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        基于加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析識別抑郁癥的差異表達基因模塊

        2021-07-02 09:28:48耿瑞杰黃欣欣禹順英苑成梅呂欽諭王慶中易正輝方貽儒
        關(guān)鍵詞:分析研究

        耿瑞杰,姚 琳,黃欣欣,禹順英,苑成梅,洪 武,呂欽諭,王慶中,易正輝#,方貽儒,5,6

        1.復旦大學附屬中山醫(yī)院心理醫(yī)學科,上海200032;2.上海交通大學醫(yī)學院附屬精神衛(wèi)生中心精神科,上海200030;3.上海市浦東新區(qū)南匯精神衛(wèi)生中心精神科,上海201399;4.上海中醫(yī)藥大學中藥研究所神經(jīng)藥理實驗室,上海201203;5.中國科學院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心,上海200031;6.上海市重性精神病重點實驗室,上海201108

        抑郁癥(major depressive disorder,MDD)是一種常見的精神疾病,具有高患病率、高致殘率、疾病負擔沉重等特點[1-4]。目前其病因及發(fā)病機制未明,尚無明確的實驗室檢測指標可用于診斷及預后。既往研究[5-8]提示抑郁癥有顯著的遺傳易感性,并且受心理與環(huán)境的影響,遺傳與環(huán)境的交互作用是抑郁癥發(fā)病的主要因素。

        雙生子研究[9]顯示抑郁癥的遺傳度約為37%,異卵雙生子的發(fā)病一致率為20%,同卵雙生子的發(fā)病一致率約為40%。家系研究[9]提示抑郁癥在家族中呈聚集現(xiàn)象,患者一級親屬的患病率是正常人的2~3倍。全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study,GWAS)表明,抑郁癥的遺傳性主要是通過常見的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)來解釋。然而直至目前,在一般人群中鑒定與抑郁癥相關(guān)的基因仍未取得顯著成效[10]。有研究[11]分別在抑郁癥首發(fā)階段分析18 759 例患者的120萬個常染色體和X 染色體的SNP,在抑郁癥復發(fā)階段分析6 783 個病例及50 695 個健康對照的554 個常染色體SNP,其結(jié)果顯示沒有SNP同時在抑郁癥的2個階段達到全基因組水平上的顯著性。Hyde 等[12]使用來自75 607 例抑郁癥患者和231 747 個健康對照者的自我報告數(shù)據(jù),并對這些結(jié)果與已發(fā)表的抑郁癥全基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果進行了meta分析;結(jié)果表明15個區(qū)域的17個獨立SNP 達到了全基因組水平上的顯著性。此外,一些針對抑郁癥患者血液基因表達譜的微陣列的研究和RNA 測序(RNA-seq) 研究也鑒定了許多差異表達基因(differentially expressed gene,DEG)[13-16];然而報道的DEG 在各項研究中差異較大,一項研究中鑒定出的大部分DEG 未能在其他研究中被重復獲得。雖然抑郁癥遺傳度較高,但是目前研究結(jié)果不甚理想:一方面可能是因為抑郁癥是遺傳與環(huán)境共同作用所致;另一方面,一些復雜疾病,特別是精神疾病,不是由單一基因起主要作用而是由許多微效基因共同作用的結(jié)果[17]。僅僅對單個基因功能水平的研究已經(jīng)限制了我們探索抑郁癥分子機制的進程,而通過構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò),從系統(tǒng)層面分析基因之間的相互作用成為下一步的研究熱點。加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析 (weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)是構(gòu)建基因共表達網(wǎng)絡(luò)的代表性方法,它基于無尺度拓撲結(jié)構(gòu)進行相似性度量和設(shè)定閾值,方法更具合理性并且已成功地應用到多個研究領(lǐng)域。

        1 對象與方法

        1.1 研究對象

        mRNA微陣列數(shù)據(jù)來自本課題組前期已經(jīng)完成的8例抑郁癥患者及8名健康對照者(對照組)的外周血mRNA微陣列分析實驗[18]。入組病例均為上海市精神衛(wèi)生中心精神科門診和心理咨詢門診的患者,以及心境障礙科住院患者。抑郁癥患者年齡(34.9±9.8)歲,已婚5 例,未婚3 例;對照組年齡(35.4±10.2)歲,已婚5 例,未婚3例。入組時抑郁癥患者漢密爾頓抑郁量表(Hamilton Depression Scale,HAMD)總分平均(22.75±3.54)分;對照組為上海市精神衛(wèi)生中心職工及學生。病例組及對照組之間無血緣關(guān)系。

        1.2 研究方法

        1.2.1 DEG 的篩選 應用t檢驗統(tǒng)計方法篩選抑郁癥患者與對照組的DEG[19],其中差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的基因被納入后續(xù)的分析。

        1.2.2 WGCNA 通過R 軟件中的WGCNA 包進行分析。通過計算每組基因的相似矩陣、鄰接矩陣、拓撲重疊矩陣,衡量節(jié)點間相異度等步驟繪制層次聚類樹(樹狀圖)。按照WGCNA 原理中無尺度網(wǎng)絡(luò)原則選擇鄰接函數(shù)的加權(quán)參數(shù)β。將關(guān)聯(lián)系數(shù)閾值設(shè)定為0.9(此時參數(shù)β=14)來構(gòu)建基因數(shù)據(jù)集的共表達網(wǎng)絡(luò)(圖1)。應用混合動態(tài)樹切割方法來切割分支,完成初步的模塊構(gòu)建后將基因較少的模塊進行合并。

        1.2.3 模塊-表型關(guān)聯(lián)和樞紐基因的鑒定 通過Pearson相關(guān)性分析評估上一步檢測到的模塊與抑郁癥之間的相關(guān)性。模塊eigengene(module eigengene,ME)是指給定模塊的第一主成分,代表整個模塊的基因表達譜。分別選取ME與抑郁癥正相關(guān)性和負相關(guān)性最強(相關(guān)系數(shù)絕對值最大)的2個模塊作為后續(xù)研究的候選模塊。這一步計算基于基因顯著性(gene significance,GS)、模塊身份(module membership, MM) 和模塊內(nèi)連接性(intramodular connectivity)。本研究中,GS的定義為基因和抑郁癥之間相關(guān)系數(shù)的絕對值;MM 的定義為ME與基因表達譜的相關(guān)性。每個基因的模塊內(nèi)連接性(連接值之和除以模塊內(nèi)基因的數(shù)量)用kWithin 值表示。具有高GS、高MM,且模塊內(nèi)連接性從高到低排名前3 位的基因被定義為模塊的樞紐基因[20],然后利用R 軟件中的igraph和qgraph包繪制模塊內(nèi)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。

        1.2.4 基因功能富集和網(wǎng)絡(luò)分析 利用metascape在線網(wǎng)站對候選模塊進行GO 功能富集分析和KEGG 通路分析(http://metascape.org/gp/index.html),計算出與富集基因功能相關(guān)生物學過程和信號通路。P值的計算基于超幾何分布檢驗,P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 數(shù)據(jù)預處理和DEG篩選

        mRNA 微陣列數(shù)據(jù)經(jīng)預處理后,從16 個樣品中獲得54 675 個基因的表達矩陣,比較抑郁癥患者和正常對照組,按P<0.05 的條件共得到4 125 個DEG 用于下一步研究。

        2.1.1 加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 按照WGCNA 原理中無尺度網(wǎng)絡(luò)原則選擇鄰接函數(shù)的加權(quán)參數(shù)β,采用WGCNA 中的step-by-step 法,完成基因共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建(圖1)。共識別出9 個mRNA 基因模塊,每個基因模塊包含195~696個基因,每個模塊用不同的顏色代替,用灰色表示無法合并到任何模塊的基因。

        圖1 基因聚類樹Fig 1 Dendrogram of gene clustering

        2.1.2 基因模塊與抑郁癥的相關(guān)性 計算9 個模塊的ME與抑郁癥的相關(guān)性(圖2),結(jié)果可見這9 個模塊均與抑郁癥呈顯著關(guān)聯(lián)。其中綠色(green)、紅色(red)、黃色(yellow)、粉色(pink)、青色(cyan)模塊與抑郁癥之間呈負相關(guān);cyan 模塊的負相關(guān)性最高,相關(guān)系數(shù)為-0.91(P=0.000)。藍綠色(turquoise)、棕色(brown)、黑色(black)、藍色(blue)這4 個模塊與抑郁癥呈正相關(guān);blue 模塊正相關(guān)性最強,相關(guān)系數(shù)為0.76 (P=0.000)。因此,選取cyan 模塊和blue 模塊作為候選模塊進行下一步研究。

        2.2 從候選模塊中識別樞紐基因并構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)

        計算每個基因的模塊內(nèi)連接性(kWithin 值),選取2個模塊中kWithin值最高的前50個基因,繪制基因相互作用圖。將2 個模塊中kWithin 值最高的前3 個基因認定為樞紐基因。Blue 模塊的樞紐基因為JAM2(junctional adhesion molecule 2)、SCRN2(secernin 2)和IGHV7-81(immunoglobulin heavy variable 7-81);cyan 模塊的樞紐基因為SCFD2(Sec1 family domain containing 2)、NR5A2(nuclear receptor subfamily 5 group A member 2) 和KCNMA1(potassium calcium-activated channel subfamily M alpha 1)。如圖3 和圖4 所示,所有的樞紐基因具有網(wǎng)絡(luò)中相鄰基因的緊密連接性。

        圖2 9個基因模塊的ME與抑郁癥的關(guān)聯(lián)圖Fig 2 The association between 9 MEs of gene modules and depression

        圖3 Blue模塊的基因相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Gene interaction network of the blue module

        圖4 Cyan模塊基因相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Gene interaction network of the cyan module

        2.3 模塊基因的功能注釋和通路分析

        利用metascape 對blue 模塊和cyan 模塊進行功能注釋和通路分析,結(jié)果提示cyan 模塊沒有富集到有統(tǒng)計學意義的KEGG 通路,blue 模塊的KEGG 通路則富集到3 條,分別為RNA 轉(zhuǎn)運、沙門菌感染和黑色素生成(圖5A)。Cyan 模塊共富集到GO 條目20 條,其中15 條與胚胎發(fā)育及細胞生長、凋亡有關(guān),2 條與細胞周期有關(guān),1 條與物質(zhì)運輸相關(guān);值得注意的是有1 條GO 條目為通過質(zhì)膜黏附分子的嗜同性細胞黏附(GO:0007156),與免疫及炎癥反應有關(guān);另有1條為跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路(GO:0007169),與細胞信號轉(zhuǎn)導有關(guān)。Blue 模塊共富集到15 條GO 條目,其中7 條與物質(zhì)加工轉(zhuǎn)運有關(guān)(圖5B)。

        圖5 Blue模塊和cyan模塊的生物注釋Fig 5 Biological annotation of blue module and cyan module

        3 討論

        WGCNA 軟件的算法是基于樣本之間表達譜的相似性來構(gòu)建基因共表達網(wǎng)絡(luò),以此對基因表達信息進行系統(tǒng)層面的描述分析。相對于傳統(tǒng)差異表達分析僅僅對單個基因功能水平進行研究,WGCNA 共表達網(wǎng)絡(luò)主要基于系統(tǒng)論,充分考慮到生命體的復雜性以及基因和基因之間的高階交互作用,可以揭示轉(zhuǎn)錄組系統(tǒng)層面的表達改變。WGCNA 已經(jīng)在多種疾病中廣泛應用,如腫瘤、帕金森病、孤獨癥等。在本研究中,我們利用WGCNA共識別出9個基因模塊,挑選出其中與抑郁癥正相關(guān)性和負相關(guān)性最強的2 個模塊,這2 個模塊的生物功能注釋提示免疫和炎癥反應可能在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定作用。既往許多研究[21-28]發(fā)現(xiàn),炎癥反應是一種重要的生物學反應,可能會增加重度抑郁發(fā)作的風險。最近,Wang 等[29]發(fā)現(xiàn)相比健康對照人群,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)在抑郁癥死亡患者的腦組織背外側(cè)前額葉皮質(zhì)和外周血中的表達量更高,提示抑郁癥患者體內(nèi)可能存在促炎細胞因子失調(diào)。此外,已有臨床研究[30-31]報道了TNF-α 特異性單克隆抗體對治療抑郁癥具有良好的效果。因此,炎癥反應可能在抑郁癥的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。

        在blue 模塊和cyan 模塊中共識別出6 個樞紐基因,即JAM2、SCRN2、IGHV7-81(blue 模塊),以及SCFD2、NR5A2、KCNMA1(cyan 模塊)。有證據(jù)提示JAM2、SCFD2、NR5A2和KCNMA1與抑郁癥之間存在一定的相關(guān)性。首先,根據(jù)CTD Gene-Disease Associations 數(shù)據(jù)庫可以檢索到JAM2、NR5A2、KCNMA1和抑郁癥顯著相關(guān),標準值分別為1.27、1.81 和1.37;GWASdb SNPPhenotype Associations數(shù)據(jù)庫也提示NR5A2、KCNMA1和抑郁癥顯著相關(guān),標準值分別為0.75 和0.61。Yi等[18]通過全基因組cRNA 微陣列研究發(fā)現(xiàn)SCFD2在抑郁癥患者中的表達顯著低于健康對照,差異倍數(shù)(fold change)為0.72(P<0.001)。另有研究[32]發(fā)現(xiàn),KCNMA1與孤獨癥譜系障礙(autistic spectrum disorder,ASD)和癲癇綜合征均有一定的關(guān)聯(lián);而ASD 和癲癇常常與抑郁癥之間存在共病現(xiàn)象,ASD 患者抑郁癥的患病率明顯較高[33],提示KCNMA1基因也可能在抑郁癥的發(fā)病中起作用。因此,我們認為JAM2、SCFD2、NR5A2、KCNMA1與抑郁癥之間存在相關(guān)性的可能性較大,這也從另一方面說明WGCNA 篩選樞紐基因的可靠性。至于另外2 個基因SCRN2和IGHV7-81,我們暫未發(fā)現(xiàn)確切的證據(jù)證明其與抑郁癥的相關(guān)性,但并不能排除這一可能性。

        本研究也存在一定的局限性。首先,抑郁癥的臨床表現(xiàn)具有多樣性的,本研究未對抑郁癥的臨床表現(xiàn)進行分類并分別分析其與基因模塊之間的相關(guān)性。其次,由于本研究的樣本量較小,WGCNA 分析的統(tǒng)計效能較低。R 軟件的pwr 包分析顯示,當效應量設(shè)置為0.7 時,統(tǒng)計效能僅為0.74(小于0.8)。后續(xù)研究需要增加樣本量以進一步驗證本研究的發(fā)現(xiàn),并探索這些樞紐基因在抑郁癥的病理生理過程中的潛在作用機制。

        參·考·文·獻

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