王曉燕，王思怡，楊 婷，王建華

(東北大學 理學院化學系，遼寧 沈陽 110819)

生物傳感分析在環(huán)境監(jiān)測、食品安全、臨床診斷以及生物反恐等領域發(fā)揮著重要作用，其中，作為生物傳感探針的核心元件，目標識別分子的選擇至關重要，直接決定了檢測的靈敏度和準確度。為此，人們不斷尋找各種與目標物具有親和性和特異性的識別分子，如抗體、抗生素、多肽及適配體等[1]。噬菌體展示技術是一種強大的分子進化手段，可在短時間內(nèi)高效獲取親和力媲美抗體的目標識別多肽[2]。將表面展示有目標識別多肽的噬菌體作為目標識別元件構建傳感分析體系，具有抗體、多肽和適配體不可比擬的優(yōu)勢[3-7]。M13噬菌體是噬菌體展示技術中應用最廣泛和最成熟的噬菌體[8]。M13噬菌體展示技術的初期研究主要集中在抗原表位鑒定、抗體識別以及蛋白-蛋白間的相互作用等[9-10]。隨著研究深入，M13噬菌體精確的結構特征、較強的環(huán)境適應能力以及低的生產(chǎn)成本等優(yōu)勢逐漸凸顯，其應用也越加廣泛。本文綜述了近年來M13噬菌體在光學傳感、電化學傳感、石英晶體微天平傳感以及成像分析等領域的應用，并對其在分析傳感領域的應用進行了展望。

1 M13噬菌體的結構特征

M13噬菌體是一種專門感染細菌的柔性絲狀病毒，具有嚴格的宿主選擇性，對人體無害。M13噬菌體的結構簡單，整體呈圓柱形，長880 nm，直徑6.6 nm[11](圖1)，其表面由多達2 700個拷貝的主要衣殼蛋白pⅧ通過螺旋形式包裹而成，內(nèi)部為單鏈環(huán)狀DNA[12]；野生型M13噬菌體pⅧ亞基的前8個氨基酸中有2個氨基和3個羧基暴露在外，因此可以對其進行化學修飾而不影響病毒粒子的完整性和感染性[13]。同時，M13噬菌體pⅧ蛋白中間部分的非極性氨基酸提高了噬菌體的化學穩(wěn)定性，使得M13噬菌體具有耐極端酸度和離子強度的能力。此外，在噬菌體的兩端分別還有管鞘狀的4種次要衣殼蛋白pⅦ、pⅨ、pⅢ和pⅥ[14]。M13噬菌體的5種衣殼蛋白均由其內(nèi)部的單鏈環(huán)狀DNA編碼而成，因此，通過基因工程手段可以將外源多肽或蛋白與衣殼蛋白融合表達，從而實現(xiàn)M13噬菌體的表面功能化[15]，噬菌體展示技術也應運而生。

圖1 M13噬菌體的結構示意圖Fig.1 Structure diagram of M13 phage

2 噬菌體展示技術

1985年，Smith[16]發(fā)現(xiàn)將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ中時，該外源基因編碼的多肽會以融合蛋白的形式表達在噬菌體衣殼蛋白pⅢ中，從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術。簡單來講，噬菌體展示技術是通過基因重組的方式，將外源蛋白或多肽的基因序列插入噬菌體衣殼蛋白的基因序列中，進而在噬菌體衣殼蛋白的相應位置表達出對應的外源蛋白或多肽而不影響噬菌體正常生理功能的技術。該技術巧妙地實現(xiàn)了蛋白質基因型與表型的統(tǒng)一。利用噬菌體展示技術可構建噬菌體展示文庫，包括噬菌體肽庫、噬菌體蛋白庫以及噬菌體抗體庫等。結合生物淘選[4]，即可從噬菌體展示文庫中獲得對特定目標如糖類、毒素、蛋白、小分子或完整細胞等具有高特異性親和力的噬菌體單克隆[17]。基于此，該技術能在短時間內(nèi)將與靶標結合的克隆進行反復篩選和擴增，最終實現(xiàn)多肽或蛋白的定向進化。噬菌體展示技術因此被認為是一種強大的分子選擇進化技術[18]。目前，噬菌體展示技術已被應用于抗原表位分析[19]、蛋白相互作用[20]、疫苗研制[21-22]、藥物研發(fā)[23-25]以及靶向多肽的篩選[26]等領域，利用該技術可進化出抵抗自身免疫性疾病以及治愈轉移性癌癥的抗體，對保障人類健康意義重大，噬菌體展示技術也因此獲得了2018年的諾貝爾化學獎[27]。此后，該技術在生物傳感[28]、生物醫(yī)學[29]以及功能材料制備[30]等領域中得到了進一步應用。隨著該技術在生物領域中應用的日益深入，噬菌體制劑對人體的安全性也將逐漸引起人們的關注。目前，噬菌體展示技術依然需要更深層次的探索，例如，噬菌體展示技術多用于表達分子量較小的多肽或蛋白，而對于分子量較大的蛋白還存在著無法表達或表達數(shù)量極少的困境，這或許可以通過將多種噬菌體共同參與蛋白表達來加以改進；同時，目前噬菌體展示技術的應用多停留于功能性噬菌體的構建或篩選而忽略了噬菌體和靶標作用機理的深入研究，若能明確兩者之間的相互作用并適當?shù)貙λ磉_的多肽進行修飾，或可進一步增強噬菌體對靶標的結合能力。

3 M13噬菌體的分析傳感應用

對于分析傳感而言，能夠快速識別目標物并能產(chǎn)生可讀信號的探針是其核心元件。檢測探針的選取往往取決于其特異性、選擇性、檢測性能、存儲條件、可操作性及環(huán)境穩(wěn)定性等[17]。M13噬菌體是噬菌體展示技術應用最廣泛和成熟的噬菌體，其本身具有良好的水溶性、化學穩(wěn)定性以及較強的環(huán)境耐受能力；而得益于噬菌體展示技術的發(fā)展，M13噬菌體還可表達與目標物有特異性結合能力的多肽或蛋白，因而在分析傳感領域表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢：與抗體和適配體相比，M13噬菌體性能更穩(wěn)定，在惡劣環(huán)境下不易失活且生產(chǎn)成本低[31]；與雜交瘤技術相比，M13噬菌體展示技術的可篩選范圍更廣，并且可通過基因和分子進化方法調控探針的特異性和選擇性，以增強探針的親和力和穩(wěn)定性；同時M13噬菌體的存儲方便，在37 ℃下可至少保存6個月[32]。因此M13噬菌體是用于構建傳感探針的良好選擇。

3.1 光學傳感

3.1.1免疫熒光法M13噬菌體用于傳感分析的最常用方法是將信號分子偶聯(lián)到篩選所得的噬菌體衣殼蛋白表面，從而實現(xiàn)目標物的識別與檢測。如從噬菌體隨機十二肽庫中篩選得到與葡萄球菌毒素SEB有親和力的M13噬菌體，并將熒光染料Cy5標記在該M13噬菌體上，可實現(xiàn)SEB的免疫熒光檢測，這也證明了噬菌體展示肽用于構建生物傳感探針的可行性[33]。用Cy5標記的M13噬菌體作為傳感探針還可檢測海水中的2,4,6-三硝基甲苯(TNT)，這也是首例在非生理環(huán)境下進行噬菌體篩選并檢測小分子的報道[34]。此外，M13噬菌體pⅢ蛋白通常為3～5個拷貝，而體側的pⅧ蛋白高達2 700個拷貝，因此，通過利用3～5個拷貝的pⅢ蛋白表達目標識別多肽，并在2 700個拷貝的pⅧ蛋白外偶聯(lián)報告分子，即可實現(xiàn)有效的信號放大。如Goldman等[35]在M13噬菌體的pⅢ蛋白上表達了蓖麻毒素的單域抗體(sdAb)，然后采用DyLight 549對M13噬菌體的pⅧ蛋白進行熒光標記，和單獨使用sdAb進行熒光免疫檢測相比，前者的檢測靈敏度提高了5～10倍，檢出限從1 ng/mL降低至64 pg/mL。

3.1.2表面等離子體共振分析20世紀90年代，人們發(fā)現(xiàn)了表面等離子體共振(Surface plasmon resonance，SPR)現(xiàn)象[36]，將SPR效應與高特異性和高親和力的抗體相結合可直接用于分析檢測，無需進行額外信號標記或樣品預處理[37]。利用這一特性，人們發(fā)展了多種基于SPR效應的免標記光學檢測方法[38]。近年來，大量實驗證明噬菌體可以有效替代抗體與SPR技術相結合，且噬菌體的生產(chǎn)成本低、耗時短。Karoonuthaisiri等[39]從商品化的Ph.D.-12噬菌體隨機展示多肽文庫中篩選得到與沙門氏菌有特異性結合能力的M13噬菌體MSal020417，并將該噬菌體固定到CM5 SPR芯片上，從而構建了基于M13噬菌體的SPR檢測沙門氏菌的方法。Kim等[40]采用基因工程手段在M13噬菌體pⅧ蛋白上融合表達了鏈霉親和素結合短肽HPQ，并將噬菌體定向排列構建SPR傳感器用于捕獲和檢測鏈霉親和素，噬菌體的各向異性有效提高了SPR的靈敏度，靈敏度可低至fmol(圖2A)。

3.1.3比色法貴金屬納米粒子獨特的SPR效應使其在比色傳感中得到了廣泛應用。M13噬菌體的納米尺寸與貴金屬納米粒子具有較好的兼容性，通過將貴金屬納米粒子偶聯(lián)到M13噬菌體的衣殼蛋白表面，可構建基于M13噬菌體-貴金屬納米粒子的比色傳感體系。由于每個噬菌體表面可偶聯(lián)多個納米粒子，因此檢測信號明顯增強。如Cha課題組[41]首先從噬菌體文庫中篩選得到能識別抗原模型IgG的噬菌體，然后將pⅧ蛋白巰基化修飾用于結合納米金，最終通過測量納米金的吸光度值對IgG進行定量，檢出限可達100 fmol。在此基礎上，該小組改進了納米金的偶聯(lián)方法，首先在噬菌體pⅧ蛋白上修飾DNA，之后通過與互補鏈修飾的納米金雜交的方式有效提高了pⅧ蛋白上偶聯(lián)納米金的量，進而提高了方法的靈敏度，檢出限低至25 fmol(圖2B)[42]。M13噬菌體表面衣殼蛋白含有還原性氨基酸殘基可同時作為還原劑和保護劑，從而實現(xiàn)納米金在其表面的原位生長[43-45]。Wang等[46]從噬菌體肽庫中篩選出對Hg(Ⅱ)具有良好親和力的M13噬菌體，并在其表面原位生長納米金，Hg(Ⅱ)經(jīng)親汞噬菌體表面汞結合肽捕獲后，被噬菌體表面還原性氨基酸殘基還原為汞單質進而沉積于納米金表面，由此產(chǎn)生納米金的SPR吸收光譜改變，從而建立了簡便可靠的目視法Hg(Ⅱ)傳感體系。親汞噬菌體對汞離子的高選擇性捕獲和金汞天然高親和力共同賦予該方法強的抗干擾能力，使其對干擾離子的耐受倍數(shù)遠高于其他基于納米金比色傳感Hg(Ⅱ)的方法。M13噬菌體對目標物的識別能力除了可通過噬菌體文庫篩選技術獲取之外，還可通過融合表達目標物結合肽來實現(xiàn)。M13噬菌體對含F(xiàn)性菌毛的大腸桿菌具有侵染性，是因為其pⅢ蛋白具有對應的宿主菌識別肽。Peng等[3]通過將原M13噬菌體宿主菌識別肽替換為可識別其他宿主菌的多肽，并通過偶聯(lián)納米金作為信號輸出，實現(xiàn)了嵌合M13噬菌體-納米金復合物對多種微生物的高選擇性檢測。

3.1.4熒光共振能量轉移法熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)的基本原理是激發(fā)能通過偶極-偶極耦合從供體轉移至受體同時引發(fā)受體產(chǎn)生熒光，其中，能量轉移過程是通過空間的相互作用完成，基本不受溶劑或大分子的影響，而對供體和受體間距離的要求十分苛刻，也是實現(xiàn)FRET的關鍵。有機染料、共軛聚合物、半導體納米晶、量子點等已被廣泛開發(fā)并應用于FRET分析檢測[47]。雖然這些材料具有高量子效率和電子親和能，但分子接觸引起的猝滅過程使得其無法獲得最優(yōu)能量轉移效率，因此，對分子間距進行可控設計可大大提高FRET效率[48]。M13噬菌體明確的結構(pⅧ蛋白N末端的距離約為3.2 nm和2.4 nm)及特異性結合特性使得其在構建FRET體系中具有獨特優(yōu)勢。Chen等[49]報道了一種基于M13噬菌體構建的FRET熒光探針，實現(xiàn)了對胞內(nèi)pH的傳感檢測。該法首先通過化學方法將β-環(huán)糊精(β-CD)修飾在噬菌體pⅧ蛋白上，而后將對pH敏感的異硫氰酸熒光素(FITC)與不敏感的羅丹明B(RhB)通過金剛烷基與β-CD的主客體識別進行連接，從而實現(xiàn)熒光能量從FITC(供體)到RhB(受體)的轉移(圖2C)。

圖2 M13噬菌體在表面等離子體共振(A)[40]、比色(B)[42]、熒光共振能量轉移(C)[49]以及表面增強拉曼散射(D)[54]中的應用Fig.2 Application of M13 phage in optical analysis,including SPR(A)[40],colorimetric method(B)[42],FRET(C)[49] and SERS(D)[54]

3.1.5表面增強拉曼散射分析1974年，F(xiàn)leischmann等[50]在表面粗糙的銀電極上觀察到了吡啶的拉曼光譜，隨后，Jeanmaire和Duyne[51]在1977年通過系統(tǒng)的實驗和計算闡述了其機理，并指出這是一種表面增強拉曼散射(Surface enhanced Raman scattering，SERS)光譜效應。從理論上講，附著在金屬納米材料表面的分子可顯著增強拉曼信號，其增強因子達1011～1012，SERS因此可以作為強大的高靈敏度檢測光譜技術，并已被廣泛應用于各種生物或化學傳感中，如單分子檢測、生物標記、環(huán)境監(jiān)測以及法醫(yī)檢測等[52]。M13噬菌體由于具有獨特的特異性結合能力，因此被作為識別分子與SERS聯(lián)用進行生物分析，而其高拷貝的pⅧ蛋白也可通過偶聯(lián)SERS信號分子進一步提高檢測靈敏度。如Lee等[53]將DNA修飾Au@Ag核殼納米顆粒與互補鏈修飾的M13噬菌體相結合，建立了新型的生物傳感體系，得益于M13噬菌體的高比表面積，相比于DNA-抗體體系，DNA-M13噬菌體體系的檢測信號增大了75倍。此外，M13噬菌體-SERS體系還可用于農(nóng)藥殘留物的檢測(圖2D)[54]和疾病診斷，Ngugen等[55]將富含半胱氨酸的M13噬菌體與介孔SERS基底相結合，實現(xiàn)了對膿毒癥標志物的檢測；Lentini等[56]制備了噬菌體-納米銀體系用于淋巴瘤細胞U937的鑒別。

可以看出，M13噬菌體在高靈敏光學傳感應用中具有顯著優(yōu)勢，但同樣會受到光學檢測固有屬性的限制，比如比色傳感無法檢測有顏色干擾的樣品；此外，相對抗體、適配體等配體，M13噬菌體保存更方便，非常適合用于構建便攜式光學傳感器，但目前該領域的研究很少。

3.2 電化學傳感

噬菌體應用于電化學傳感領域同樣具有較好的分析性能。2005年，Neufeld等[57]以M13噬菌體以及大腸桿菌TG-1為模型，建立了檢測細菌的電化學分析方法。將堿性磷酸酶基因pFLAG-ATS-BAP插入M13KO7噬菌體中，當噬菌體進入宿主菌TG-1后，便會產(chǎn)生大量堿性磷酸酶，酶與細菌內(nèi)的底物對氨基苯基磷酸鹽的反應活性可轉化為電化學信號。該方法靈敏度好，檢出限低至1 cfu/mL。利用噬菌體構建電極，不僅穩(wěn)定性強且靈敏度高[58-60]。M13噬菌體近2 700拷貝的pⅧI蛋白，每個蛋白均可連接酶或者報告分子，因此將表達有親和多肽的M13噬菌體用于檢測，其靈敏度會比僅使用抗體高出幾百倍[61](圖3)。Sedki團隊[62]通過EDC/NHS法將M13噬菌體固定到表面沉積有納米金的玻碳電極上，利用M13噬菌體與含F(xiàn)性菌毛的大腸桿菌之間特有的親和性，首次建立了一種高靈敏的阻抗法(EIS)電化學傳感器用于大腸桿菌菌群的早期檢測，選擇性較高，檢出限僅為14 cfu/mL，并且該方法在實際樣品中具有優(yōu)越的抗干擾能力。雖然將噬菌體用于電化學檢測具有優(yōu)異的靈敏度和高選擇性，但直接用噬菌體修飾電極進行檢測，其制備過程復雜，且電極在經(jīng)過反復數(shù)次使用后，檢測性能會不可避免地下降，因此有必要進一步開發(fā)和制備便捷且檢測性能穩(wěn)定的噬菌體修飾電極。

3.3 石英晶體微天平傳感

石英晶體微天平(Quartz crystal microbalance，QCM)用于免疫傳感時，主要依賴于抗體的選擇性和親和力。然而，使用抗體存在許多固有缺陷，比如成本高、可重復利用性差、固定困難以及易損壞等。相反，噬菌體展示多肽具有良好的耐久性、可重復使用性、穩(wěn)定性好以及成本生產(chǎn)低等優(yōu)勢，同時還具有與抗體同等的特異性和靈敏度。Petrenko和Olsen等[2,63]先后提出并用實驗證明了噬菌體用于QCM的概念，同時還發(fā)現(xiàn)，噬菌體可以很容易地通過物理吸附固定在QCM的金電極上，這是優(yōu)于抗體的另一大優(yōu)勢。此外，由于噬菌體具有良好的耐受性，Yang等[64]將M13噬菌體固定在QCM的金電極上用于檢測抗體，并建立了可再生傳感電極表面，僅用0.5 mol/L的鹽酸溶液處理電極即可將與噬菌體結合的抗體去除而不影響噬菌體對抗體的再次結合能力。目前，基于噬菌體的QCM傳感主要利用噬菌體對宿主菌的天然選擇性進行檢測，這使得其適用范圍有所局限；另外，雖然利用噬菌體修飾的電極重復使用率高于抗體，但使用次數(shù)依然有限，因此也限制了基于噬菌體QCM傳感的應用。

3.4 成像分析

成像和無損檢測一直是醫(yī)學界不斷探索和發(fā)展的領域，對疾病的早期發(fā)現(xiàn)和治療具有十分重要的意義。通過基因工程或化學修飾，可在M13噬菌體的衣殼蛋白表面同時連接靶向配體和成像分子，從而將靶向性和成像功能巧妙地結合起來以實現(xiàn)靶向成像分析。例如通過生物素連接酶將不同的量子點分別修飾到篩選所得兩種靶向噬菌體表面，可實現(xiàn)對細胞不同蛋白的雙色成像[65]。分別在M13噬菌體pⅢ和pⅧ蛋白上同時表達對腫瘤標志物SPARC和磁性氧化鐵納米顆粒有親和力的多肽，可用于小鼠體內(nèi)癌細胞和腫瘤的靶向磁共振成像[66]；此外，與其他近紅外熒光染料相比，利用M13噬菌體制備近紅外熒光納米材料(SBP-M13-SWNT)用于體內(nèi)靶向彌散性腫瘤的信噪比更好，對腫瘤的檢測和指導切除能力也明顯提高[67](圖4)。除了能夠對腫瘤細胞進行成像分析，M13噬菌體還可用于構建體內(nèi)感染性疾病的靶向成像。2013年，Belcher課題組[32]將M13噬菌體與熒光染料結合，不僅實現(xiàn)了對有無F菌毛的細菌感染的成像區(qū)分，還可進一步在M13噬菌體pⅢ蛋白上連接某種細菌抗體，從而對特定細菌感染進行靶向成像。由于M13噬菌體pⅧ蛋白的高拷貝數(shù)，利用M13噬菌體構建的體內(nèi)靶向成像探針的信噪比更高，且與近紅外材料相結合，穿透力更強，非常適合用于機體深層次的組織和細胞成像分析，但目前相關研究并不多，并且其在體內(nèi)的代謝機制和對人體的安全性也尚不明確。

圖4 SBP-M13-SWNT 指導手術切除腫瘤[67]Fig.4 Surgical removal of tumors with SBP-M13-SWNT guidance [67]

4 結論與展望

對于M13噬菌體，無論是其內(nèi)部基因還是外層衣殼蛋白結構，都非常簡單和易于修飾。同時，大量的研究報告證實，噬菌體用作識別探針或生物模板，不僅具有良好的特異性，還具有優(yōu)越的環(huán)境耐受性。通過噬菌體展示文庫可獲得大量靶向多肽，因此，進一步開發(fā)噬菌體多功能化的修飾方法以及探索高親和性和特異性噬菌體的篩選方法，也將推動基于噬菌體的多模式和多靶標檢測的發(fā)展，M13噬菌體在分析傳感領域的應用也將會更加廣泛；其次，深入研究噬菌體與靶標分子間的相互作用，有助于更好地選擇信號分子和分析方法，從而實現(xiàn)目標分子的高靈敏檢測；最后，基于噬菌體構建的傳感探針，往往能適應更寬的溫度及pH值變化范圍，穩(wěn)定性較好，因而可發(fā)展基于噬菌體的便攜式檢測試劑盒用于更為復雜的實際樣品分析。