李佳潔，王 超，鄧潔薇*，欒天罡,2

(1.廣東工業(yè)大學(xué) 生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

脂質(zhì)是生物體的重要活性化學(xué)物質(zhì)，在細(xì)胞膜組成、能量儲存和信號傳遞等生物功能中發(fā)揮著重要作用[1-2]。2003年，美國國立衛(wèi)生研究院所資助的“脂質(zhì)代謝途徑研究計劃”項目提出了新的脂質(zhì)分類系統(tǒng)，將脂質(zhì)分為脂肪酰類(FA)、甘油脂類(GL)、甘油磷脂類(GP)、鞘脂類(SP)、固醇脂類(ST)、孕烯醇酮脂類(PR)、糖脂類(SL)和多聚酮類(PK) 8個大類[1]。每個脂質(zhì)類別中又含有多種亞類，由于極性頭基、?；湹拈L度或不飽和鍵數(shù)量及位置、立體構(gòu)型等的多樣化，形成了成百上千種脂質(zhì)及其異構(gòu)體。截至2021年3月17日，除了區(qū)域異構(gòu)體、氧化脂類和其他修飾形式外，脂質(zhì)代謝途徑研究計劃(LIPID MAPS)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫已包含超過45 568種獨特的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。眾多研究表明，脂類化合物的結(jié)構(gòu)和功能與細(xì)胞生理過程、糖尿病、動脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等疾病進(jìn)程相關(guān)[3-5]。細(xì)胞的生理活性和生化功能高度依賴于脂類化合物的化學(xué)復(fù)雜性和結(jié)構(gòu)多樣性。因此，開展生物體的脂質(zhì)分析和組學(xué)研究，對深入了解與脂質(zhì)組成相關(guān)的生物學(xué)功能以及脂質(zhì)在生命過程中的作用具有重要意義。

質(zhì)譜(MS)技術(shù)由于靈敏度高、響應(yīng)速度快、特異性好、無需標(biāo)記、并且能給出豐富的分子結(jié)構(gòu)信息等優(yōu)點，正迅速地成為脂質(zhì)分析和脂質(zhì)組學(xué)研究的強有力工具[6-7]，且有關(guān)質(zhì)譜技術(shù)在脂質(zhì)組學(xué)研究方面的綜述文章已經(jīng)有不少報道[2,8]。近年來，常壓電離質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，為常壓條件下的原位、實時、直接、快速、生物脂質(zhì)分析和組學(xué)研究提供了重要手段[9]。例如，美國普渡大學(xué)Cooks課題組[10]利用解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像(DESI-MSI)技術(shù)分析了人腦腫瘤樣本的小分子代謝物和脂質(zhì)化合物；美國喬治·華盛頓大學(xué)Vertes課題組[11]利用激光燒蝕電噴霧離子化質(zhì)譜(LAESI-MS)技術(shù)研究了磷脂酰乙醇胺(PEs)和磷脂酰甘油(PGs)在大腸桿菌和枯草桿菌中的分布，以及它們與抗生素的相互作用。在國內(nèi)，廣東工業(yè)大學(xué)欒天罡課題組[6]建立了基于表面修飾探針敞開式納升電噴霧質(zhì)譜技術(shù)的脂質(zhì)組學(xué)方法，實現(xiàn)了Daphnia屬生物大型溞和蚤狀溞的快速鑒別；中央民族大學(xué)再帕爾·阿不力孜課題組[12]提出了基于空氣動力輔助解吸電噴霧質(zhì)譜(AFADESI-MS)的腫瘤代謝表征策略，通過對脂肪酸(FAs)、磷脂酰膽堿(PCs)、PEs等多種脂質(zhì)的成像，深入探索了腫瘤代謝途徑。

1 PB光化學(xué)反應(yīng)與常壓電離質(zhì)譜聯(lián)用

PB反應(yīng)因與質(zhì)譜溶劑兼容性好、操作簡便、易于實現(xiàn)等優(yōu)點，已成功地與多種常壓電離質(zhì)譜如納升電噴霧質(zhì)譜、液滴微連接表面采樣探針質(zhì)譜、表面修飾探針納升電噴霧質(zhì)譜等技術(shù)聯(lián)用。以下將詳細(xì)介紹PB光化學(xué)反應(yīng)與常壓電離質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法。

1.1 PB反應(yīng)與納升電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用

圖1 PB反應(yīng)與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用[13]Fig.1 On-line coupling of PB reactions with MS for lipid analysis[13]A:experimental setup(實驗裝置圖);B:PB reaction mass spectrum of oleic acid and acetone induced by UV irradiation of-nanoESI;insert:PB reaction spectrum using D6-acetone(以D6-丙酮為試劑的FA∶18∶1的PB反應(yīng)質(zhì)譜圖),MS2 CID of the PB reaction products at m/z 339.3(C) and m/z 345.3(D)( 產(chǎn)物離子在m/z 339.3(C)和m/z 345.3(D)的二級質(zhì)譜圖),E:fragmentation scheme of PB reaction product isomers(PB反應(yīng)產(chǎn)物離子的裂解方式)

甘油三酯(TAGs)是一類非常重要的脂質(zhì)化合物，作為能量儲存的形式存在于生物體中。TAGs的水溶性非常低，采用丙酮/水作為PB反應(yīng)試劑時，其質(zhì)譜分析往往難以獲得理想結(jié)果。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)杜冰團(tuán)隊[24]采用二苯甲酮為PB反應(yīng)試劑，將美藤果油(Sacha inchi oil)溶解于含有二苯甲酮的甲醇/氯仿(體積比9∶1)溶液中進(jìn)行PB-nanoESI-MS分析，對美藤果油中的多不飽和甘油三酯(PUTAGs)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，并對13種C57-PUTAGs和23種C59-PUTAGs進(jìn)行了鑒定。

Heiles團(tuán)隊[26]以苯乙酮(AP)作為PB反應(yīng)試劑，將不飽和磷脂酰膽堿(PC)溶于苯乙酮(含1%甲酸)溶液，經(jīng)254 nm紫外光照射80 s后進(jìn)行nanoESI-MS分析，可在質(zhì)譜圖中觀察到增加了120 Da的光衍生化產(chǎn)物離子，且二級質(zhì)譜圖中可見質(zhì)量差為88 Da的診斷離子對，由此證實了苯乙酮作為PB反應(yīng)試劑的可行性，且苯乙酮的反應(yīng)產(chǎn)率達(dá)50%～80%。

1.2 PB反應(yīng)與直接采樣電離質(zhì)譜聯(lián)用

2018年，歐陽證團(tuán)隊[28]提出了一種簡單方便的直接采樣電離質(zhì)譜分析方法，將PB反應(yīng)、直接采樣電離與小型質(zhì)譜結(jié)合，在即時檢測方面具有非常良好的前景。該方法使用不銹鋼針對生物組織進(jìn)行快速取樣，然后將載樣的不銹鋼針插入預(yù)先裝載有萃取脂質(zhì)溶劑的玻璃納升電噴霧針中。在脂質(zhì)萃取過程中，以丙酮/水為反應(yīng)試劑，采用紫外光照引發(fā)PB反應(yīng)。通過在不銹鋼針上施加高電壓，誘導(dǎo)脂質(zhì)溶液產(chǎn)生納升電噴霧離子化，并采用小型質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，實現(xiàn)了大鼠腦、肝、腎組織的快速脂質(zhì)分析，以及大鼠正常和癌性乳腺組織中 FA(18∶1(Δ9)) 和 FA(18∶1(Δ11))的相對定量，并在小鼠癌證組織中觀察到FA(18∶1(Δ9))/FA(18∶1(Δ11))比率的顯著變化。

1.3 PB反應(yīng)與液滴微連接表面采樣探針質(zhì)譜聯(lián)用

1.4 PB反應(yīng)與表面修飾探針納升電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用

圖2 SCP-PB-nanoESI-MS分析方法示意圖[31]Fig.2 Schematic diagram for development of a SCP-PB-nanoESI-MS method[31]

1.5 PB反應(yīng)與多孔聚合物涂層轉(zhuǎn)移富集直接質(zhì)譜聯(lián)用

2 環(huán)氧化與常壓電離質(zhì)譜聯(lián)用

2.1 環(huán)氧化與低溫等離子體探針質(zhì)譜聯(lián)用

2.2 環(huán)氧化與解吸電噴霧電離質(zhì)譜聯(lián)用

2.3 環(huán)氧化與納升電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用

2019年，Yan等[38]首次報道了一種新穎可調(diào)的按需電化學(xué)環(huán)氧化反應(yīng)與納升電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用鑒定不飽和脂質(zhì)雙鍵的方法。他們發(fā)現(xiàn)在鹽酸和乙腈/水溶劑體系中，通過調(diào)節(jié)外加高壓可以控制不飽和脂質(zhì)雙鍵的環(huán)氧化。施加2.5 kV電壓可以關(guān)閉脂質(zhì)環(huán)氧化，而將電壓降至1.8 kV又可以實現(xiàn)脂質(zhì)環(huán)氧化，且在不同電壓下還可按需生成單/多個環(huán)氧化合物。酸性條件下加入氯化物，可以在脂質(zhì)雙鍵上原位形成次氯酸鹽并轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的環(huán)氧化物，整個反應(yīng)過程在幾秒內(nèi)即可完成。電環(huán)氧化產(chǎn)物隨后可通過CID裂解產(chǎn)生診斷離子來鑒定雙鍵位置。單樣品的快速開/關(guān)電環(huán)氧化、低樣品消耗、對含有多個雙鍵的復(fù)雜脂質(zhì)的適用性以及不需要額外儀器等優(yōu)點使得該技術(shù)在高通量脂質(zhì)分析方面極具潛力。

3 臭氧誘導(dǎo)解離與常壓電離質(zhì)譜聯(lián)用

4 紫外光解離法與常壓電離質(zhì)譜聯(lián)用

紫外光解離法(UVPD)是另外一種非傳統(tǒng)的離子激發(fā)方法，主要利用光子激活和碎裂離子的能力。具有發(fā)色團(tuán)的離子吸收了紫外光子能量后，從基態(tài)躍遷到電子激發(fā)態(tài)，進(jìn)而在其激發(fā)態(tài)上發(fā)生鍵斷裂，從而產(chǎn)生豐富的碎片診斷離子，可用于化合物的結(jié)構(gòu)或序列的表征[40]。

圖3 小鼠腦(A～D)、人腦(E～H)和甲狀腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織切片(I～L)的H&E染色、m/z 798母離子成像圖、UVPD雙鍵診斷離子強度比成像圖，以及腦灰質(zhì)和白質(zhì)/癌組織和正常組織的UVPD譜圖[41]Fig.3 Optical images of the H&E stained,DESI-MS ion image of m/z 798,DESI-UVPD ratio image of the ratio of the summed intensities of the UVPD double-bond diagnostic ions,expanded region of UVPD mass spectra of the white and gray matter,and UVPD mass spectra of cancerous and normal parts of tissue from(A-D) mouse brain tissue section,(E-H) human brain tissue section,and(I-L) lymph node tissue section with thyroid cancer metastasis[41]

Heiles等[26]將PB-nanoESI-MS與UVPD相結(jié)合，提高了對雙鍵解離的選擇性，該UVPD也需對儀器改造引入紫外激光源和光路。實驗采用266 nm光源對不飽和脂質(zhì)離子照射，未引起脂質(zhì)離子的光解離。而采用苯乙酮作為PB反應(yīng)試劑，先進(jìn)行PB反應(yīng)，再對產(chǎn)物離子進(jìn)行紫外照射，則可發(fā)生紫外光解離，且提高了2.2倍PB反應(yīng)選擇性。此外，還考察了各種脂質(zhì)加合離子(Li、Na和K)的PB和PB-UVPD實驗。結(jié)果顯示，PB反應(yīng)后加合離子抑制了氧雜環(huán)丁烷的CID碎裂，無法得到診斷離子碎片和雙鍵的信息，但經(jīng)PB-UVPD反應(yīng)后，氧雜環(huán)丁烷可以紫外光裂解，得到雙鍵特異性的離子片段，因此可以通過PB-UVPD來識別堿金屬加合物的雙鍵位置。

5 結(jié)論與展望