郭慶昕，蔡加昌，周宏偉，張嶸，蔣華蔚，胡燕燕(.泉州市正骨醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建泉州362000；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科，b.血液科，杭州30009)

銅綠假單胞菌是重要的醫(yī)院感染菌之一，可引起重癥肺炎、敗血癥、燒傷傷口感染等。產(chǎn)碳青霉烯酶銅綠假單胞菌(carbapenem resistantPseudomonasaeruginosa, CRPA)可水解幾乎所有可用的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物，對(duì)全球公眾健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[1]。β-內(nèi)酰胺酶可分A、B和D三大類(lèi)，A類(lèi)包括KPC、BEL、CTX-M、GES家族的成員，B類(lèi)包括NDM、IMP家族和VIM家族，D類(lèi)主要是OXA家族。GES類(lèi)型的β-內(nèi)酰胺酶在20世紀(jì)后期被發(fā)現(xiàn)，因其含有絲氨酸碳β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)特征(即Cys69和Cys239之間的二硫鍵)，故與KPC型一起被分在A類(lèi)中[2]。blaGES基因容易發(fā)生突變，目前已鑒定出40個(gè)亞型[3]，GES酶水解譜也不斷擴(kuò)大，從原先的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶逐漸進(jìn)化為碳青霉烯酶[4]。為充分闡明耐藥菌的傳播動(dòng)態(tài)，本研究對(duì)1株產(chǎn)GES-1型碳青霉烯酶銅綠假單胞菌進(jìn)行全基因測(cè)序分析，采用生物信息技術(shù)分析本菌的多位點(diǎn)序列分型(multisite sequencing typing, MLST)、毒力基因和耐藥基因，并分析blaGES-1基因所處的周?chē)h(huán)境。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 研究菌株來(lái)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科1例重癥肺炎患者，該患者住院期間多次發(fā)熱，曾先后使用哌拉西林鈉/他唑巴坦鈉、比阿培南、左氧氟沙星等抗感染治療。該菌株于患者入ICU 13個(gè)月后從合格痰標(biāo)本中分離，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜及微量肉湯稀釋法確定為CRPA，此后7個(gè)月中反復(fù)從痰標(biāo)本中檢出。應(yīng)用哌拉西林/他唑巴坦、比阿培南等抗菌藥物治療，但患者肺炎持續(xù)加重，呼吸功能衰竭，最終死亡。

1.2主要儀器與試劑 MALDI-TOF質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司)，PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)，Illumina HiSeq X10測(cè)序平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)，3730測(cè)序分析儀(美國(guó)ABI公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)；血瓊脂平板(鄭州安圖生物公司)，銅綠假單胞菌藥敏試劑盒(珠海迪爾公司)，引物(上海生工生物公司)，dNTP mix、10×Buffer、Taq酶、加樣緩沖液(大連寶生物公司)，細(xì)菌全基因組提取試劑盒(廣州Magen公司)。

1.3細(xì)菌鑒定 標(biāo)本接種于血瓊脂平板培養(yǎng)過(guò)夜，分離菌采用MALDI-TOF質(zhì)譜進(jìn)行菌種鑒定。

1.4抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)慶大霉素、阿米卡星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、黏菌素、多黏菌素、頭孢哌酮/舒巴坦的敏感性，以銅綠假單胞菌ATCC 27853作為質(zhì)控菌株，結(jié)果判讀參照據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M100-S28標(biāo)準(zhǔn)[5]。亞胺培南和/或美羅培南的最低抑菌濃度≥8 μg/mL時(shí)判定為CRPA，頭孢哌酮/舒巴坦敏感性判讀參照CLSI-M100-S28中頭孢哌酮方案進(jìn)行。

1.5全基因組測(cè)序及分析 使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA，用TE緩沖液洗脫，用紫外分光光度計(jì)對(duì)所提取的DNA進(jìn)行濃度測(cè)定，測(cè)定后的合格樣品送北京安諾優(yōu)達(dá)基因科技公司，經(jīng)DNA片段化、末端補(bǔ)平、3′端加A、連接測(cè)序接頭、PCR擴(kuò)增與純化等完成文庫(kù)制備，然后采用Illumina HiSeq X10測(cè)序平臺(tái)通過(guò)雙末端150 bp測(cè)序讀長(zhǎng)策略進(jìn)行高通量測(cè)序。原始序列通過(guò)SPAdes v3.11.1[6]進(jìn)行組裝，“cov-cutoff”參數(shù)選為“auto”，“phred-offset”參數(shù)選為“33”，并用RAST[7]和Prokka[8]進(jìn)行注釋?zhuān)琍rokka軟件的“kingdom”參數(shù)選擇“Bacteria”并且選用“metagenome”參數(shù)提高基因預(yù)測(cè)能力。然后，通過(guò)Kleborate和ResFinder[9]分析菌株的MLST、毒力基因和耐藥基因，參數(shù)均采用軟件默認(rèn)的設(shè)置(threshold for ID%為90%，minimum length為60%)。該銅綠假單胞菌的全基因測(cè)序原始數(shù)據(jù)已提交NCBI網(wǎng)站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)，BioProject登記號(hào)：PRJNA648026，Biosample登記號(hào)：SAMN15616709。

1.6blaGES-1基因環(huán)境分析 全基因組測(cè)序分析顯示blaGES-1基因位于NODE_219片段中，長(zhǎng)度3 150 bp，上游為整合子1(intl1)部分序列，下游為插入序列(ISPa21e)的部分序列。為呈現(xiàn)intl1和ISPa21e的完整序列，各設(shè)計(jì)了3對(duì)引物對(duì)這2個(gè)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1，產(chǎn)物送上海生工生物工程公司采用3730測(cè)序分析儀測(cè)序，結(jié)果用DNAMAN軟件拼接。

表1 intl1和ISPa21e擴(kuò)增延伸引物

2 結(jié)果

2.1抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 根據(jù)CLSI-M100-S28判讀標(biāo)準(zhǔn)，該菌對(duì)美羅培南、黏菌素和多黏菌素B敏感，對(duì)其他抗菌藥物均為耐藥。見(jiàn)表2。

表2 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.2全基因組測(cè)序結(jié)果 該菌全基因組測(cè)序分析結(jié)果顯示，測(cè)序深度75×，基因組覆蓋度100%。

2.2.1MLST及血清分型結(jié)果 經(jīng)全基因組測(cè)序?qū)?對(duì)管家基因(acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA、trpE)[10]進(jìn)行分析，經(jīng)https:∥cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/查詢(xún)，結(jié)果為(38-11-3-13-1-2-4)，經(jīng)比對(duì)，MLST分型為ST235型，血清分型為O11型。

2.2.2耐藥基因測(cè)序結(jié)果 經(jīng)ResFinder數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，本株分離菌共攜帶有12個(gè)抗菌藥物耐藥基因，見(jiàn)表3。

表3 耐藥基因測(cè)序結(jié)果

2.2.3blaGES-1基因比對(duì)結(jié)果及基因環(huán)境 全基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，blaGES-1基因位于長(zhǎng)度為3 150 bp的 NODE_219片段中。該基因片段與GenBank中的 KY860573菌株的72068—75217一致率為99.94%。blaGES-1基因上游1—192為整合子1(intl1)部分序列；372—1235為β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因blaGES-1，長(zhǎng)度為864 bp，經(jīng)ResFinder數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，與登記號(hào)為HQ170511的菌株100%一致；下游依次為：1374—1928為氨基糖苷類(lèi)/氟喹諾酮類(lèi)耐藥基因aac(6′)-Ⅰb3，長(zhǎng)度為558 bp；2009—2253為無(wú)功能基因gcuE15，長(zhǎng)度為245 bp；2261—3055為氨基糖苷類(lèi)耐藥基因aph(3′)-XV，長(zhǎng)度為795 bp；3077—3150為插入序列ISPa21e部分序列。采用PCR擴(kuò)增加測(cè)序?qū)φ献觟ntl1和插入序列ISPa21e進(jìn)一步延伸，intl1全長(zhǎng)為1 014 bp，ISPa21e全長(zhǎng)為1 297 bp。blaGES-1基因環(huán)境見(jiàn)圖1。

注：整合子1(intl1)長(zhǎng)度1 014 bp，β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因(blaGES-1 )長(zhǎng)度為864 bp，氨基糖苷類(lèi)/氟喹諾酮類(lèi)耐藥基因[aac(6′)-Ⅰb3]長(zhǎng)度為558 bp，無(wú)功能基因gcuE15長(zhǎng)度為245 bp，氨基糖苷類(lèi)耐藥基因[aph(3′)-XV]長(zhǎng)度795 bp，插入序列ISPa21e長(zhǎng)度為1 297 bp。

2.2.4毒力基因測(cè)序結(jié)果 全基因組測(cè)序分析共查詢(xún)到該菌包含有357個(gè)毒力基因，其中胞外酶3種，T3SS轉(zhuǎn)錄因子5種，胞外多糖20種，外毒素1種，溶血磷脂酶C 3種，溶血磷脂酶D 1種，鞭毛蛋白14種，鞭毛絲蛋白15種，菌毛蛋白25種，主要毒力基因見(jiàn)表4，該菌為exoU+/exoS-基因型。

表4 本菌攜帶的主要毒力基因

3 討論

銅綠假單胞菌的碳青霉烯酶編碼基因(carbapenemase-encoding genes，CEGs)并非來(lái)源于其本身，而是水平基因轉(zhuǎn)移獲得的外源基因[11]。盡管其獲得性CEGs的起源尚不清楚，但最有可能是來(lái)源于具有相同生態(tài)位的環(huán)境細(xì)菌[12]。以往認(rèn)為GES酶水解碳青霉烯的能力很低，可被碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物亞胺培南抑制，但GES酶的獨(dú)特之處在于能通過(guò)單點(diǎn)突變將其水解譜擴(kuò)展至碳青霉烯類(lèi)[13]。

綜合全球的多項(xiàng)研究，發(fā)現(xiàn)ST235、ST175和ST111是CRPA 3個(gè)主要的高風(fēng)險(xiǎn)克隆，而ST235分布最廣，遍布全球五大洲，且ST235與O11型血清型相關(guān)[14]。Mulet等[15]研究了可能導(dǎo)致銅綠假單胞菌高風(fēng)險(xiǎn)克隆成功的生物標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)其在運(yùn)動(dòng)和產(chǎn)生色素上存在缺陷，但生物膜形成水平和自發(fā)突變頻率增加，這些特征與高風(fēng)險(xiǎn)克隆引起的慢性感染互相印證。高風(fēng)險(xiǎn)克隆的耐藥性與轉(zhuǎn)移耐藥和自發(fā)突變機(jī)制有關(guān)，其中ST235型中報(bào)道了近100個(gè)水平獲得耐藥元素，絕大多數(shù)產(chǎn)生金屬β-內(nèi)酰胺酶或超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，其中GES酶最為多樣化[16]。

本菌基因環(huán)境分析顯示，在blaGES-1上游為Ⅰ類(lèi)整合子(intl1)，下游為耐藥基因aac(6′)-Ⅰb3和aph(3′)-XV，右側(cè)翼的插入序列(ISPa21e)。有研究發(fā)現(xiàn)CRPA中獲得性碳青霉烯酶大多數(shù)存在于染色體位置tn402類(lèi)轉(zhuǎn)座子內(nèi)的Ⅰ類(lèi)整合子上[17]。整合子是編碼產(chǎn)生整合酶，介導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組，負(fù)責(zé)獲得或切除載有抗菌藥物耐藥基因的基因盒，多個(gè)基因片段可能被同一整合子捕獲到可變區(qū)域[18]，這解釋了本菌blaGES-1基因環(huán)境中3 150 bp的片段中集聚著3個(gè)重要的耐藥基因，對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)等抗假單胞菌抗菌藥物耐藥的原因。下游為IS110家族中的插入序列ISPa21e，該插入序列屬于高度可移動(dòng)性轉(zhuǎn)座因子，是對(duì)基因組一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)具有插入能力的小分子片段，并可以移動(dòng)鄰近的基因[19]。該序列在染色體上的特定位置在不同的ST235分離株之間有所不同，表明在該克隆譜系的進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了染色體重排[20]。在醫(yī)院環(huán)境中，非發(fā)酵革蘭陰性菌是這些元素的主要貯藏庫(kù)，當(dāng)轉(zhuǎn)移到銅綠假單胞菌高風(fēng)險(xiǎn)克隆中時(shí)，會(huì)發(fā)生垂直擴(kuò)增，導(dǎo)致CRPA的發(fā)生[21]。

經(jīng)比對(duì)，本菌含有357個(gè)毒力基因，這些因子在細(xì)菌黏附、運(yùn)動(dòng)、生物膜形成、抗菌藥物耐藥和細(xì)胞毒性等不同環(huán)節(jié)中起作用。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)在銅綠假單胞菌生物膜形成、細(xì)胞毒作用中起重要作用，在感染過(guò)程中銅綠假單胞菌將毒素ExoS、ExoT、ExoU、ExoY注入到靶真核細(xì)胞的胞漿中，其中ExoU是一種磷脂酶效應(yīng)細(xì)胞毒素，可致呼吸道、尿道、角膜和軟組織等急性上皮損傷[22]。大多數(shù)銅綠假單胞菌均可檢出ExoY和ExoT，而ExoS和ExoU則相對(duì)立，exoU-/exoS+基因型通常與侵襲表型相關(guān)，會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞的緩慢死亡；exoU+/exoS-基因型與細(xì)胞毒性高的菌株相關(guān)，導(dǎo)致宿主細(xì)胞快速而穩(wěn)定的裂解，經(jīng)常與慢性感染相關(guān)。高風(fēng)險(xiǎn)克隆ST235均為exoU+/exoS-基因型，與其他克隆相比，其臨床效果差，預(yù)后不良[23]。ExsA、ExsB、ExsC、ExsD、ExsE特別是ExsA，是T3SS基因表達(dá)的主要調(diào)控因子，鞭毛絲蛋白(FliC)、胞外多糖(alg)等是T3SS的其他效應(yīng)子。外毒素、溶血磷脂酶C、D是重要的細(xì)胞毒素,也可導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解。

臨床早期發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)克隆對(duì)醫(yī)院感染控制具有重要意義，有助于避免其在醫(yī)院環(huán)境中擴(kuò)散。全基因組測(cè)序在多重耐藥菌的醫(yī)院感染調(diào)查中提供基因分型、耐藥基因、毒力基因等多種重要信息，在充分闡明耐藥菌的傳播動(dòng)態(tài)，了解高風(fēng)險(xiǎn)克隆成功的因素等方面發(fā)揮重要作用。