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        基于DNA “Y”型結(jié)構(gòu)的指數(shù)型核酸恒溫擴(kuò)增策略檢測microRNA

        2021-07-02 10:49:32鄭旭玲鄒小勇
        分析測試學(xué)報 2021年6期
        關(guān)鍵詞:檢測方法

        鄭旭玲,殷 文,陳 俊,李 裕,戴 宗,鄒小勇

        (1.中山大學(xué) 化學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510275;2.中山大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,廣東 廣州 510006;3.南方醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,廣東 廣州 510515)

        成熟的microRNA(miRNA)是一類長度約為19~23個堿基的非編碼RNA[1]。諸多證據(jù)表明,miRNA在包括細(xì)胞分化、早期發(fā)育、增殖、凋亡等眾多生命活動過程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用[2-3],其表達(dá)水平與許多疾病密切相關(guān),可作為疾病標(biāo)志物和用于基因治療以及作為潛在的藥物靶點[4]。開發(fā)可靠、簡單、高效的miRNA檢測方法對于疾病的早期診斷具有重要意義。

        近年來,基于核酸恒溫擴(kuò)增策略的miRNA檢測方法獲得極大發(fā)展,如滾環(huán)擴(kuò)增[5]、雜交鏈反應(yīng)[6]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)[7]等線性擴(kuò)增反應(yīng)被成功應(yīng)用于miRNA定量分析和細(xì)胞成像分析。相比之下,指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(EXPAR)是一種在短時間可獲得高擴(kuò)增效率(106~109)的核酸恒溫擴(kuò)增方法,為miRNA的快速有效檢測帶來了便利[8]。EXPAR方法通常采用一個含兩段重復(fù)序列的對稱DNA模板,目標(biāo)序列與模板的3′端互補(bǔ)雜交后,在聚合酶的作用下沿著模板延伸;延伸出的雙鏈DNA包含切口酶識別序列,被切口酶切割,并在DNA聚合酶的鏈置換作用下被釋放出來,進(jìn)一步與另一條模板的3′端進(jìn)行雜交和擴(kuò)增,形成指數(shù)形式的擴(kuò)增[9]。但這些方法存在如下問題:(1)擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率仍有待提高。miRNA的準(zhǔn)確分析有賴于擴(kuò)增方法的效率和特異性。當(dāng)前的擴(kuò)增方法,指數(shù)擴(kuò)增的效率很高,但更高階的擴(kuò)增方法很難獲得;為提高擴(kuò)增效率,往往需要復(fù)雜的設(shè)計和多擴(kuò)增模板共同參與,且易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。(2)擴(kuò)增反應(yīng)的序列依賴性問題有待解決[10-11]。在大多數(shù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)中,擴(kuò)增模板序列不同,往往導(dǎo)致靶標(biāo)與模板的結(jié)合力改變,引起擴(kuò)增效率改變。這一缺陷限制了方法的通用性,不利于對多目標(biāo)物的同時檢測。

        針對上述問題,本文提出了一種基于“Y”型結(jié)構(gòu)驅(qū)動的低序列依賴恒溫指數(shù)擴(kuò)增方法(Y-EXPAR)。根據(jù)目標(biāo)miRNA的識別序列設(shè)計兩個模板,兩部分互補(bǔ)的模板與目標(biāo)miRNA形成Y型結(jié)構(gòu),在DNA聚合酶和Nt.BstNBI內(nèi)切酶作用下,引發(fā)雙向恒溫指數(shù)擴(kuò)增,實現(xiàn)miRNA的快速檢測分析。let-7b在細(xì)胞過程和人類疾病中扮演著重要角色,在肺癌、乳腺癌等幾種人類惡性腫瘤組織中呈低水平表達(dá),且與其他let-7家族成員僅存在1~4個堿基差異[12-13]。本研究以let-7b為目標(biāo)miRNA模型,探究了Y-EXPAR方法的檢測靈敏度、特異性和抗干擾性,以及在檢測不同CG含量的目標(biāo)miRNA時的序列依賴性,并將本策略應(yīng)用于A549細(xì)胞裂解液中l(wèi)et-7b表達(dá)量的檢測。相比于傳統(tǒng)線性和恒溫指數(shù)擴(kuò)增方法,本策略能有效解決序列依賴性問題,且提高了擴(kuò)增效率。

        1 實驗部分

        1.1 試劑與材料

        DEPC處理水(Diethyl pyrocarbonate)、dNTPs、蛋白酶K和RNA酶抑制劑(上海生工生物工程公司);寡聚核苷酸鏈的合成(序列如表1所示,上海生工生物工程公司);Vent(exo-) DNA聚合酶、Nt.BstNBI限制性內(nèi)切酶、10×Nt.BstNBI buffer(25 mmol/L Tris-HCl,pH 7.9,50 mmol/L NaCl,5 mmol/L MgCl2,0.5 mmol/L EDTA)、10×ThermoPol buffer(10 mmol/L KCl,10 mmol/L (NH4)2SO4,20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.8,2 mmol/L MgSO4,0.1% Triton X-100)(北京紐英倫生物技術(shù)有限公司);SYBR Green I(北京百泰克生物技術(shù)有限公司);胎牛血清、鏈霉素、青霉素、胰蛋白酶和RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco);人類肺癌細(xì)胞(A549,中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

        表1 本實驗中所用的核酸堿基序列*Table 1 Sequences of the oligonucleotides used in this work*

        1.2 實驗方法

        1.2.1Y-EXPAR方法的建立取離心管置于冰上,分別配制A和B溶液。A溶液包含目標(biāo)miRNA、擴(kuò)增模板T1和T2、dNTPs、RNA酶抑制劑和Nt.BstNBI buffer。B溶液包含ThermoPol buffer、Vent(exo-) DNA聚合酶、Nt.BstNBI限制性內(nèi)切酶和SYBR Green I。A和B溶液準(zhǔn)備好后立即混合,加入適量DEPC處理水使溶液總體積為10 μL。體系中有0.5×Nt.BstNBI buffer,1×ThermoPol buffer,0.1 μmol/L T1,0.075 μmol/L T2,1 000 μmol/L dNTPs,0.06 U/μL Vent(exo-) DNA聚合酶,0.4 U/μL Nt.BstNBI 內(nèi)切酶和 0.4 μg/mL SYBR Green I。將混合溶液放在CFX Connect Real-Time System 實時定量PCR儀(Bio-Rad,USA),溫度設(shè)置為45 ℃,實時熒光強(qiáng)度的檢測時間間隔為30 s。

        1.2.2EXPAR方法檢測miRNA 參考相關(guān)文獻(xiàn)[8],本實驗基于EXPAR檢測miRNA的步驟如下:取離心管置于冰上,分別配制C和D溶液。C溶液包含目標(biāo)miRNA、擴(kuò)增模板T7、dNTPs、RNA酶抑制劑和Nt.BstNBI buffer。D溶液包含ThermoPol buffer、Vent(exo-) DNA聚合酶、Nt.BstNBI限制性內(nèi)切酶、SYBR Green I和DEPC處理水。C和D溶液準(zhǔn)備好后立即混合,溶液總體積為10 μL。體系中有0.5×Nt.BstNBI buffer、1×ThermoPol buffer、0.1 μmol/L T7、250 μmol/L dNTPs、0.05 U/μL Vent(exo-) DNA聚合酶、0.4 U/μL Nt.BstNBI內(nèi)切酶和0.4 μg/mL SYBR Green I。將混合溶液放在CFX Connect Real-Time System實時定量PCR儀(Bio-Rad,USA),溫度設(shè)置為55 ℃,實時熒光強(qiáng)度的檢測時間間隔為30 s。

        1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)使用含有10%(體積比)胎牛血清(FBS)、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基,并在37 ℃含5% CO2的濕潤環(huán)境中培養(yǎng)A549細(xì)胞。

        1.2.4細(xì)胞收集和裂解使用胰蛋白酶消化,以1 000 r/min離心5 min除去培養(yǎng)基收集A549細(xì)胞系。將細(xì)胞用RPMI-1640徹底清洗3次,加入RPMI-1640得到細(xì)胞濃度約1 000個/μL的重懸液,用RPMI-1640將懸浮的細(xì)胞溶液逐級稀釋至所需濃度。取1 μL細(xì)胞溶液放入置于冰上的0.2 mL PCR管,管中裝有0.9% NaCl溶液和40 U/mL RNase抑制劑,將細(xì)胞樣品迅速放入液氮中冷凍2 min后在98 ℃下熱處理3 min,再浸入液氮中,反復(fù)3次,使細(xì)胞膜破裂。為消化與miRNA結(jié)合的蛋白,將樣品與1 U蛋白酶K和10 U RNase抑制劑于53 ℃下孵育1 h,再于85 ℃下孵育20 min使蛋白酶解。處理后的細(xì)胞裂解液放在液氮中保存。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 實驗原理

        本文以let-7b為目標(biāo)miRNA模型,Y-EXPAR方法的原理如圖1所示。設(shè)計兩個DNA單鏈模板,模板T1的c序列和模板T2的c′互補(bǔ),T1的b′與目標(biāo)miRNA(let-7b)中的b互補(bǔ),T2的a′與目標(biāo)miRNA中的a互補(bǔ)。當(dāng)目標(biāo)miRNA存在時,T1、T2和目標(biāo)miRNA三者的互補(bǔ)序列雜交形成“Y”型結(jié)構(gòu)。在DNA聚合酶和dNTPs作用下進(jìn)行雙向延伸,目標(biāo)miRNA沿T1從5′端向3′端延伸形成DNA雙鏈,T1則沿T2延伸,兩個方向延伸形成的雙鏈DNA中均產(chǎn)生Nt.BstNBI內(nèi)切酶的識別位點,引導(dǎo)內(nèi)切酶進(jìn)行剪切后,具有鏈置換活性的DNA聚合酶從切口的3′端繼續(xù)延伸,置換釋放與d互補(bǔ)的寡核苷酸d′。第一輪擴(kuò)增,1個目標(biāo)miRNA理論上產(chǎn)生2個d′序列;第二輪擴(kuò)增,“Y”型結(jié)構(gòu)重復(fù)“擴(kuò)增-剪切-釋放”的過程,同時,2個d′序列與體系中剩余的模板T1和T2結(jié)合,在DNA聚合酶和Nt.BstNBI內(nèi)切酶作用下理論上擴(kuò)增產(chǎn)生2個d′,共產(chǎn)生4個d′;依次類推,第三輪擴(kuò)增將釋放8個d′,第n輪擴(kuò)增釋放2n個d′,實現(xiàn)d′序列的指數(shù)擴(kuò)增。利用熒光染料SYBR Green I與雙鏈DNA的特異性結(jié)合,可定量體系中生成的雙鏈DNA,通過實時熒光變化檢測擴(kuò)增過程積聚的產(chǎn)物。該Y-EXPAR方法操作簡便,可在45 ℃的恒溫下進(jìn)行;相比傳統(tǒng)EXPAR方法,擴(kuò)增效率更高,可快速對目標(biāo)miRNA進(jìn)行檢測;“Y”型結(jié)構(gòu)的設(shè)計將目標(biāo)miRNA的擴(kuò)增轉(zhuǎn)化為以已知序列為觸發(fā)劑的擴(kuò)增,擺脫目標(biāo)序列不同對擴(kuò)增反應(yīng)的影響,有效避免序列依賴性,提高對不同miRNA檢測的適用性。方法有望在miRNA以及短鏈核酸分析方面提供高效快速的通用分析方法。

        圖1 Y-EXPAR方法的原理圖Fig.1 Principle scheme of Y-EXPAR method

        2.2 “Y”型結(jié)構(gòu)對擴(kuò)增速率的影響

        配制相同濃度的let-7b溶液,以T1和T2為模板進(jìn)行Y-EXPAR反應(yīng),使用T7為模板進(jìn)行EXPAR反應(yīng)。如圖2所示,EXPAR反應(yīng)和Y-EXPAR反應(yīng)的熒光強(qiáng)度均隨時間增加而指數(shù)升高。不同的是,相比EXPAR,Y-EXPAR能夠更快進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增階段,顯著縮短反應(yīng)所需總時間。指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增速率可以用POI值(Point of inflection,POI)表示,即實時熒光曲線的最大斜率處(拐點)所對應(yīng)的時間。

        圖2 EXPAR和Y-EXPAR方法響應(yīng)1 pmol/L let-7b的實時熒光曲線圖Fig.2 Real-time fluorescence curves of EXPAR and Y-EXPAR in response to 1 pmol/L let-7b,respectively

        Y-EXPAR反應(yīng)的POI值為7,EXPAR的POI值為18.5,表明Y-EXPAR具有更高的擴(kuò)增效率。因為在EXPAR方法的第一輪擴(kuò)增中,let-7b與單鏈模板T7結(jié)合后,DNA聚合酶以dNTPs為底物,使let-7b沿著模板T7延長形成雙鏈,內(nèi)切酶剪切后產(chǎn)生等量寡核苷酸。相比之下,Y-EXPAR反應(yīng)在第一輪擴(kuò)增中,let-7b與兩個模板T1、T2共同形成“Y”型結(jié)構(gòu),從兩個方向同時進(jìn)行擴(kuò)增,經(jīng)過內(nèi)切酶的識別和切割,能夠釋放雙倍數(shù)量的寡核苷酸d′序列,引發(fā)更多的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng),促使反應(yīng)速率增高。

        2.3 Y-EXPAR方法的可行性分析

        miRNA同源家族中的成員序列相似度高[14],因此,對miRNA的檢測需方法具有高特異性。為探究Y-EXPAR的特異性,本文使用let-7家族的不同成員進(jìn)行測試。let-7家族成員的序列高度相似,let-7b與let-7c之間僅相差1個堿基,與let-7a、7d~7g、7i之間相差2~4個堿基。圖3A以T1和T2為模板,Y-EXPAR方法分別響應(yīng)濃度為100 pmol/L的let-7b,以及l(fā)et-7x(let-7a、7c~7g、7i)所獲得的實時熒光曲線。結(jié)果顯示,響應(yīng)let-7b的實時熒光曲線強(qiáng)度增速遠(yuǎn)快于響應(yīng)let-7x的熒光曲線,表明let-7家族成員間雖然具有序列高度相似性,但Y-EXPAR方法仍能夠有效區(qū)分let-7b與其他let-7家族成員,顯示了較強(qiáng)的特異性。

        POIx為let-7x實時熒光曲線的POI值,根據(jù)POI值與let-7b濃度的相關(guān)方程:POI=-2.10-0.710lgclet-7b(mol/L),可得到POIx對應(yīng)的let-7b濃度。將該相對濃度記為Alet-7x。通過系數(shù)(I%)評估本方法的特異性,計算公式如式(1)[15]。濃度相同時,相比let-7b,let-7x產(chǎn)生的信號非常微弱,其中,let-7i對應(yīng)的I最大,但也僅為3.54×10-7%,表明Y-EXPAR方法具有優(yōu)異的特異性,可區(qū)分目標(biāo)miRNA和相似序列。

        (1)

        Y-EXPAR方法還展現(xiàn)了良好的抗干擾性。將let-7b與let-7a、7c~7g、7i分別混合配制7種混合樣品?;旌象w系中目標(biāo)miRNA濃度為10 fmol/L,干擾miRNA濃度為其1 000倍,即10 pmol/L。利用Y-EXPAR方法對混合miRNA樣品進(jìn)行檢測。如圖3B所示,10 fmol/L的let-7b樣品所對應(yīng)的POIlet-7b約為8.00,含有干擾miRNA(let-7x)的混合樣品對應(yīng)的POIlet-7x在6.67~9.00之間。與前述方法相同,根據(jù)POI=-2.10-0.710lgclet-7b(mol/L),由POIlet-7b和POIlet-7x分別計算相對濃度Alet-7b和Alet-7x。通過計算系數(shù)(S%)評估let-7x對let-7b濃度檢測產(chǎn)生的干擾,計算公式如式(2),系數(shù)越小特異性越強(qiáng)[15]。計算得S%為0.064%~7.47%。其中,let-7d和let-7g引起的干擾極小,分別為0.074%和0.064%,這是因為二者與let-7b相比均存在4個堿基錯配??傮w而言,Y-EXPAR方法具有良好的抗干擾性。

        (2)

        2.4 Y-EXPAR方法序列依賴性研究

        EXPAR方法在檢測不同miRNA時,擴(kuò)增性能差別較大,其擴(kuò)增效率在一定程度上依賴于模板序列[11]。Y-EXPAR中“Y”型結(jié)構(gòu)的設(shè)計可降低目標(biāo)miRNA序列變化對擴(kuò)增效率的影響,改善序列依賴性問題。當(dāng)目標(biāo)miRNA不再是let-7b時,Y-EXPAR方法只需改變模板T1中的b′序列和模板T2中的a′序列,而T1中的c、d、e、d和T2中的c′、d、e、d無需變換。

        CG的比例會影響雙鏈的穩(wěn)定性。模板/觸發(fā)雙鏈中CG含量低,熔解溫度Tm值小,觸發(fā)劑與模板結(jié)合力弱;反之,CG含量高,熔解溫度Tm高,觸發(fā)劑與模板容易結(jié)合,但新形成的觸發(fā)劑難以解離[11]。使用CG含量不同的miRNA檢驗Y-EXPAR方法的序列依賴性。由let-7b的序列計算得知,let-7b的CG含量為45.5%。根據(jù)miRBase的數(shù)據(jù)[16],本文對48 885種miRNA的CG含量進(jìn)行統(tǒng)計,篩選出CG含量較低和較高的miRNAs,并選擇與人類相關(guān)的兩種miRNAs:miR-374a和miR-762(CG含量分別為22.7%和90.9%,堿基數(shù)目均為22個,與let-7b相同)進(jìn)行考察。

        作為對照,本文根據(jù)EXPER方法的原理為let-7b、miR-374a、miR-762分別設(shè)計模板T7、T8、T9,其擴(kuò)增結(jié)果如圖4A所示??梢钥吹紼XPER方法檢測濃度為10 fmol/L的miR-374a、let-7b、miR-762時,獲得的POI值差別明顯,分別為7.00、18.8和34.5,說明即使是擴(kuò)增原理相同,對于不同GC含量的核酸,擴(kuò)增效果差異依然很明顯。該差異會導(dǎo)致分析性能的明顯變化。在10 fmol/L~100 pmol/L濃度范圍內(nèi),let-7b的POI值隨濃度增加逐漸下降,而miR-374a和miR-762的POI值則無明顯變化。

        相比之下,根據(jù)Y-EXPAR方法的測定原理,為miR-374a設(shè)計了模板T3和T4,為miR-762設(shè)計了模板T5和T6。如圖4B所示,隨著miRNAs濃度的增加,Y-EXPAR的擴(kuò)增速率提高,let-7b、miR-374a和miR-762三種目標(biāo)miRNA所對應(yīng)的POI值均下降;在相同miRNA濃度下,let-7b、miR-374a和miR-762的POI值接近。實驗結(jié)果表明,Y-EXPAR方法檢測不同miRNA時,即使目標(biāo)miRNA序列改變較大(GC值變化大),模板仍能保持良好的擴(kuò)增性能。DNA聚合酶將核苷酸整合到延長鏈中的速率與DNA模板的序列相關(guān)[11]。在Y-EXPAR方法中,目標(biāo)miRNA與兩個模板形成“Y”型結(jié)構(gòu),擴(kuò)增釋放d′,接下來的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)由觸發(fā)劑d′引發(fā)。檢測不同目標(biāo)miRNA時,d′的序列無需改變,避免了DNA聚合酶和不同DNA序列相互作用時的差異,降低了Y-EXPAR的序列依賴性。

        2.5 Y-EXPAR反應(yīng)條件的優(yōu)化

        2.5.1反應(yīng)溫度Y-EXPAR方法中,反應(yīng)溫度不僅能影響Nt.BstNBI內(nèi)切酶和Vent(exo-) DNA聚合酶活性,還影響目標(biāo)miRNA與模板雜交形成“Y”型結(jié)構(gòu),觸發(fā)劑與模板的結(jié)合,以及新合成的觸發(fā)劑從模板上的解離等。因此,需要對Y-EXPAR的反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化。由圖5A可知,當(dāng)溫度為45 ℃時,實驗組和空白對照組的實時熒光曲線的POI差值(ΔPOI)最大。因此,將45 ℃作為Y-EXPAR的最佳反應(yīng)溫度。

        2.5.2Nt.BstNBI內(nèi)切酶用量在Y-EXPAR方法中,Nt.BstNBI內(nèi)切酶切割新生鏈,產(chǎn)生更多觸發(fā)劑進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。本文探究了Nt.BstNBI內(nèi)切酶用量對Y-EXPAR方法檢測性能的影響(圖5B)。當(dāng)Nt.BstNBI內(nèi)切酶為0.04 U/μL時,let-7b與空白對照間的熒光響應(yīng)區(qū)分最為明顯,二者之間的ΔPOI最大,同時,Y-EXPAR方法保持較高反應(yīng)效率;當(dāng)Nt.BstNBI內(nèi)切酶濃度增至0.05 U/μL時,Y-EXPAR方法的效率進(jìn)一步提高,但let-7b與空白對照之間的熒光響應(yīng)差異減小。因此,將0.04 U/μL作為Y-EXPAR反應(yīng)中 Nt.BstNBI 內(nèi)切酶的最佳酶量。

        2.5.3Vent(exo-)DNA聚合酶用量根據(jù)實驗原理可知,DNA聚合酶在Y-EXPAR方法中能夠沿著模板延長互補(bǔ)鏈,并將切割后的DNA鏈置換下來。因此,DNA聚合酶用量將影響Y-EXPAR方法對miRNA的檢測能力。如圖5C可知,當(dāng)Vent(exo-) DNA聚合酶濃度為0.04 U/μL時,Y-EXPAR的反應(yīng)速度最慢;隨著DNA聚合酶濃度增至0.06 U/μL,Y-EXPAR的反應(yīng)效率加快,空白對照的非特異性信號也增強(qiáng);繼續(xù)增加Vent(exo-) DNA聚合酶濃度至0.08 U/μL和0.10 U/μL,Y-EXPAR的反應(yīng)效率變化較小。根據(jù)ΔPOI和DNA聚合酶濃度的關(guān)系圖,當(dāng)DNA聚合酶為0.06 U/μL時,ΔPOI最大,表明let-7b產(chǎn)生的熒光信號與空白對照的非特異性信號相差最大,Y-EXPAR方法能更好地區(qū)分let-7b和空白對照。因此,將0.06 U/μL作為Y-EXPAR反應(yīng)中Vent(exo-) DNA聚合酶的最佳酶量。

        2.6 Y-EXPAR分析能力研究

        本文以T1和T2為模板,在反應(yīng)溫度為45 ℃,Nt.BstNBI內(nèi)切酶濃度為0.04 U/μL,Vent(exo-) DNA聚合酶濃度為0.06 U/μL的最佳實驗條件下,對不同濃度的let-7b進(jìn)行Y-EXPAR擴(kuò)增。圖6展示了各濃度let-7b產(chǎn)生的實時熒光曲線。隨let-7b濃度的增加,擴(kuò)增速率加快。如圖6插圖所示,在1 amol/L~10 nmol/L濃度范圍,實時熒光曲線的POI值與let-7b濃度的對數(shù)值存在線性關(guān)系,線性方程為:POI=-2.10-0.710lgclet-7b(mol/L)(r2= 0.969)。本方法的檢出限為0.3 amol/L,相當(dāng)于10 μL溶液中約有1.8拷貝的let-7b;且在保持良好檢測能力的同時,所需檢測時間僅為10 min,比常規(guī)EXPAR所需時間更短。Y-EXPAR方法能夠有效進(jìn)行生物樣品中miRNA的檢測。

        圖6 Y-EXPAR響應(yīng)不同濃度let-7b的實時熒光曲線圖Fig.6 Real-time fluorescence curves of Y-EXPAR in response to different concentrations of let-7b let-7b concentration(1-10):blank,1 amol/L,10 amol/L,1 fmol/L,10 fmol/L,100 fmol/L,10 pmol/L,100 pmol/L,1 nmol/L,10 nmol/L;insert:plot of corresponding POI value and logarithm of let-7b concentration

        2.7 細(xì)胞裂解液中l(wèi)et-7b的檢測分析

        miRNA被認(rèn)為是臨床上重要的生物標(biāo)志物[17]。研究表明,let-7b能夠抑制幾種參與肺癌發(fā)展的蛋白質(zhì)翻譯[13,18],且肺癌患者的腫瘤組織和周圍組織中的let-7b表達(dá)顯著降低[13]。本文應(yīng)用Y-EXPAR方法檢測了人類肺癌細(xì)胞A549中l(wèi)et-7b的表達(dá)量。在100個肺癌細(xì)胞的細(xì)胞裂解液中加入足量let-7b的反義核苷酸,以此作為陰性對照,運用Y-EXPAR方法進(jìn)行檢測,計算實時熒光曲線最大斜率對應(yīng)的反應(yīng)時間,陰性對照的POI為13,緩沖溶液空白對照的POI為13.5,二者非常接近,表明Y-EXPAR方法可以在細(xì)胞裂解液的環(huán)境中進(jìn)行目標(biāo)miRNA的檢測分析。

        運用Y-EXPAR方法對細(xì)胞裂解液進(jìn)行檢測,如圖7所示,隨著細(xì)胞數(shù)目減少,細(xì)胞裂解液所對應(yīng)的實時熒光曲線強(qiáng)度增長減慢,反應(yīng)時間增加。且細(xì)胞數(shù)目在1~1 000范圍內(nèi)時,細(xì)胞裂解液所對應(yīng)實時熒光曲線的POI值與細(xì)胞數(shù)目的對數(shù)值存在線性關(guān)系,回歸方程為POI=10.2-1.30lg(Number of cells)。結(jié)果表明Y-EXPAR方法在檢測細(xì)胞中的miRNA方面具有較好效果,在臨床診斷中具有應(yīng)用潛力。

        圖7 Y-EXPAR響應(yīng)不同數(shù)目A549細(xì)胞裂解液的實時熒光曲線圖Fig.7 Real-time fluorescence curves of Y-EXPAR in response to cell lysates from different numbers of A549numbers of A549(1-5):blank,1,10,100,1 000 cells

        3 結(jié) 論

        本文提出了一種基于DNA“Y”型結(jié)構(gòu)的高擴(kuò)增效率、低序列偏好的指數(shù)型核酸恒溫擴(kuò)增方法——Y-EXPAR,并將其應(yīng)用于miRNA的靈敏特異檢測。該方法延續(xù)了傳統(tǒng)EXPAR方法的主要優(yōu)點,如反應(yīng)可在恒溫下進(jìn)行,操作簡便,同時在檢測let-7b和其它let-7家族時表現(xiàn)出良好的選擇特異性和抗干擾能力。此外,“Y”型結(jié)構(gòu)還實現(xiàn)了雙向指數(shù)擴(kuò)增,進(jìn)一步提高擴(kuò)增效率,縮短了分析時間。對于引發(fā)指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)的觸發(fā)劑而言,“Y”型結(jié)構(gòu)能夠保證擴(kuò)增反應(yīng)的相對獨立性,有效克服擴(kuò)增序列依賴性問題。本擴(kuò)增方法為miRNA的快速檢測提供了新思路,在miRNA相關(guān)的疾病研究和臨床診斷方面具有良好應(yīng)用前景。

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