黃賽賽，王丹丹，張卓亞，梁軍(南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院風濕免疫科，南京 210008)

系統(tǒng)性硬化癥或硬皮病是一種女性多發(fā)的自身免疫性疾病，主要特征是皮膚和內臟器官的纖維化以及血管病變和免疫功能異常，其確切的發(fā)病機理尚未完全明確[1-2]。MicroRNA(miRNA)是一類由內源性基因編碼的長度約20～22個核苷酸的單鏈非編碼RNA序列，在許多生物學過程中(如細胞增殖、分化、凋亡以及免疫細胞發(fā)育等)起著至關重要的作用[3-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在血液中穩(wěn)定表達且有可能成為疾病診斷、預后和治療等方面的重要生物標志物之一[5-6]。自身免疫病(autoimmune diseases，AID)患者血液中也存在miRNA的異常表達，而差異表達的miRNA可能影響AID的發(fā)生和發(fā)展[7-8]。血漿miRNA對于系統(tǒng)性硬化癥患者的意義也越來受到重視。本研究通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測系統(tǒng)性硬化癥患者和健康人對照血漿中7種miRNA即miR-140-5p、miR-21、miR-142-3p、miR-29a、miR-92a、miR-151-5p、let-7g的表達，并與患者的臨床指標進行相關性分析，進一步探究血漿miRNA對于系統(tǒng)性硬化癥患者的臨床意義。

1 材料和方法

1.1研究對象 選取2014年4月至2017年5月就診于南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院風濕免疫科的49例系統(tǒng)性硬化癥患者，女性43例，男性6例，年齡(48.8±2.1)歲，病程(6.6±0.8)年，體重(53.2±1.3)kg，77.6%(n=38)的患者有雷諾現(xiàn)象，32.7%(n=16)的患者合并肺動脈高壓，20.4%(n=10)的患者合并高血壓，42.9%(n=10)的患者有胃腸道累及，48.9%(n=24)的患者合并間質性肺炎，28.6%(n=14)的患者存在腎功能異常。所有患者均符合2013ACR/EULAR關于系統(tǒng)性硬化癥的診斷標準[9]，排除急性感染，腫瘤，其他確定的AID。所有患者均服用≤10 mg/d的醋酸潑尼松。同時選取年齡和性別相匹配的體檢健康者20例作為健康人對照。所有標本均在患者入院第二天清晨空腹采集，血漿樣本在使用前均于-80 ℃保存。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批準文件號2008017)，患者均知情同意。

1.2儀器與試劑 Sigma 2-16K離心機(德國Sigma公司)，RNA逆轉錄儀(日本TaKaRa公司)，Step-one PlusTM熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)，BC-6800Plus血液分析儀(邁瑞公司)，生化分析儀(北京邁克公司)。

miRNeasy Serum/Plasma Kit、miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen公司)，BC-6800Plus血液分析儀配套肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白、總蛋白、補體C3、補體C4、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白M(IgM)(熒光染色法)試劑(邁瑞公司)，肌酐檢測(酶法)試劑、尿素氮檢測(尿素氮UV法-氨去除法)試劑(日立化成診斷系統(tǒng)株式會社)，微量白蛋白檢測(免疫比濁法)試劑(奧瑞雅診斷公司)，微量總蛋白測定(領苯三酚紅比色法)試劑(德國德賽公司)，補體C3、C4、IgA、IgG、IgM測定(免疫比濁法)試劑(北京邁克公司)，IgE測定(免疫比濁法)試劑(上海景源公司)。

1.3病例資料的采集 運用電子病歷系統(tǒng)，收集入組系統(tǒng)性硬化癥患者與miRNA檢測和實驗室檢查時間點一致的病歷資料，包括白細胞、淋巴細胞、肌酐、尿素氮、24小時尿蛋白、總蛋白、補體C3、補體C4、IgA、IgG、IgE、IgM。

1.4血漿miRNA的提取 使用miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒分離miRNA，按說明書進行操作。

1.5cDNA的合成 使用miScript II RT Kit合成cDNA，按說明書冰上配制逆轉錄體系，在RNA逆轉錄儀上37 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min完成逆轉錄反應，合成cDNA。

1.6qRT-PCR檢測血漿miRNA的相對表達 使用miScript SYBR Green PCR Kit進行qRT-PCR檢測，miR-39作為加標對照。hsa-miR-140-5p、hsa-miR-21、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-29a、hsa-miR-92a、hsa-miR-151-5p、hsa-let-7g、cel-miR-39的引物序列見表1，由日本TaKaRa公司合成。實時PCR反應條件：94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s,共40個循環(huán)，所有反應均在Step-one PlusTM熒光定量PCR儀上進行。用2-△△Ct方法計算血漿miRNA的表達。

表1 miRNA引物序列

1.7統(tǒng)計學分析 用SPSS 17.0軟件進行。數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布，以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。相關性分析用Spearman相關。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1系統(tǒng)性硬化癥患者血漿miRNA的表達 qRT-PCR結果發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性硬化癥患者血漿miR-21、miR-142-3p、miR-29a、 miR-92a、miR-151-5p、let-7g的水平較健康人對照明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 系統(tǒng)性硬化癥患者與健康人對照血漿miRNA對比

2.2系統(tǒng)性硬化癥患者血漿miRNA與臟器累及的關系 根據(jù)患者是否合并高血壓、肺動脈高壓、間質性肺病、胃腸道累及、雷諾現(xiàn)象，將患者進行分組分析，對比不同類型患者血漿miRNA水平。結果發(fā)現(xiàn)合并肺動脈高壓的患者miRNA-21和miRNA-142-3p水平較無肺動脈高壓患者明顯升高(見表3)，兩組之間其余miRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義。而是否合并高血壓、間質性肺病、胃腸道累及、雷諾現(xiàn)象、腎臟累及對系統(tǒng)性硬化癥患者血漿miR-140-5p、miR-29a、miR-92a、miR-151-5p、let-7g的表達無明顯影響。

表3 無肺動脈高壓組和合并肺動脈高壓組血漿miRNA-21和miRNA-142-3p的表達水平

2.3系統(tǒng)性硬化癥患者血漿miRNA與實驗室指標的相關性 結果顯示，miRNA-140-5p與IgG水平正相關，miRNA-21與IgA、IgG水平正相關，miRNA-92a與淋巴細胞計數(shù)、白細胞總數(shù)、補體C3負相關，miRNA-151-5p與IgG水平正相關，let-7g水平與IgG、IgE水平正相關，見表4。miR-142-3p、miR-29a與臨床實驗室指標相關性無統(tǒng)計學意義。

表4 系統(tǒng)性硬化癥患者血漿miRNA水平與臨床指標的相關性分析

3 討論

miRNA可參與系統(tǒng)性硬化癥的不同信號傳導途徑并調節(jié)其病理生理過程，表明他們有可能作為系統(tǒng)性硬化癥的潛在生物學標志物，在系統(tǒng)性硬化癥的診斷和治療中發(fā)揮重要的作用[10]。纖維化是系統(tǒng)性硬化癥發(fā)病的突出特征，miRNA在纖維化進程中起到重要作用，如敲除小鼠腎臟miR-21可以顯著緩解腎臟纖維化的進程[11]，巨噬細胞來源的外泌體可能通過增加肺泡上皮細胞和肺成纖維細胞miR-142-3p的表達來抑制肺纖維化[12]。本研究檢測了7種可能參與纖維化過程的miRNA在系統(tǒng)性硬化癥患者血漿中的表達水平，結果顯示血漿中miR-21、miR-142-3p、miR-29a、miR-92a、miR-151-5p、let-7g表達均明顯下降。

肺動脈高壓是系統(tǒng)性硬化癥相關肺血管疾病的常見形式，發(fā)病率約在8%～12%，是系統(tǒng)性硬化癥患者主要的死亡原因之一[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，合并肺動脈高壓組患者血漿miRNA-21和miRNA-142-3p較非肺動脈高壓組升高，表明血漿miRNA-21、miRNA-142-3p可能是系統(tǒng)性硬化癥肺動脈高壓的危險因素之一。另外，miRNA-21、miRNA-142-3p在系統(tǒng)性硬化癥患者中明顯降低，而在合并肺動脈高壓組升高，這表明血漿miRNA-21、miRNA-142-3p可能具有雙向作用，在不同的內環(huán)境中發(fā)揮不同的作用，其具體機制仍有待進一步研究。

我們將系統(tǒng)性硬化癥血漿miRNA相對表達量與患者臨床指標進行相關性分析，結果顯示miRNA水平與患者白細胞、淋巴細胞、補體以及免疫球蛋白存在一定的相關性，這表明血漿miRNA與系統(tǒng)性硬化癥患者的機體免疫反應密切相關，對于種種現(xiàn)象的存在及其機制也將是我們后續(xù)研究的重點。

本研究也存在一些局限性。首先入組的病人數(shù)量較少，仍需要更大樣本量的研究來進一步探討血漿miRNA對于系統(tǒng)性硬化癥患者的意義。其次，入組的患者幾乎都是彌漫性硬皮病，缺乏對局限性硬皮病患者的研究。最后，本研究為橫斷面的研究，暫無患者的隨訪數(shù)據(jù)，沒有對患者療效和miRNA水平的動態(tài)觀察。這些不足有待在以后的工作中彌補。