李婧，溫海楠，王曉輝，謝守軍(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，河北承德 067000)

細菌生物膜是細菌在生長過程中黏附于生物或非生物表面后，被細菌自身產(chǎn)生的胞外基質(zhì)包裹而形成的細菌聚集膜樣物。由于生物膜的屏障作用和不均質(zhì)的特點，抗菌藥物很難殺死生物膜深部的細菌并會對其產(chǎn)生耐藥選擇作用，因此，當(dāng)細菌以生物膜的形式存在時，細菌的耐藥性會增強，抗菌藥物不能有效抑制細菌生長和(或)殺滅細菌，導(dǎo)致患者出現(xiàn)感染遷延不愈和反復(fù)感染等情況[1]。近年來已有報道顯示抗菌藥物在亞抑菌濃度下會對細菌的生物膜產(chǎn)生影響[2]。鑒于其良好的臨床應(yīng)用前景，亞抑菌濃度抗菌藥物對細菌生物膜的作用備受關(guān)注。

1 亞抑菌濃度(subinhibitory concentration，sub-MIC)的來源和意義

亞抑菌濃度是指低于最低抑菌濃度(MIC)的藥物濃度水平。亞抑菌濃度抗菌藥物廣泛存在于自然界中，應(yīng)用過抗菌藥物的人和動物的排泄產(chǎn)物以及醫(yī)療廢物的排放等都是產(chǎn)生亞抑菌濃度抗菌劑的常見途徑[3]。近年來，由于抗菌藥物的濫用，多重耐藥、泛耐藥甚至全耐藥的菌株日益增多，因此常規(guī)治療藥物在暴露于這些細菌時，多處于不能殺滅病原菌的亞抑菌濃度水平。而即便是敏感的藥物，在達到治療濃度前也同樣難免存在亞抑菌濃度階段。在體內(nèi)，亞抑菌濃度的抗菌藥物可以上調(diào)細菌的突變率和基因轉(zhuǎn)移率，影響生物被膜、細菌群體感應(yīng)和毒力等，對細菌的生理結(jié)構(gòu)具有潛在影響。

2 亞抑菌濃度抗菌藥物對細菌生物膜形成的影響

亞抑菌濃度的抗菌藥物既可以誘導(dǎo)細菌生物膜形成，又可以抑制其生物膜形成。相同抗菌藥物對不同細菌生物膜的影響不同，不同的抗菌藥物對同一細菌生物膜的影響也有所不同(見表1)。由于亞抑菌濃度在治療感染過程中不可避免，因此研究亞抑菌濃度抗菌藥物對細菌生物膜形成的調(diào)控，具有重要的臨床意義。

表1 亞抑菌濃度抗菌藥物對細菌生物膜的作用

2.1鮑曼不動桿菌 鮑曼不動桿菌是一種需氧的革蘭陰性條件致病菌，廣泛存在于自然界中，具有較強的獲得和傳播耐藥性的能力。鮑曼不動桿菌常引起醫(yī)院獲得性肺炎，以及血流、腹腔、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、皮膚軟組織等感染，目

前已成為我國院內(nèi)感染的主要致病菌之一。亞抑菌濃度抗菌藥物對鮑曼不動桿菌生物膜形成的影響與多種因素有關(guān)，主要包括菌毛合成調(diào)控系統(tǒng)、群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum-sensing system，QS)、生物膜相關(guān)蛋白(Bap)及外膜蛋白等[1]。近年來，隨著了解深入，外排泵也被發(fā)現(xiàn)是影響鮑曼不動桿菌生物膜形成的一個重要因素。Chen等[23]對亞抑菌濃度替加環(huán)素研究發(fā)現(xiàn)，該藥物對鮑曼不動桿菌生物膜的抑制作用很可能是外排泵基因的下調(diào)所致，特別是AdeFGH外排泵的下調(diào)。Navidifar等[4]將鮑曼不動桿菌暴露于亞抑菌濃度的美羅培南和替加環(huán)素后，發(fā)現(xiàn)除了生物膜形成基因、菌毛調(diào)控基因和群體感應(yīng)基因外，編碼外排泵基因的mRNA水平與生物膜形成能力也呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。因此，外排泵的發(fā)現(xiàn)為臨床治療膜性鮑曼不動桿菌的感染提供了新的研究方向。

國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，亞抑菌濃度的亞胺培南對耐藥和敏感的鮑曼不動桿菌生物膜的形成具有完全不同的作用[7]，這可能由實驗條件和菌株差異所引起，但也同樣提示，亞抑菌濃度抗菌藥物對于不同敏感性菌株生物膜的影響也許還存在著更為復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制。

2.2銅綠假單胞菌 銅綠假單胞菌是臨床常見的非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，具有易定植、易變異和多耐藥的特點，是引起下呼吸道感染的常見病原體，亦是引起燒傷感染的主要細菌。銅綠假單胞菌引起的感染性疾病，往往因為生物膜的形成而造成疾病的反復(fù)感染和難以治愈。對于膜性銅綠假單胞菌的治療，亞抑菌濃度的抗菌藥物可以通過下調(diào)毒力因子和影響細菌QS系統(tǒng)，甚至于聯(lián)合用藥的方式來抑制其生物膜的形成[24-25]。有研究發(fā)現(xiàn)，亞抑菌濃度的姜黃素與慶大霉素和阿奇霉素聯(lián)用，可以通過對銅綠假單胞菌QS的抑制產(chǎn)生協(xié)同效果，從而進一步抑制其生物膜的形成[26]。這種聯(lián)合用藥的有效性為臨床治療生物膜感染提供了新的思路。

隨著抗菌藥物的廣泛使用，泛耐藥甚至全耐藥的銅綠假單胞菌日益增多。對于泛耐藥銅綠假單胞菌引起的下呼吸道感染，臨床常采用氨基糖苷類聯(lián)合用藥的方式進行治療[27]。有研究表明，氨基糖苷類藥物在其亞抑菌濃度下均表現(xiàn)出明顯的生物膜抑制作用，且堿性的培養(yǎng)環(huán)境(pH 7.9)對氨基糖苷類藥物的抗生物膜活性具有支持作用[28-29]。銅綠假單胞菌生物膜的建立和毒力特性主要受以下2種QS細胞間通信系統(tǒng)的調(diào)控:las和rhl系統(tǒng)[8]。而亞抑菌濃度的氨基糖苷可有效阻斷該菌QS系統(tǒng)的表達，并與QS調(diào)節(jié)蛋白LasR具有較強的結(jié)合力，這可能是該類藥物抑制銅綠假單胞菌生物膜及毒力的一個重要靶點[29]。

2.3大腸埃希菌 大腸埃希菌是醫(yī)院獲得性及社區(qū)獲得性感染中常見的革蘭陰性菌，易引起泌尿系統(tǒng)的感染，其臨床檢出率占各種病原菌的首位，也是生物膜感染的重要病原菌。形成生物膜的大腸埃希菌具有高度的耐藥性并能有效逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，使其感染易慢性化并難于控制。

環(huán)丙沙星是合成的第三代喹諾酮類藥物，具有廣譜抗菌活性，是泌尿系統(tǒng)感染的常用藥物。有研究發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星可以有效抑制大腸埃希菌生物膜的形成[13]。此外，Dong等[30]還發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星可以通過抑制pgaABCD基因的表達，減少細胞外多糖釋放，從而抑制生物膜的形成；同時，該藥物還抑制了鐵、fim和usp等毒力基因的表達，結(jié)果提示環(huán)丙沙星可能是一種較好的治療生物膜相關(guān)感染的藥物。但國外學(xué)者Lee等[14]卻發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星會增強大腸埃希菌SOS依賴毒力因子的表達和生物膜形成，并對2個小鼠大腸埃希菌UTI89感染模型進行了亞抑菌濃度環(huán)丙沙星的治療，維持慢性感染狀態(tài)的小鼠會產(chǎn)生預(yù)后不良，自然痊愈的小鼠在該種治療下臨床復(fù)發(fā)率也顯著增加。Rafaque等[31]同樣也發(fā)現(xiàn)，亞抑菌濃度的環(huán)丙沙星會顯著誘導(dǎo)大腸埃希菌生物膜的形成，導(dǎo)致此種差異的原因尚不清楚，具體機制還有待進一步的討論研究。

2.4肺炎克雷伯菌 肺炎克雷伯菌是一種革蘭陰性菌，常引起泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及血流等感染。該菌具有豐富的莢膜，并依靠莢膜多糖和細菌分泌的黏附分子極易在物體表面形成生物膜結(jié)構(gòu)，引起醫(yī)院感染的暴發(fā)[32]。

碳青霉烯類藥物是臨床上常規(guī)應(yīng)用于治療革蘭陰性菌的抗菌藥物，具有廣譜的抗菌性，但單獨使用時對生物膜卻沒有很好的抑制和破壞作用。因此，國內(nèi)學(xué)者穆小萍等[32]將不同抑菌濃度的阿奇霉素和亞胺培南聯(lián)合作用于肺炎克雷伯菌，發(fā)現(xiàn)在特定亞抑菌濃度的2種抗菌藥物作用下，臨床分離的肺炎克雷伯菌生物膜受到明顯抑制，相對應(yīng)的luxS基因的表達也出現(xiàn)下調(diào)的現(xiàn)象。而luxS是細菌QS中AI-2產(chǎn)生所必需的基因，該基因的表達在肺炎克雷伯菌生物膜形成的早期具有重要作用。此外，劉五高等[33]還發(fā)現(xiàn)1/2 MIC的非抗菌藥物茶多酚與臨床常用抗菌藥物亞胺培南、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦等聯(lián)用時，產(chǎn)生了良好的協(xié)同作用，明顯降低了這些抗菌藥物的耐藥性，并顯著抑制了多重耐藥肺炎克雷伯菌生物膜和胞外黏液樣物質(zhì)的產(chǎn)生。亞抑菌濃度藥物體外實驗展現(xiàn)出的治療效果為臨床應(yīng)用提供了良好的理論依據(jù)。

2.5金黃色葡萄球菌 金黃色葡萄球菌為臨床常見病原菌，能產(chǎn)生多種毒素、酶及蛋白質(zhì)抗原，可引起皮膚軟組織感染、血流感染及全身各臟器感染，具有較強的致病力。有流行病學(xué)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，軟組織感染創(chuàng)面分離出的金黃色葡萄球菌大多都具有形成生物膜的特性,尤其是在糖尿病患者創(chuàng)面內(nèi)分離的菌株，這提示金黃色葡萄球菌生物膜的形成與感染慢性化及再發(fā)關(guān)系密切[34]。

莫匹羅星是用于治療革蘭陽性球菌引起的皮膚感染的常用藥物，具有很強的抗菌活性，即使對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)的感染也有療效。然而，國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),亞抑菌濃度的莫匹羅星對MRSA生物膜的形成具有誘導(dǎo)作用，并發(fā)現(xiàn)與金黃色葡萄球菌生物膜形成相關(guān)的QS系統(tǒng)的細胞內(nèi)效應(yīng)物RNAⅢ存在表達上調(diào)的現(xiàn)象[17]。該結(jié)果也為莫匹羅星的應(yīng)用提供了新的思路。

此外，國內(nèi)外尚有其他亞抑菌濃度抗菌藥物對金黃色葡萄球菌生物膜影響的相關(guān)報道。國內(nèi)學(xué)者邢明勛等[18]發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度的阿奇霉素可有效抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，并呈劑量依賴式地抑制其溶血素和腸毒素A的分泌，1/2 MIC時其分泌幾乎完全受到抑制。國外學(xué)者Jo等[19]通過研究暴露于亞抑菌濃度的左氧氟沙星和苯唑西林下的金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)不同耐藥譜的該菌在內(nèi)酰胺酶活性、外排泵活性、生物膜形成能力和基因表達模式等方面表現(xiàn)出不同的表型和基因型特性。其對β-內(nèi)酰胺酶和外排泵系統(tǒng)活性的差異，導(dǎo)致耐抗菌藥物的金黃色葡萄球菌能在不同種類的抗菌藥物之間獲得交叉耐藥性。該研究表明，監(jiān)測抗菌藥物敏感性模式對于有效治療持續(xù)抗菌藥物暴露情況下的耐藥金黃色葡萄球菌感染至關(guān)重要。

2.6腸球菌 腸球菌是人類和動物腸道菌群和口腔中天然存在的一種條件致病菌。根據(jù)2018年中國CHINET細菌耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示，腸球菌在革蘭陽性菌引起的醫(yī)院感染中排第二位，僅次于金黃色葡萄球菌[35]。近年來，在許多腸球菌引起的感染中均觀察到生物膜的存在，生物膜相關(guān)的腸球菌感染不僅難以根除，而且還成為細菌進一步傳播的源頭和耐藥基因的儲備庫。

臨床常見的腸球菌主要為糞腸球菌和屎腸球菌。通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌似乎比屎腸球菌更容易形成生物膜[36]，這一特性增加了糞腸球菌治療的困難度。研究發(fā)現(xiàn)，腸球菌生物膜的形成依賴于多種因素，如hyl、esp、gle和cyl等基因的表達[37]。Yuksel等[20]通過對臨床常用抗菌藥物的研究，發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度的紅霉素、萬古霉素和鏈霉素都可抑制腸球菌生物膜的形成，且細胞壁相關(guān)蛋白Esp可能是這幾種藥物調(diào)控腸球菌生物膜形成的重要靶點。由于腸球菌是根管治療后引起慢性牙周炎的常見病原菌，因此，也有學(xué)者通過對亞抑菌濃度根管治療藥物的研究，發(fā)現(xiàn)糞腸球菌分離株在形成生物膜的能力上表現(xiàn)出顯著的克隆變異現(xiàn)象，且其黏液的產(chǎn)生與分離菌形成生物膜的能力之間存在密切相關(guān)性[21]，提示糞腸球菌在根管治療藥物作用下形成生物膜的分離株可能具有更強的存活能力。

3 結(jié)論

抗菌藥物在亞抑菌濃度下可以改變細菌生物膜的形成，且對細菌的耐藥性和致病性都存在不同程度的影響。目前對于亞抑菌濃度抗菌藥物對生物膜影響的相關(guān)研究，大多樣本量較小，這可能與其實驗步驟的繁雜程度有關(guān)，但也難免會造成抽樣誤差的增加，使結(jié)果的可靠性下降。因此，很多抗菌藥物對菌株生物膜的影響還存在爭議，有待進一步的研究考證。

亞抑菌濃度抗菌藥物對細菌生物膜的調(diào)節(jié)是一個多因素參與的復(fù)雜過程，雖然與之相關(guān)的報道很多，但大多未闡明其具體機制。通過對上述常見病原體的研究發(fā)現(xiàn)，細菌的QS系統(tǒng)被認(rèn)為是調(diào)節(jié)生物膜的關(guān)鍵因素，與生物膜的形成、細菌的耐藥性和致病性都密切相關(guān)。除此之外，菌毛調(diào)控系統(tǒng)、外排泵和外膜蛋白等也都被發(fā)現(xiàn)可能是亞抑菌濃度抗菌藥物對細菌生物膜調(diào)控的因素，不同的亞抑菌濃度抗菌藥物作用于不同的細菌時會針對其相應(yīng)的靶點而對其生物膜產(chǎn)生不同程度的影響。由于其繁多的調(diào)節(jié)位點和復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制，現(xiàn)今還無法將常用抗菌藥物對常見病原菌的作用靶點一一對應(yīng)。因此，對于亞抑菌濃度抗菌藥物對細菌生物膜影響及相關(guān)機制的研究還任重而道遠。