馬韻芳，潘麗娜，李 圳，高蓓莉，胡家安#，徐志紅#

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院老年病科，上海200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院呼吸與危重癥科，上海200025

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的80%～85%，是全球癌癥死亡的首要病因［1］。Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）是NSCLC患者中最常見的致癌驅(qū)動突變基因之一［2-3］，15%～20%的NSCLC患者攜帶有KRAS基因突變。KRAS突變主要位于12號染色體的外顯子12、13和61，其中外顯子12 突變約占NSCLC 所有KRAS突變的90%［3］。KRAS突變已被認為是NSCLC預(yù)后不良的標志，預(yù)示患者總生存期的縮短和腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險的升高［4］。KRAS突變的NSCLC患者并不能從鉑類化學(xué)治療方案中獲得總生存期的延長，對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR） 酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）的治療反應(yīng)也很差。目前，KRAS突變型NSCLC患者迫切需要更有效的治療策略。

免疫檢查點抗體通過靶向程序性死亡蛋白配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）或程序性死亡蛋白1 （programmed cell death 1，PD-1） 阻斷PD-1 通路，在以KRAS/RAF突變?yōu)槌Ｒ婒?qū)動事件的多種惡性腫瘤中（包括NSCLC）顯示出良好的臨床療效［5］。然而，關(guān)于抗PD-1 抗體（納武單抗和帕姆單抗）的臨床研究指出，在非選擇性NSCLC 患者中，PD-1 抗體的應(yīng)答率僅為20%［6］。多項臨床試驗表明抗PD-1/PD-L1 藥物的療效與NSCLC 患者腫瘤中PD-L1 的陽性率密切相關(guān)，PD-L1表達越高則療效越佳［6-11］。對腫瘤細胞PD-L1 陽性率≥50%的NSCLC 患者使用帕姆單抗治療，其應(yīng)答率和無進展生存期均有所提高［7］。在該患者隊列中，KRAS突變型比KRAS野生型腫瘤PD-L1 陽性率更高。Kim 等［12］所做的meta 分析顯示，在KRAS突變的晚期NSCLC 患者中，免疫檢查點抑制劑與多西他賽相比，提高了患者的總生存率。這些證據(jù)表明KRAS突變狀態(tài)可能是免疫治療生存獲益的潛在生物標志物。Lan 等［13］的研究觀察到，PD-L1 的表達與KRAS基因突變存在顯著的相關(guān)性（P=0.006）。然而，NSCLC 患者不同KRAS突變亞型與PD-L1 表達之間的相關(guān)性目前尚不清楚。本研究為進一步探索KRAS突變亞型與PD-L1 表達之間的關(guān)系，首先在NSCLC 細胞系中檢測了KRAS的突變狀態(tài)以及PD-L1mRNA 和蛋白的表達水平，并分析兩者之間的關(guān)系。其次，采用免疫組織化學(xué)（免疫組化）方法進一步檢測了77 例早期NSCLC 患者中PD-L1 的表達情況。然后，觀察了KRAS突變狀態(tài)對RAS 下游信號通路的影響。最后，探索了TKIs （RAS 下游通路信號分子的抑制劑） 對KRAS突變型NSCLC 細胞PD-L1 表達的調(diào)控作用，以探討KRAS調(diào)控PD-L1 的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株和腫瘤樣本

本研究使用的47 株NSCLC 細胞系，包括25 個KRAS突變株和22 個KRAS野生型（wild type，WT）細胞株，分別購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）、日本理化學(xué)研究所（RIKEN）、日本研究生物資源（JCRB）細胞庫和歐洲認證細胞培養(yǎng)物收藏中心（ECACC）。細胞株均采用含10%胎牛血清、青霉素（100 IU/mL） 和鏈霉素（100 μg/mL）的適宜培養(yǎng)基，在37 ℃、含5% CO2的加濕環(huán)境中培養(yǎng)。所有實驗均使用指數(shù)生長期的細胞。

本研究共納入2013—2017 年在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院接受常規(guī)手術(shù)且經(jīng)病理學(xué)檢查確診為早期NSCLC（Ⅰa～Ⅱb 期）的患者共77 例，均未接受術(shù)前治療。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟頒布的第8 版肺癌分期標準［14］對患者進行分類。這些患者的腫瘤標本按照標準程序經(jīng)甲醛溶液固定后制成石蠟包埋組織。

本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院機構(gòu)審查委員會和倫理委員會批準，所有患者均簽署書面知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

TKIs 包括RAF 抑制劑達拉非尼、有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated-protein kinase，MEK）抑制劑司美替尼、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抑制劑GDC0941、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱為AKT）抑制劑MK2206、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR） 抑制劑雷帕霉素、 核糖體S6 蛋白激酶（ribosomal S6 protein kinase，p70S6K）抑制劑LY2584702均購自MedChem Express公司。

胎牛血清購自美國Hyclone公司，青霉素和鏈霉素購自美國Life Technologies 公司，蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche 公司， 聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Millipore 公司，EDTA 緩沖液（pH 9.0， G1203-250ML） 購自中國Servicebio 公司，RNeasy Mini 試劑盒購自德國QIAGEN公司，PrimeScript RT 試劑盒購自日本TaKaRa 公司，SYBR Green 試劑購自美國Life Technologies 公司，擴增引物購自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，DAB 顯色試劑盒購自丹麥Dako公司。

AKT抗體（sc-8312）購自美國Santa Cruz公司，p-AKT抗體（S473，#4060）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）抗體（#4695）、p-ERK 抗體（T202/Y204， #9106）、 p-p70S6K 抗體（T389， #9206）購自美國Cell Signaling Technology公司，mTOR抗體（6585-1） 購自美國Epitomics 公司，p-mTOR 抗體（S2448，ab109268）、p70S6K 抗體（ab9366）、PD-L1 抗體（ab228462）購自英國Abcam 公司，甘油醛-3-磷酸脫氫 酶 （glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（080922）購自中國Abmart公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（G1215-200T）購自中國Servicebio公司。

移液器、低溫高速離心機（Eppendorf，德國），實時熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士），ChemiScope 3500 化學(xué)發(fā)光成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司），流式細胞儀FACStation（BD，美國）。

1.3 實時定量PCR

分別提取47 個NSCLC 細胞株的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA 為模板進行實時定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR），擴增PD-L1基因。正向引物為5′-CCGAAGTCATCTGGACAAGCA-3′，反向引物為5′-CTTCTCCTCTCTCTTGGAATTGGT-3′。PCR 擴增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，50～60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。

1.4 Western blotting

提取NSCLC 細胞的總蛋白，蛋白定量后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入一抗（GAPDH 抗體、AKT 抗體、p-AKT 抗體、ERK 抗體、p-ERK 抗體、mTOR 抗體、p-mTOR 抗體、p70S6K抗體以及p-p70S6K抗體）稀釋液，于搖床上室溫孵育2 h。PBS 洗膜后二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h。滴加化學(xué)發(fā)光試劑顯影，調(diào)整曝光，置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測。圖像灰度由Image J軟件進行分析。

1.5 熒光活化細胞分選法

用胰蛋白酶消化細胞，用培養(yǎng)液洗滌細胞，然后在熒光活化細胞分選（fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）緩沖液中進行抗體染色。流式細胞儀檢測PD-L1的表達，使用CytExpert 1.1軟件進行分析。PD-L1相對表達量=PD-L1的平均熒光強度/同型對照的平均熒光強度。

1.6 免疫組化染色

將77 例NSCLC 腫瘤患者肺癌組織連續(xù)切片、脫蠟、水化后，置于EDTA 緩沖液（pH 9.0）中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶處理后用3%牛血清白蛋白室溫封閉30 min。加入PD-L1 單克隆抗體（1∶100稀釋），于4 ℃冰箱孵育過夜。PBS 洗滌，加入HRP 標記的二抗（1∶2 000 稀釋）室溫下孵育50 min 后PBS 沖洗3次。最后，使用DAB 顯色試劑盒顯色，脫水封片，進行染色分析。

1.7 陽性細胞計數(shù)方法及結(jié)果判讀

本次實驗采用腫瘤細胞陽性比例分數(shù)（tumor proportion score，TPS）的計數(shù)方式（即只計數(shù)腫瘤細胞），陽性腫瘤細胞計數(shù)方法及結(jié)果判讀標準參照PD-L1（22C3）專用檢測試劑盒的判讀標準及計分標準。判讀標準：計數(shù)的腫瘤細胞數(shù)≥100 個；任何染色強度的膜染色（包括完整和/或不完整膜陽性）均為陽性，單純胞質(zhì)或胞核染色不能判為陽性染色；陽性結(jié)果記錄為具體的百分比。TPS＜1%為陰性，TPS介于1%～49%為低表達，TPS≥50%為高表達。所有染色結(jié)果均由2位病理科專家進行獨立判定和評分。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布定量資料用±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗；非正態(tài)分布定量資料2組間比較采用秩和檢驗。定性資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 細胞株和腫瘤組織中PD-L1 表達與KRAS 突變狀態(tài)有關(guān)

采用qPCR 法檢測47 個NSCLC 細胞株P(guān)D-L1mRNA的表達情況，包括25 個KRAS突變株和22 個KRASWT 細胞株。如圖1 所示，KRAS突變細胞株的PD-L1mRNA 表達水平顯著高于KRASWT 細胞株（P=0.003），而EGFR、TP53不同突變狀態(tài)，不同肺癌組織類型（腺癌與鱗狀細胞癌）NSCLC 細胞株的PD-L1mRNA 表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，KRASG12V 突變、KRASG12C 突變及其他KRAS突變細胞株的PD-L1mRNA表達水平均顯著高于KRASWT 細胞株（P值分別為0.000、 0.033、0.045），其中KRASG12V 突變株的PD-L1mRNA 表達水平最高。

圖1 NSCLC細胞株P(guān)D-L1 mRNA表達與KRAS、EGFR、TP53突變狀態(tài)及肺癌組織學(xué)類型間的關(guān)系Fig 1 Correlations between PD-L1 mRNA expression and KRAS,EGFR,TP53 mutation status and histological types in the NSCLC cell lines

通過流式細胞術(shù)檢測KRASWT 和KRAS突變型NSCLC 細胞株中PD-L1 的表達情況，結(jié)果（圖2）顯示KRAS突變株P(guān)D-L1 蛋白的表達約是KRASWT 株的23 倍（54.2±7.0vs2.4±0.4，P=0.000），其中KRASG12C 突變株的PD-L1蛋白表達水平最高，在不同突變亞型之間PD-L1蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

此外，本研究通過免疫組化法檢測了77例早期（Ⅰa～Ⅱb期）NSCLC患者腫瘤組織中PD-L1的表達情況（圖3），包括10例WT型、15例G12A突變型、12例G12C突變型、21例G12D突變型和19例G12V突變型。結(jié)果顯示，KRASG12D和G12V突變型中分別有28%和53%患者腫瘤組織PD-L1的TPS≥50%，顯著高于KRASWT患者（表1）。

圖2 FACS檢測PD-L1在NSCLC細胞系中的表達情況Fig 2 Expression of PD-L1 in the NSCLC cell lines detected by FACS

圖3 早期NSCLC患者腫瘤組織免疫組化染色Fig 3 Immunohistochemical staining of tumor tissues in the early NSCLC patients

2.2 KRAS 突變型NSCLC 細胞株中，p70S6K 被激活，而AKT、mTOR未被激活

KRAS是RAS 家族的成員之一，參與調(diào)控RAS/PI3K/AKT/mTOR/p70S6K 信號通路。因此，本研究檢測了14個NSCLC 細胞株（包括4 個KRASWT 和10 個KRAS突變細胞株）中AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p70S6K和p-p70S6K 蛋白的表達。結(jié)果顯示，NSCLCKRAS突變株和WT 株AKT 與mTOR 信號分子的表達無明顯差異（圖4A），且蛋白質(zhì)半定量分析亦表明p-AKT/AKT 和p-mTOR/mTOR 在2 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4B）；而蛋白質(zhì)半定量分析結(jié)果提示KRAS突變株中p-p70S6K/p70S6K比值顯著增加（P=0.031）。

表1 不同KRAS狀態(tài)的早期NSCLC患者腫瘤組織PD-L1表達情況Tab 1 Expression of PD-L1 in the tumor tissues of early NSCLC patients with different KRAS states

隨后，用300 nmol/L和3 μmol/L LY2584702（p70S6K抑制劑）分別處理7 個NSCLC 細胞株（5 個KRAS突變株和2 個KRASWT 株）24 h 后，流式細胞術(shù)觀察PD-L1 表達的變化；結(jié)果發(fā)現(xiàn)300 nmol/L LY2584702 可誘導(dǎo)KRASG12C（NCIH1373）細胞株P(guān)D-L1 表達上調(diào)（P=0.039），而3 μmol/L LY2584702 則可使KRASG12V （CORL23）細胞株P(guān)D-L1表達下降（P=0.001），而在其他5個細胞株LY2584702均未引起PD-L1的明顯變化（圖5）。

圖4 Western blotting檢測RAS下游信號分子的表達Fig 4 Expression of RAS downstream signaling molecules by Western blotting

用1 μmol/L GDC0941（PI3K 抑制劑）、0.5 μmol/L MK2206（AKT 抑制劑）和10 nmol/L 雷帕霉素（mTOR抑制劑）分別處理6 種KRAS突變株24 h，同樣未觀察到PD-L1蛋白水平的變化（圖6A）。

2.3 在KRAS 突變型NSCLC 細胞株中，RAF 和MEK 對PD-L1的調(diào)控存在差異

KRAS不僅參與調(diào)控RAS/PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信號通路，還參與調(diào)控RAS/RAF/MEK/ERK 信號通路。本研究檢測了14 個NSCLC 細胞株（包括4 個KRASWT和10 個KRAS突變細胞株）中pERK、ERK 的蛋白水平。結(jié)果顯示，NSCLCKRAS突變株和WT 株之間p-ERK/ERK比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4）。

圖5 FACS檢測LY2584702對PD-L1表達的影響Fig 5 Influence of LY2584702 on the expression of PD-L1 by FACS

進一步用不同濃度達拉非尼（RAF 抑制劑）和司美替尼（MEK 抑制劑）分別處理6 種KRAS突變株24 h，通過流式細胞術(shù)檢測PD-L1 蛋白的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度（5 nmol/L） 達拉非尼僅在1 個KRASG12V 突變株（CORL23）和1 個KRASL19F 突變株（NCIH2347）引起PD-L1 表達的顯著升高（均P＜0.05），且呈一定劑量依賴性（圖6B）。而低濃度（0.1 μmol/L）司美替尼在3 個KRASG12V 突 變 株 （NCIH441、 CORL23 和RERFLCAD2） 和1 個KRASL19F 突變株（NCIH2347）引起PD-L1 表達的顯著變化，但均表現(xiàn)為下調(diào)（均P＜0.05），亦呈劑量依賴性（圖6B）。在其余突變細胞株中，達拉非尼或司美替尼需達到較高濃度才能引起PD-L1 的升高或降低。

圖6 FACS檢測TKIs對KRAS突變NSCLC細胞株P(guān)D-L1表達的調(diào)控Fig 6 Regulation of TKIs on the expression of PD-L1 in KRAS-mutant NSCLC cell lines by FACS

3 討論

在2020 版《非小細胞肺癌診療指南》中，多款免疫新藥被推薦用于NSCLC的一、二線治療，其中包括PD-1/PD-L1 抑制劑。多項臨床試驗［6-11］表明抗PD-1/PD-L1 藥物的療效與NSCLC 患者腫瘤中PD-L1 的表達水平密切相關(guān)：PD-L1 高表達（免疫組化TPS≥50%）的NSCLC 患者從PD-1 單抗治療中獲益最大，其客觀緩解率、中位無進展生存期、總生存期顯著好于TPS＜50%的群體。

肺癌中PD-1/PD-L1 的調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，與多個驅(qū)動基因及多條信號通路有關(guān)。前期研究［12］發(fā)現(xiàn)，肺癌驅(qū)動基因KRAS突變患者的腫瘤組織PD-L1 的表達較KRASWT 型高。但關(guān)于NSCLC 患者KRAS各突變亞型與PD-L1表達水平之間的關(guān)系，目前相關(guān)研究甚少，且結(jié)果不盡相同。

本研究發(fā)現(xiàn)，KRAS突變型NSCLC 細胞株P(guān)D-L1mRNA 和蛋白水平明顯高于KRASWT 細胞株，結(jié)果與既往研究［14-16］相符。其中，KRASG12V 突變細胞株P(guān)D-L1的mRNA 表達水平最高，G12C 突變細胞株P(guān)D-L1 的蛋白表達水平最高，這2 個亞型共占NSCLC 所有KRAS突變的60%以上。我們進一步采用免疫組化方法檢測了77 例早期NSCLC 患者中PD-L1 的表達情況，結(jié)果顯示PD-L1在KRASG12D 和G12V 突變型中呈高表達，而在G12C 和G12A 突變患者中表達不高，其結(jié)果似乎與上述NSCLC細胞層面的結(jié)果不完全一致。考慮到大多數(shù)NSCLC 細胞株來源于晚期腫瘤組織，而免疫組化的標本為早期NSCLC 患者腫瘤組織，故兩者之間存在差異。但無論是細胞層面還是組織層面，我們發(fā)現(xiàn)KRASG12V 突變型的PD-L1 表達均較高。我們由此猜測，KRASG12V 突變的NSCLC患者接受抗PD-1/PD-L1免疫治療的獲益率可能更高。闡明NSCLC 中KRAS突變狀態(tài)與PD-L1 表達之間的關(guān)系及調(diào)控機制具有重要臨床意義。

NSCLC 的美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network， NCCN） 指南指出，KRAS突變的NSCLC患者療效不佳與EGFR-TKI原發(fā)耐藥相關(guān)。目前尚無美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的靶向KRAS基因的抗腫瘤藥物，阻斷KRAS激活后的下游通路是KRAS突變治療策略的主要探索方向。KRAS下游的信號通路包括PI3K/AKT/mTOR/p70S6K 和RAF/MEK/ERK信號通路。前期研究［17］發(fā)現(xiàn)，在NSCLC 中EGFR 可通過PI3K/AKT 上調(diào)PD-L1 的表達；最新研究［18］發(fā)現(xiàn)，KRAS突變可導(dǎo)致人支氣管上皮細胞中MEK/ERK 依賴的PD-L1表達上調(diào)，從而介導(dǎo)了腫瘤的免疫逃逸。

mTOR 位于p70S6K 的上游，是信號通路的關(guān)鍵部分。最近研究［19-21］表明mTOR 信號對PD-L1 表達有正向調(diào)控作用，而Deng 等［22］研究發(fā)現(xiàn)抑制mTOR/p70S6K 信號可提高腫瘤細胞的PD-L1 水平。本研究發(fā)現(xiàn)，在KRAS突變的NSCLC 細胞株中p70S6K 被激活，而mTOR、AKT 未被激活。我們推測激活p70S6K 的不是mTOR，可能是上游的一些旁路信號，如磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（phosphoinositide dependent kinase-1，PDK1） 等。使用p70S6K 抑制劑處理KRAS突變株或WT株，PD-L1的表達較對照組均無明顯變化；由此我們推測，在KRAS突變NSCLC細胞株中，p70S6K 的激活與PD-L1的上調(diào)沒有直接關(guān)系。

本研究進一步檢測了KRAS突變型NSCLC 細胞株經(jīng)RAS/RAF/MEK 通路抑制劑處理后PD-L1 蛋白表達的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在KRAS突變的NSCLC 細胞株中，RAF抑制劑和MEK 抑制劑對PD-L1 的表達存在差異調(diào)控。RAF 抑制劑表現(xiàn)為上調(diào)PD-L1 的表達，而MEK 抑制劑表現(xiàn)為下調(diào)PD-L1 的表達；但由于僅MEK 抑制劑在低濃度時即可同時下調(diào)3 個KRASG12V 突變株的PD-L1 表達，且呈一定劑量依賴性，因此我們猜測在KRASG12V 突變株中，KRAS可能通過上調(diào)MEK誘導(dǎo)PD-L1的表達。

綜上所述，本研究從細胞、組織層面驗證了KRASG12V 突變型的NSCLC 患者PD-L1表達較KRAS WT型患者高，并推測KRASG12V 突變的NSCLC 細胞通過上調(diào)MEK 信號分子上調(diào)PD-L1的表達；因此KRASG12V 突變的NSCLC患者應(yīng)用PD-1/PD-L1免疫治療的獲益率可能較其他KRAS突變亞型高。本研究為KRAS突變的NSCLC患者治療策略的制定提供了新的思路。

參·考·文·獻

[1] Rothschild SI. Targeted therapies in non-small cell lung cancer: beyond EGFR and ALK[J]. Cancers(Basel),2015,7(2):930-949.

[2] Seigel RL,Miller KD,Jemal A,et al. Cancer statistics,2015[J]. CA Cancer J Clin,2015,65(1):5-29.

[3] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[4] Renaud S, Falcoz PE, Scha?ffer M, et al. Prognostic value of theKRASG12V mutation in 841 surgically resected Caucasian lung adenocarcinoma cases[J]. Br J Cancer,2015,113(8):1206-1215.

[5] Brahmer J, Reckamp KL, Baas P, et al. Nivolumabversusdocetaxel in advanced squamous-cell non-small-cell lung cancer[J]. N Engl J Med,2015,373(2):123-135.

[6] Borghaei H, Paz-Ares L, Horn L, et al. Nivolumabversusdocetaxel in advanced nonsquamous non-small-cell lung cancer[J]. N Engl J Med, 2015,373(17):1627-1639.

[7] Gettinger S, Rizvi NA, Chow LQ, et al. Nivolumab monotherapy for firstline treatment of advanced non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol,2016,34(25):2980-2987.

[8] Horn L,Spigel DR,Vokes EE,et al. Nivolumabversusdocetaxel in previously treated patients with advanced non-small-cell lung cancer:two-year outcomes from two randomized, open-label, phase Ⅲtrials (CheckMate 017 and CheckMate 057)[J]. J Clin Oncol,2017,35(35):3924-3933.

[9] Champiat S, Dercle L,Ammari S, et al. Hyperprogressive disease is a new pattern of progression in cancer patients treated by anti-PD-1/PD-L1[J].Clin Cancer Res,2017,23(8):1920-1928.

[10] Herbst RS, Baas P, Kim DW, et al. Pembrolizumabversusdocetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer(KEYNOTE-010):a randomised controlled trial[J]. Lancet,2016,387(10027):1540-1550.

[11] Fehrenbacher L, Spira A, Ballinger M, et al. Atezolizumabversusdocetaxel for patients with previously treated non-small-cell lung cancer (POPLAR): a multicentre, open-label, phase 2 randomised controlled trial[J]. Lancet,2016,387(10030):1837-1846.

[12] Kim JH, Kim HS, Kim BJ. Prognostic value ofKRASmutation in advanced non-small-cell lung cancer treated with immune checkpoint inhibitors: a meta-analysis and review[J]. Oncotarget,2017,8(29):48248-48252.

[13] Lan B, Ma C, Zhang C, et al. Association between PD-L1 expression and driver gene status in non-small-cell lung cancer: a meta-analysis[J].Oncotarget,2018,9(7):7684-7699.

[14] Nicholson AG, Chansky K, Crowley J, et al. The International Association for the Study of Lung Cancer Lung Cancer Staging Project:proposals for the revision of the clinical and pathologic staging of small cell lung cancer in the forthcoming eighth edition of the TNM classification for lung cancer[J].J Thorac Oncol,2016,11(3):300-311.

[15] Lococo F, Torricelli F, Rossi G, et al. Inter-relationship between PD-L1 expression and clinic-pathological features and driver gene mutations in pulmonary sarcomatoid carcinomas[J]. Lung Cancer,2017,113:93-101.

[16] Gridelli C, Ardizzoni A, Barberis M, et al. Predictive biomarkers of immunotherapy for non-small cell lung cancer: results from an Experts Panel Meeting of the Italian Association of Thoracic Oncology[J]. Transl Lung Cancer Res,2017,6(3):373-386.

[17] Lastwika KJ, Wilson W, Li QK, et al. Control of PD-L1 expression by oncogenic activation of the AKT-mTOR pathway in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Res,2016,76(2):227-238.

[18] Lee MH, Yanagawa J, Tran L, et al. FRA1 contributes to MEK-ERK pathway-dependent PD-L1 upregulation byKRASmutation in premalignant human bronchial epithelial cells[J]. Am J Transl Res,2020,12(2):409-427.

[19] Cavazzoni A, Digiacomo G, Alfieri R, et al. Pemetrexed enhances membrane PD-L1 expression and potentiates T cell-mediated cytotoxicity by anti-PD-L1 antibody therapy in non-small-cell lung cancer[J]. Cancers(Basel),2020,12(3):666.

[20] Chen MC,Pangilinan CR,Lee CH.Salmonellabreaks tumor immune tolerance by downregulating tumor programmed death-ligand 1 expression[J]. Cancers(Basel),2019,12(1):57.

[21] Chang HL, Kuo YH, Wu LH, et al. The extracts ofAstragalus membranaceusovercome tumor immune tolerance by inhibition of tumor programmed cell death protein ligand-1 expression[J]. Int J Med Sci, 2020,17(7):939-945.

[22] Deng L, Qian G, Zhang S, et al. Inhibition of mTOR complex 1/p70 S6 kinase signaling elevates PD-L1 levels in human cancer cells through enhancing protein stabilization accompanied with enhanced β-TrCP degradation[J]. Oncogene,2019,38:6270-6282.