/mL、300 IJs/mL、200 IJs/mL 和100 IJs/mL 等4 個(gè)濃度，以滴加無(wú)菌水作為對(duì)照，共5 個(gè)處理組，各取40 μL 線蟲懸浮液稀釋分別加入到裝有20 頭金龜子1 齡幼蟲的牙簽盒（內(nèi)含馬鈴薯塊和滅菌土，同1.2.3）內(nèi)，每處理重復(fù)3 次。將各處理置于同一恒溫箱中，溫度為25 ℃、相對(duì)濕度為80%。分別于處理后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 檢查記錄蠐螬死亡情況并計(jì)算死亡率。

1.3.3 不同溫度下昆蟲病原線蟲對(duì)銅綠麗金龜?shù)闹虏×?/p>

根據(jù)1.3.2 試驗(yàn)結(jié)果，取6 個(gè)均含有20 頭銅綠麗金龜1 齡期幼蟲、馬鈴薯塊及50 g 滅菌土（含水量為18%）的牙簽盒，將40 μL 濃度為300 IJs/mL的線蟲懸浮液滴加各牙簽盒（牙簽盒的處理同1.2.3） 中，每處理重復(fù)3 次，各處理分別置于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，恒溫箱濕度均為80%，分別于處理后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 檢查記錄蠐螬死亡情況并計(jì)算死亡率。

1.3.4 不同土壤濕度下昆蟲病原線蟲對(duì)銅綠麗金龜?shù)闹虏×?/p>

根據(jù)1.3.3 試驗(yàn)結(jié)果，取5 個(gè)均含有20 頭銅綠麗金龜1 齡期幼蟲、馬鈴薯塊及50 g 滅菌土的牙簽盒，將40 μL 濃度為300 IJs/mL 的線蟲懸浮液滴加各牙簽盒（牙簽盒的處理同1.2.3）中，各牙簽盒里滅菌土的水分含量分別用無(wú)菌水調(diào)節(jié)為3%、6%、9%、18%和36%，每處理重復(fù)3次，各處理置于同一恒溫箱中，溫度為25℃、相對(duì)濕度為80%。分別于處理后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 檢查記錄蠐螬死亡情況并計(jì)算死亡率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0 和Excel 2010 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，昆蟲病原線蟲對(duì)蠐螬的致病力用蠐螬校正死亡率或死亡率表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆蟲病原線蟲的分離、鑒定與篩選

2.1.1 昆蟲病原線蟲的分離

利用大蠟螟末齡幼蟲對(duì)2批次土樣進(jìn)行昆蟲病原線蟲活體誘集，成功誘集到了2 種昆蟲病原線蟲的幼蟲，編號(hào)分別ES7-1 和ES10-1。

2.1.2 昆蟲病原線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

ES7-1 和ES10-1 的各項(xiàng)形態(tài)學(xué)觀測(cè)數(shù)據(jù)如表1 所示。與Hominick 等［16］報(bào)道的數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，ES7-1和ES10-1 的主要形態(tài)特征分別與斯氏線蟲和嗜菌異小桿線蟲最為接近。因此，本研究將ES7-1和ES10-1分別初步鑒定為斯氏線蟲和嗜菌異小桿線蟲。

表1 2 種待鑒定昆蟲病原線蟲的成蟲與4 種昆蟲病原線蟲的形態(tài)比較Table 1 Comparison of morphology between adults of 2 species of Entomopathogenic nematodes and 4 species of Entomopathogenic nematodes

2.1.3 致病性昆蟲病原線蟲的篩選

2 種昆蟲病原線蟲對(duì)銅綠麗金龜1 齡幼蟲的致病力結(jié)果如表1。供試的2 種昆蟲病原線蟲對(duì)銅綠麗金龜1 齡幼蟲的致病力在處理后24～48 h 時(shí)差異較小，金龜子的校正死亡率均低于10%。隨著線蟲侵染時(shí)間延長(zhǎng)，2 種昆蟲病原線蟲對(duì)銅綠麗金龜1 齡幼蟲的致死率均呈遞增趨勢(shì)。在感染斯氏線蟲96 h 和120 h后，銅綠麗金龜1齡幼蟲的其校正死亡率分別為61.67%和86.67%，顯著高于感染嗜菌異小桿線蟲后的校正死亡率（46.67%和61.67%）。

2 種昆蟲病原線蟲對(duì)暗黑鰓金龜1 齡幼蟲的致病力結(jié)果如表2。供試的2 種昆蟲病原線蟲對(duì)暗黑鰓金龜1 齡幼蟲的致病力在處理后24～48 h 時(shí)差異較小，金龜子的校正死亡率均低于10%。隨著線蟲侵染時(shí)間延長(zhǎng)，2 種昆蟲病原線蟲對(duì)暗黑鰓金龜1 齡幼蟲的致死率均呈遞增趨勢(shì)。在感染斯氏線蟲96 h 和120 h后，暗黑鰓金龜1齡幼蟲的校正死亡率分別為55.00%和78.33%，顯著高于感染嗜菌異小桿線蟲的校正死亡率（45.00%和56.67%）。

表2 2 種昆蟲病原線蟲對(duì)銅綠麗金龜1 齡幼蟲致病力Table 2 Pathogenicity of two species of Entomopathogenic nematodes to the 1st instar larvae of A.corpulenta

表3 2 種昆蟲病原線蟲對(duì)暗黑鰓金龜1 齡幼蟲致病力Table 3 Pathogenicity of two species of Entomopathogenic nematodes to the 1st instar larvae of H.parallela

通過(guò)篩選試驗(yàn)得出，斯氏線蟲對(duì)2種金龜子的致病力高于嗜菌異小桿線蟲的致病力。同時(shí)，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜1 齡幼蟲的致病力要明顯高于對(duì)暗黑鰓金龜1 齡幼蟲的致病力。

2.2 影響斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜致病力的因素

2.2.1 不同侵染劑量對(duì)斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜致病力的影響

同一溫度和土壤濕度條件下，不同侵染劑量的斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜?shù)闹虏×Y(jié)果如圖1 所示。從圖中可以看出，斯氏線蟲侵染銅綠麗金龜幼蟲24 h時(shí)，僅當(dāng)線蟲劑量為300 IJs/mL時(shí)，金龜子幼蟲出現(xiàn)死亡，死亡率為10%；隨著侵染時(shí)間延長(zhǎng)，各劑量濃度的斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲的致死率均增加；相同侵染時(shí)長(zhǎng)下，線蟲劑量為300 IJs/mL 的致死率均要高于其它劑量處理組，在120 h時(shí)達(dá)最高值，為98.33%；當(dāng)侵染時(shí)間在48～96 h之間時(shí)，100 IJs/mL、200 IJs/mL、400 IJs/mL 和500 IJs/mL 劑量處理對(duì)綠麗金龜幼蟲的致死率差異較小；其次為400 IJs/mL劑量，500 IJs/mL劑量線蟲對(duì)綠麗金龜幼蟲的致病力最弱，死亡率僅為45.00%。

圖1 不同侵染劑量的斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜?shù)闹虏×ig.1 Pathogenicity of different infection doses of S.carpocapsae to A.corpulenta

2.2.2 不同溫度對(duì)斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜致病力的影響

相同侵染劑量，同一土壤濕度條件下，不同溫度條件下斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲的致病力結(jié)果如圖2 所示。隨著侵染時(shí)間延長(zhǎng)，不同溫度條件下，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲的致死率均增加；在25 ℃條件下，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲致病力最強(qiáng)，當(dāng)侵染120 h后，銅綠麗金龜幼蟲的死亡率為96.67%；在10 ℃條件下，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲致病力最弱，當(dāng)侵染120 h 后，銅綠麗金龜幼蟲的死亡率僅為28.33%；同一侵染時(shí)間內(nèi)，20 ℃和30 ℃、15 ℃和35 ℃條件下，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲致病力差異較小。

圖2 不同溫度下斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜?shù)闹虏×ig.2 Pathogenicity of S.carpocapsae to A.corpulenta at different temperatures

2.2.3 不同土壤濕度對(duì)斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜致病力的影響

相同侵染劑量和同一溫度條件下，不同土壤濕度條件下斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲的致病力結(jié)果如圖3 所示。結(jié)果表明：隨著侵染時(shí)間延長(zhǎng)，不同土壤濕度條件下，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲的致死率均增加；當(dāng)土壤濕度為18%時(shí)，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲的致病力較其他濃度條件強(qiáng)，當(dāng)侵染120 h后，金龜子死亡率為93.33%；當(dāng)侵染48～72 h 后，土壤濕度為3%、6%和9%時(shí)，線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲的致病力差異較??；當(dāng)侵染120 h后，土壤濕度為3%時(shí)，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲的致病力最弱，金龜子幼蟲死亡率為51.67%，當(dāng)土壤濕度為9%和36%時(shí)，線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲的致病力差異較小。

圖3 不同土壤濕度下斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜?shù)闹虏×ig.3 Pathogenicity of S.carpocapsae to A.corpulenta at different soil humidity

3 討論

蠐螬是金龜子類幼蟲總稱，一般以植株地下塊莖和嫩根為食，導(dǎo)致農(nóng)作物水分?jǐn)嗔鳌I(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸受阻，使植株生長(zhǎng)不良，甚至死亡。蠐螬發(fā)生與地勢(shì)、氣象條件、土壤條件、種群數(shù)量及為害時(shí)期關(guān)系密切［17,18］。蠐螬防治方法包括化學(xué)防治、物理防治及生物防治。化學(xué)防治操作方便且見效快，但具有高毒性、高殘留特點(diǎn)，不僅對(duì)環(huán)境造成污染，還會(huì)影響人類健康。物理防治是利用金龜子趨光性，通過(guò)白熾燈或紫外燈達(dá)到誘殺目的，是防治蠐螬成蟲的有效方法。生物防治主要是利用昆蟲病原微生物、昆蟲病原線蟲感染蠐螬，誘發(fā)蠐螬幼蟲死亡而發(fā)揮防治作用［19-23］。昆蟲病原線蟲具有可大量生產(chǎn)、防治效果好等優(yōu)勢(shì)，是未來(lái)我國(guó)生物防治蠐螬的重要發(fā)展方向。

不同種類的線蟲對(duì)蠐螬的致病力不同，本文通過(guò)篩選得出，斯氏線蟲對(duì)本地蠐螬的致病力強(qiáng)于嗜菌異小桿線蟲的致病力，可能與昆蟲病原線蟲的活動(dòng)力強(qiáng)弱有密切關(guān)系［24］。室內(nèi)測(cè)試結(jié)果表明，當(dāng)侵染劑量為300 IJs/mL 時(shí)，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲致病力最強(qiáng)，說(shuō)明昆蟲病原線蟲能否有效控制害蟲與其在土壤中存活的基數(shù)相關(guān)，基數(shù)過(guò)大或者過(guò)小，均會(huì)影響其整體致病力。其次，隨著侵染時(shí)間延長(zhǎng)，病原線蟲對(duì)金龜子的致病力均加強(qiáng)，但當(dāng)侵染時(shí)間為48～96 h 之間時(shí)，線蟲劑量為300 IJs/mL 的致死率顯著高于其他組，可能因病原線蟲的致病力具有時(shí)效性，具體原因還需進(jìn)一步研究分析。

環(huán)境溫度和濕度會(huì)直接影響昆蟲病原線蟲對(duì)寄主的致病能力［25］。本文研究得出，環(huán)境溫度為25 ℃時(shí)，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲致病力最強(qiáng)，在侵染120 h 后，金龜子幼蟲的死亡率為96.67%。當(dāng)土壤濕度為18%時(shí)，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲的致病力最強(qiáng)，在侵染120 h 后，金龜子死亡率為93.33%。謝欽銘等［26］研究表明，大多數(shù)昆蟲病原線蟲在5～10 ℃基本停止活動(dòng)，25 ℃移動(dòng)最為活躍，35 ℃以上時(shí)，線蟲沒(méi)有致病力。土壤濕度過(guò)低或過(guò)高不僅影響到線蟲的活動(dòng)，還有可能致使線蟲缺氧或脫水死亡，較為適宜的土壤濕度在提高線蟲擴(kuò)散能力的同時(shí)增強(qiáng)了其對(duì)寄主的侵染能力，叢斌［27］等研究表明適宜線蟲的土壤含水量為20%左右，在10%～30%范圍內(nèi)均不影響線蟲繼續(xù)侵染寄主，但長(zhǎng)時(shí)間浸水和干燥會(huì)使線蟲死亡。

蠐螬在恩施地區(qū)主要危害種類為銅綠麗金龜和暗黑鰓金龜，其中銅綠麗金龜為一年一代危害，暗黑鰓金龜為兩年一代危害，考慮到金龜?shù)挠鸹瘯r(shí)間為3 個(gè)月，不同金龜?shù)纳L(zhǎng)、生活周期也有區(qū)別。由于本文研究得出斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜?shù)闹虏×?qiáng)于對(duì)暗黑鰓金龜?shù)闹虏×Γ虼嗽谔镩g利用斯氏線蟲防治需要確定蠐螬的最佳防治窗口，還需要結(jié)合不同金龜子成蟲的蟲口密度、田間的地溫和幼蟲蟲口密度等，此方面還需進(jìn)一步調(diào)查研究。

4 結(jié)論

本文從恩施地區(qū)利川市林業(yè)局甘溪山銀杏GAP基地分離得到斯氏線蟲和嗜菌異小桿線蟲2 種昆蟲病原線蟲，以恩施地區(qū)主要危害蠐螬種類（銅綠麗金龜和暗黑鰓金龜）為防治對(duì)象，經(jīng)過(guò)篩選得出斯氏線蟲對(duì)本地蠐螬的致病力強(qiáng)于嗜菌異小桿線蟲，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜?shù)闹虏×?qiáng)于對(duì)暗黑鰓金龜?shù)闹虏×?。?jīng)室內(nèi)測(cè)定得出，當(dāng)侵染劑量為300 IJs/mL時(shí)，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲致病力最強(qiáng)；25 ℃條件下，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲致病力最強(qiáng)；當(dāng)土壤濕度為18%時(shí)，斯氏線蟲對(duì)銅綠麗金龜幼蟲的致病力最強(qiáng)。該研究結(jié)果為后續(xù)利用斯氏線蟲生防制劑防治當(dāng)?shù)劂y杏蠐螬提供了理論參考依據(jù)。