鐘 潔，趙書林

(廣西師范大學 化學與藥學學院，藥用資源化學與藥物分子工程省部共建國家重點實驗室，廣西 桂林 541004)

人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)即艾滋病病毒，它通過破壞輔助性的T淋巴細胞，并使體內(nèi)的多種免疫細胞受到損害，最終引起各種機會性感染和腫瘤的發(fā)生。艾滋病(ADIS)也稱為獲得性免疫缺陷綜合征，HIV不僅僅會侵蝕細胞，無視抗體甚至會助發(fā)癌變奪走人的生命，所以，艾滋病是目前全球范圍內(nèi)造成人類死亡的主要病因之一[1]。自HIV被發(fā)現(xiàn)以來，它已經(jīng)吸引了越來越多的科學家致力于如何預防和治療艾滋病。

HIV感染可通過檢測病毒的抗體、抗原、核酸確定，其中HIV抗體或抗原檢測是最常用的檢測方法，它是診斷艾滋病病毒感染和艾滋病的主要指標和標準檢測項目。常見的HIV抗體或抗原檢測有酶聯(lián)免疫吸附試驗[2-3]、免疫熒光分析[4-6]和ADIS測試紙[7-10]等。人感染HIV病毒后，會在體內(nèi)不斷復制并產(chǎn)生大量HIV病毒，該過程要先于體內(nèi)對HIV的識別和產(chǎn)生免疫反應(抗體抗原的產(chǎn)生等)。因此，在3～12周的窗口期間很難通過上述方法準確檢測HIV抗體或抗原，這將會導致病毒的傳播與惡化，使患者在不知道感染的情況下錯過最佳治療時間[11]。對于絕大多數(shù)HIV感染者，只要HIV病毒在體內(nèi)開始復制(6～14 d)，血液中就會有相應的病毒基因存在，通過核酸檢測方法即可檢出。與檢測HIV抗體、抗原相比，艾滋病病毒基因(HIV-DNA)可以更早地檢出[12]，從而較早獲得艾滋病的陽性檢測結(jié)果。目前，用于HIV-DNA檢測的分析方法有電化學[13-15]和熒光[16-18]分析方法等，但由于HIV感染初期的含量非常低，這些方法難以準確測定。為了更早更準確獲得檢測結(jié)果，構(gòu)建靈敏、快速、有效的HIV-DNA檢測方法對于艾滋病早期診斷具有重要意義。

本研究基于微芯片電泳-化學發(fā)光檢測(MCE-CL)平臺，建立了一種高靈敏檢測HIV-DNA的新方法，與其它HIV-DNA檢測方法[19-21]相比，該方法具有更高的靈敏度，將其用于實際人血清中痕量HIV-DNA的測定，結(jié)果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

實驗所用DNA片段和標記HRP的DNA序列，以及標記FAM的DNA序列均為自行設計并由大連寶生物公司合成，合成的DNA均為HPLC純級，序列設計如下：HIV-DNA：5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3′；P1：5′-ATGTGGAAAATCTCTGAGTCTTCCAGTGTGAAAA-3′；P2：5′-TTTTTTTTCACACTGGAAGACTC-3′；2-HRP：HRP-DNA-GAGTCTTCCAGTGTGTGGGTTTTGGATTTT-3′；FAM-DNA：5′-FAM-GAGTCTTCCAGTGTGTGGGTTTT GGATTTT-3′；T1：5′-ACTGCTAGAGATTTTCCAGAT-3′；T2：5′-ACTGCTAGAGATTTTCCTGAT-3′；T4：5′-ACTGCTAG AGTTTATCCTGAT-3′；Tn：5′-CAGTAGCTGTCGGCGATAAGC-3′。

MCE-CL檢測系統(tǒng)為實驗室自制[22-23]，微流控芯片購自大連拓微芯片技術(shù)有限公司，為玻璃/玻璃雙T型化學發(fā)光檢測芯片，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。芯片面積為8.5 cm×2.6 cm，通道頂部寬為70 μm(柱后氧化試劑傳輸通道和檢測通道為250 μm)，深度為25 μm，截面為弧形，有效分離通道長為5.0 cm。S為樣品池，SW為樣品廢液池，S與SW兩池距離分離通道均為5 mm，B為電泳緩沖液池，距離雙T交叉點為5.0 mm，雙T型交叉處的間隔為60 μm。

圖1 玻璃/玻璃雙T型化學發(fā)光檢測芯片的構(gòu)造示意圖Fig.1 Structure of glass/glass double T chemiluminescence detection chipS:sample reservoir(樣品池),B:electrophoresis buffer solution reservoir(電泳緩沖液池),SW:sample waste reservoir(樣品廢液池),BW：buffer waste reservoir(緩沖廢液池)，R:post-column oxidizer reservoir(柱后氧化劑池)

1.2 溶液配制

DNA儲備液：將裝有DNA凍干粉的離心管置于離心機中，以12 000 r/min離心5 min。離心結(jié)束后將DNA鏈溶于1.0×10-2mol/L Tris-EDTA(pH 8.0)中制備終濃度為5.0×10-5mol/L的儲備液，于冰箱內(nèi)在4 ℃環(huán)境下靜置24 h后分裝到各小離心管中，于-20 ℃冷凍儲存。

Tris-HCl緩沖溶液：2.5×10-2mol/L Tris-HCl溶液(pH 7.4)，含2×10-2mol/L KCl及0.2 mol/L NaCl。

電泳緩沖溶液：3×10-2mol/L的Na2B4O7溶液(pH 9.3)，含2×10-2mol/L十二烷基硫酸鈉(SDS)和1.2×10-3mol/L魯米諾。

柱后氧化試劑溶液：3.5×10-2mol/L NaHCO3緩沖溶液(pH 9.5)，含0.12 mol/L H2O2和1.0×10-3mol/L 對碘苯酚(PIP)。

1.3 信號放大反應

在反應管中加入2 μL P1/P2復合物(1.0×10-7mol/L)、1 μL HIV-DNA、1 μL 10×Buffer4 和6 μL H2O，于37 ℃恒溫振蕩水浴鍋中反應1 h，隨后加入2 μL HRP-DNA(2.0×10-7mol/L)和3 μL T7Exo(10 U/μL)?；旌暇鶆蚝?，將其于37 ℃恒溫振蕩水浴鍋中反應1 h后繼續(xù)反應80 min。酶切輔助靶標雙循環(huán)反應結(jié)束后，加入35 μL Tris-HCl緩沖溶液定容至50 μL，供MCE-CL分析。

1.4 血清樣品制備

正常人血清樣品取自桂林市第五人民醫(yī)院。檢測HIV-DNA時，將溶于水的HIV-DNA加至血清中作為陽性樣品，然后按“1.3”方法進行信號放大反應。

1.5 微流控芯片電泳化學發(fā)光檢測

電泳芯片首次使用前依次用1 mol/L NaOH溶液和去離子水沖洗30 min，每次實驗前需對芯片進行活化處理，兩次電泳之間分別用0.1 mol/L NaOH溶液清洗8 min，去離子水清洗5 min。采用夾流方式進樣，進樣階段在S池上施加500 V電壓，SW池接地，B池和BW池分別施加250 V和400 V電壓，R池懸空，進樣時間20 s；隨后進入分離階段切換各路電壓，B池施加2 400 V作為分離電壓，S和SW各施加1 500 V電壓作為反拉電壓，而BW池接地，同時R池中施加500 V電壓。利用電壓驅(qū)動進樣，再通過電滲流的作用使得樣品組分在分離通道中以不同的速率遷移至Y型交叉處，與發(fā)光試劑混合產(chǎn)生化學發(fā)光，利用PMT收集化學發(fā)光信號，最終光信號經(jīng)光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換后由計算機記錄。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的設計與原理

基于微芯片電泳的在線分離功能，可在極其短時間內(nèi)有效分離待測物的特點，將HRP催化魯米諾-H2O2化學發(fā)光，PIP增敏和T7Exo輔助信號放大技術(shù)聯(lián)用，設計了一種基于MCE-CL平臺的T7Exo輔助雙循環(huán)化學發(fā)光信號放大方法，原理如圖2所示。

首先將P1、P2兩條DNA單鏈按照1∶1的比例在95 ℃下加熱5 min，再自然冷卻至室溫形成穩(wěn)定的P1/P2雙鏈復合物。當靶標不存在時，由于P1/P2雙鏈復合物的熔鏈溫度設計高于P2與HRP-DNA雜交的熔鏈溫度，HRP-DNA不能將P1置換下來，因此，此時不能形成P2/HRP-DNA雙鏈，即使加入T7Exo酶后體系中也不存在HRP標記的單核苷酸片段。但當靶標HIV-DNA存在時，可形成P1/P2/HIV-DNA三元復合物，此時P1的5′末端(綠色部分)形成平末端，加入T7Exo可以特異性地沿5′→3′方向降解P1/P2/HRP-DNA三元復合物雙鏈，釋放的HIV-DNA序列則重新與P1/P2雙鏈復合物雜交，T7Exo繼續(xù)降解切割三元復合物，并釋放P2單鏈(藍色部分)。P2單鏈與HRP-DNA可以部分雜交形成P2/HRP-DNA雙鏈，加入T7Exo后，探針DNA(HRP-DNA)鏈被降解，而與其雜交的P2序列重新與HRP-DNA雜交，T7Exo繼續(xù)降解。如此循環(huán)，靶標HIV-DNA可產(chǎn)生大量信號分子，經(jīng)過雙循環(huán)過程可實現(xiàn)超靈敏的目標信號放大。由于加入的HRP-DNA過量，因此整個循環(huán)反應結(jié)束后，體系中存在大量HRP標記的單核苷酸片段和過量的HRP-DNA，兩者均可催化H2O2氧化魯米諾反應產(chǎn)生化學發(fā)光。為實現(xiàn)對目標分子的信號放大，利用MCE-CL對HRP標記的單核苷酸片段和過量的HRP-DNA進行分離。由于兩者分子量不同，在電泳圖中產(chǎn)生一前一后兩個峰，根據(jù)HRP標記的單核苷酸片段峰高的變化，可以實現(xiàn)對HIV-DNA的定量分析。

為了驗證方法原理的可行性，實驗對3種含有不同組分的試樣進行了MCE-CL分析。結(jié)果顯示：當樣品溶液中不含靶標HIV-DNA時，電泳圖中僅出現(xiàn)一個電泳峰。存在靶標HIV-DNA時，電泳圖中出現(xiàn)了兩個電泳峰。隨著HIV-DNA濃度的增加，切割并釋放HRP標記的單核苷酸片段的量也隨之增多，其HRP標記的單核苷酸片段的相應峰高也隨著增加。由此證明了出現(xiàn)在上游的峰為HRP標記的單核苷酸片段的電泳峰，根據(jù)該峰的峰高或峰面積可實現(xiàn)HIV-DNA的定量分析。

2.2 凝膠電泳分析

為了進一步考察方法可行性，證實P1/P2雙鏈復合物與HIV-DNA的結(jié)合以及加入T7 Exo后所引發(fā)的鏈剪切反應，設計了相應的凝膠電泳實驗(圖3)。通道1和2中的樣品分別為HIV-DNA和HRP-DNA。由于HRP標記DNA改變了DNA的凝膠遷移速率，因此通道2出現(xiàn)了HRP-DNA停留在點樣孔的拖尾色帶。通道3中樣品為P1/P2的反應產(chǎn)物，亮度較亮是因為兩者結(jié)合形成新的復合物，而熒光染料SYBR Green I與雙鏈DNA的親和力非常高導致染色效果明顯。由于HRP分子量比P1/P2雙鏈復合物大，條帶移動較慢，所以HRP-DNA的條帶位置比該復合物滯后。通道4中的樣品為P1/P2復合物和HRP-DNA的混合溶液，條帶的移動情況與通道3基本一致，表明HRP-DNA并不能把P1從P1/P2中置換出來。通道5中的樣品為P1/P2/HIV-DNA復合物，發(fā)現(xiàn)其條帶位置稍微后移。由于兩者分子質(zhì)量相差不大，所以條帶的位置和亮度變化并不大。通道6中的樣品為T7Exo、HRP-DNA和P1/P2雙鏈復合物的混合溶液，由于HRP-DNA滯留在點樣孔，未觀察到明顯條帶，P1/P2雙鏈復合物條帶仍然存在說明T7Exo不能與P1/P2復合物作用。通道7中為HIV-DNA存在的情況下，T7Exo、HRP-DNA、P1/P2 和HIV-DNA的反應混合物的條帶，發(fā)現(xiàn)T7Exo不能與P1/P2作用，而能與P1/P2/HIV-DNA復合物作用，即HIV-DNA觸發(fā)了整個循環(huán)放大反應，但反應后的HIV-DNA與P1都不能呈現(xiàn)明顯的色帶。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis1.HIV-DNA;2.HRP-DNA;3.P1/P2 double-stranded complex(P1/P2雙鏈復合物);4.HRP-DNA+P1/P2 double-stranded complex;5.P1/P2 double-stranded complex+HIV-DNA;6.T7Exo+HRP-DNA+P1/P2 double-stranded complex；7.T7Exo+HRP-DNA+P1/P2 double-stranded complex+HIV-DNA；8.HIV-DNA；9.FAM-DNA；10.P1/P2 double-stranded complex；11.FAM-DNA+P1/P2 double-stranded complex；12.P1/P2 double-stranded complex+HIV-DNA；13.T7Exo+HRP-DNA+P1/P2 double-stranded complex；14.T7Exo+HRP-DNA+P1/P2 double-stranded complex+HIV-DNA;concentrations of HIV-DNA,HRP-DNA,P1,P2 and AM-DNA were 3.0×10-6 mol/L,the amount of T7 Exo was 80 U(HIV-DNA、HRP-DNA、P1、P2和FAM-DNA濃度均為3.0×10-6 mol/L,T7 Exo用量為80 U)

為進一步驗證整個體系的鏈結(jié)合和酶切循環(huán)情況，將HRP-DNA的HRP換成FAM，即FAM-DNA。通道8中的樣品為HIV-DNA，通道9中的樣品為FAM-DNA，兩通道的電泳結(jié)果與通道1相同，均未呈現(xiàn)明顯的色帶。通道10為P1/P2雙鏈復合物，通道11為FAM-DNA和P1/P2雙鏈復合物的混合樣品，兩者的電泳結(jié)果基本相同，均為P1/P2雙鏈復合物的色帶。通道12為P1/P2雙鏈復合物與HIV-DNA的混合樣品，由于形成了P1/P2/HIV-DNA復合物，導致色帶位置稍微后移。通道13為T7Exo、FAM-DNA和P1/P2的混合物，電泳圖中也僅呈現(xiàn)P1/P2雙鏈復合物的條帶，說明T7Exo不與P1/P2復合物作用。這是由于實驗設計的P1/P2復合物中P2的5′端是伸出的末端，不能被T7Exo切割。通道14為HIV-DNA、T7Exo、FAM-DNA、P1/P2和HIV-DNA混合物，通道中未呈現(xiàn)明顯的色帶說明T7Exo不與P1/P2復合物作用，但可與P1/P2/HIV-DNA復合物作用，即HIV-DNA觸發(fā)了整個循環(huán)放大反應，而反應后的HIV-DNA與P1均未見明顯的色帶。凝膠電泳分析結(jié)果進一步證明了本研究方法原理的可行性。

2.3 實驗條件的優(yōu)化

為了實現(xiàn)基于MCE-CL平臺對HIV-DNA的高靈敏準確定量，對影響電泳分離和化學發(fā)光的實驗條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，電泳分離電壓對于MCE的分離影響較大，分離電壓過大時，會產(chǎn)生焦耳熱，溶液出現(xiàn)大量氣泡而呈現(xiàn)干擾峰，且基線不平穩(wěn)。但如果電壓過小，分離時間變長，且電泳峰展寬嚴重。為獲得最佳的分離度(Rs)，同時避免產(chǎn)生基線噪音和峰展寬及干擾峰等現(xiàn)象，優(yōu)化后的分離電壓為2 400 V。

羥丙基甲基纖維素(HPMC)、吐溫-80和SDS等可作為添加劑改善MCE的分離效果。在本實驗中，雖然HPMC分離效果更佳，但因HPMC粘度較大，清洗不完全易堵塞芯片通道，而使用吐溫-80作為添加劑時，出現(xiàn)出峰時間不穩(wěn)定的現(xiàn)象，因此采用SDS為添加劑以改善分離效果，優(yōu)化的SDS濃度為2×10-2mol/L。另外，采用硼砂溶液為電泳緩沖劑溶液時，其濃度和pH值分別為3×10-2mol/L和9.3時，可獲得最佳分離效果。

實驗還考察了化學發(fā)光反應和信號放大反應的反應條件。結(jié)果表明，在化學發(fā)光反應中，魯米諾、H2O2和PIP的濃度分別為1.2×10-3、0.12、1.0×10-3mol/L，柱后氧化劑溶液pH值為9.5時，體系的化學發(fā)光強度最大。在信號放大反應中，HRP-DNA 的濃度和T7Exo的用量分別為8×10-8mol/L和30 U，反應時間為140 min時，放大反應的效果最好，靈敏度最高。

2.4 HIV-DNA檢測的校準曲線、線性范圍及靈敏度

優(yōu)化條件下對一系列不同濃度的HIV-DNA標準溶液進行分析。結(jié)果顯示，HIV-DNA的信號峰強度(Y)與HIV-DNA濃度的對數(shù)值(X)在1.0×10-14～5.0×10-9mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性，線性方程為Y=2.191 5X+12.693 2，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.997 5。以3倍信噪比(S/N=3)計算得HIV-DNA的檢出限(LOD)為1.6 ×10-15mol/L。

2.5 特異性考察

分別對單堿基錯配的DNA(T1)、雙堿基錯配的DNA(T2)、四堿基錯配的DNA(T4)、全部堿基錯配的DNA(Tn)(濃度均為5×10-10mol/L)和靶標HIV-DNA(8×10-8mol/L)序列進行檢測，以評估方法的選擇性。結(jié)果顯示，僅靶標HIV-DNA存在時，HRP標記的單核苷酸峰高(化學發(fā)光強度)才顯著增強，而在相同實驗條件下，全部堿基錯配的DNA未能引起HRP標記單核苷酸的峰高發(fā)生明顯變化，其余堿基錯配DNA的化學發(fā)光強度隨錯配堿基數(shù)的增多而降低，表明本方法具有較高的特異性。

2.6 血清樣品分析

采用本方法對采集自桂林市第五醫(yī)院的正常人血清樣品進行HIV-DNA測定，并進行加標回收實驗(圖4)。結(jié)果顯示，正常人血清樣品的電泳圖(曲線a)中僅出現(xiàn)一個電泳峰，表明樣品中不含有HIV-DNA；添加一定量HIV-DNA后，電泳圖中出現(xiàn)一個新的信號峰(曲線b)，且隨著HIV-DNA濃度的增大而增高(曲線c)。在0.10、0.25、1.0、10(×10-12mol/L) 4個加標濃度下，HIV-DNA的回收率為93.0%～103%，相對標準偏差(RSD)為0.50%～3.7%，表明本方法具有良好的準確度，具有應用于艾滋病早期診斷的潛力。

圖4 正常人血清中HIV-DNA加標測定的電泳圖Fig.4 Electropherograms for the detection of added HIV-DNA in normal human serum1:HRP-DNA;2:electrophoretic peak for HRP labeled single nucleotide fragment(HRP標記的單核苷酸片段的電泳峰);a:electropherogram for normal human serum(正常人血清電泳圖);b:electropherogram for normal human serum added 1×10-13 mol/L HIV-DNA(正常人血清添加1×10-13 mol/L HIV-DNA電泳圖);c:electropherogram for normal human serum added 1×10-11 mol/L HIV-DNA(正常人血清加入1×10-11 mol/L HIV-DNA電泳圖)

3 結(jié) 論

本研究建立了一種基于微芯片電泳平臺的級聯(lián)化學發(fā)光信號放大策略用于HIV-DNA高靈敏檢測的分析方法。通過對靶標HIV-DNA的信號進行雙循環(huán)放大，實現(xiàn)了對HIV-DNA的超靈敏檢測。將信號放大反應體系引入MCE-CL平臺可在短時間(60 s)內(nèi)對反應后的混合物進行快速有效分離。本方法具有儀器結(jié)構(gòu)簡單、檢測速度快、靈敏度高、特異性好和操作方便等優(yōu)點，可用于復雜生物樣品中微量HIV-DNA的檢測，為發(fā)展高靈敏度的MCE-CL方法提供了一種新途徑，并具有應用于艾滋病早期診斷的潛力。