孫寧，于娟，余柏增，陳勇，曹進，黃紅娟，王衛(wèi)萍，張立平，李曉軍,3(. 東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院基礎醫(yī)學實驗室，南京 000；. 南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，南京00；3. 南京大學生命分析化學國家重點實驗室，南京 000)

近年來，臨床分離革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率逐年升高[1-2]。菌株對碳青霉烯耐藥機制主要有3種，產碳青霉烯酶，藥物作用靶點的改變，膜通透性降低及外排作用[1-2]，其中產碳青霉烯酶是最主要機制。目前已有多種碳青霉烯酶被發(fā)現(xiàn)，其中KPC、NDM、OXA-48、VIM和IMP在世界范圍內廣泛分布[3]。臨床實驗室對細菌耐藥性檢測多以表型分析進行。近年來，以PCR為基礎的核酸擴增技術逐漸用于碳青霉烯酶基因的檢測，如實時熒光PCR和多重PCR。此外，一些商業(yè)化的試劑已被用于碳青霉烯酶基因檢測，如Xpert Carba-R[4-5]。為準確分析革蘭陰性桿菌碳青霉烯類耐藥機制，監(jiān)控院內感染的傳播，本研究建立一種單管多重PCR聯(lián)合毛細管電泳(multiplex PCR combined with capillary electrophoresis, mPCR-CE)方法同時檢測blaNDM、blaVIM、blaKPC和blaOXA-484種碳青霉烯酶基因，并對該方法進行評價。

1 材料與方法

1.1菌株 采用東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院基礎醫(yī)學實驗室微生物室保存的產碳青霉烯酶臨床分離株[6]作為陽性對照菌株，包括：攜帶blaVIM惡臭假單胞菌(P.putida)，攜帶blaNDM-1肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)和攜帶blaKPC-2K.pneumonia(ATCC BAA-1705)，攜帶部分blaOXA-48基因序列的大腸埃希菌E.coli(DH5α)由人工合成，以及攜帶其他β-內酰胺酶(TEM-1、CTX-M-5和SHV-1)基因的大腸埃希菌，攜帶MIR-1基因的肺炎克雷伯菌，分別攜帶IMP-4和IMP-9基因的銅綠假單胞菌、弗勞地檸檬酸桿菌，以上類型菌株各1株。收集東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院2019年2—3月間采用Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)GN-09卡檢測為碳青霉烯耐藥(腸桿菌科細菌亞胺培南和美羅培南MICs≥4 μg/mL，非發(fā)酵菌亞胺培南和美羅培南MICs≥8 μg/mL，腦膜敗血性黃桿菌亞胺培南和美羅培南的MICs≥4 μg/mL)菌株68株，分別為肺炎克雷伯菌22株，大腸埃希菌10株，銅綠假單胞菌16株，黏質沙雷菌7株，陰溝腸桿菌2株，雷極普羅威登斯菌1株，腦膜敗血性黃桿菌1株，弗氏檸檬酸桿菌1株，臭鼻克雷伯菌3株，摩根摩根菌2株，奇異變形桿菌3株，藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.2主要試劑及儀器 TIANamp Bacteria DNA Kit(DP302，北京天根生化科技公司)；Premix Taq Hot Start Version和Multiplex PCR Assay Kit Ver.2(大連寶生物公司)；Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)；MaxyGene II梯度PCR儀(美國Anxygen公司)；ABI 3730XL測序儀(美國賽默飛世爾公司)。本研究中所用引物的合成和擴增產物測序均由生工(上海)生物工程有限公司完成。

1.3DNA提取 采用加熱煮沸法提取細菌菌落DNA。挑取單菌落，將其溶于100 μL滅菌去離子水中，煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，轉移上清液至新的離心管中，取5 μL用于PCR或置于-20 ℃保存。采用TIANamp Bacteria DNA Kit提取細菌溶液DNA，按試劑盒說明書進行操作。

1.4引物設計和合成 根據NCBI數據庫中已發(fā)表的碳青霉烯酶基因blaVIM(NG_050336)、blaNDM(NG_049326)、blaKPC(NG_049253)、blaOXA-48(NG_049762)序列，利用軟件ClustalW(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)進行多重比對，并根據保守區(qū)，采用軟件Primer Premier 3(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設計特異性引物。為監(jiān)控整個反應體系，設計革蘭陰性桿菌16S rRNA基因引物。在上游引物的5′端標記FAM基團用于毛細管電泳分析。引物由上海生工生物工程公司合成。見表1。

表1 用于多重PCR和單重PCR的引物

1.5mPCR-CE 采用25 μL體系：2×Multiplex PCR Buffer(Mg2+, dNTP plus)12.5 μL，NDM-F和NDM-R(10 μmol/L)各0.24 μL，VIM-F和VIM-R(10 μmol/L)各0.24 μL，KPC-F和KPC-R(10 μmol/L)各0.24 μL，OXA-48-F和OXA-48-R(10 μmol/L)各0.16 μL，16S-F和16S-R(10 μmol/L)各0.1 μL，Multiplex PCR Enzyme Mix 0.5 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 5.54 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(從65 ℃開始，每個循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃)，72 ℃ 30 s，10個循環(huán)；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取1 μL擴增產物，9 μL高度去離子甲酰胺(HiDi)與分子內標Liz500(體積比為250∶1)的混合物，加入96孔板中，95 ℃變性5 min，立即置于冰上，采用ABI 3730XL進行檢測。檢測結果的判定標準：若熒光強度低于分子內標的熒光強度，則判定為陰性；若片段長度在正確位置，并且熒光強度大于分子內標的熒光強度則判定為陽性，且16S rRNA基因檢測結果為陽性。

1.6特異性和靈敏度分析 將0.5麥氏濁度單位(1.5×108CFU/mL)攜帶blaKPC、blaNDM、blaOXA-48和blaVIM的細菌進行10倍梯度稀釋，利用試劑盒提取各稀釋液細菌DNA，并進行mPCR-CE檢測。將攜帶除上述基因外的其他β-內酰胺酶基因的菌株濃度調整至0.5麥氏濁度單位，用細菌DNA提取試劑盒提取DNA，行mPCR-CE檢測，用于特異性評價。

1.7mPCR-CE檢測臨床菌株中碳青霉烯酶基因 將68株細菌接種M-H平板，過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落溶于100 μL滅菌去離子水中，用加熱煮沸法提取細菌DNA，取5 μL作為模板用于mPCR-CE檢測。

1.8普通PCR與測序 取5 μL采用煮沸法提取的細菌DNA，利用blaKPC、blaNDM、blaVIM和blaOXA-48引物進行單重PCR后測序驗證。PCR反應體系為25 μL，包括：2×Premix Taq Hot Start Version 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL， DNA模板5 μL，ddH2O 6.5 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取10 μL擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，并將剩余陽性擴增產物送上海生工生物公司，在ABI 3730xl測序儀上進行一代測序分析，測序結果提交NCBI數據庫，進行BLAST比對分析。

2 結果

2.1特異性 mPCR-CE檢測攜帶blaNDM、blaVIM、blaKPC、blaOXA-48菌株分別在116 bp、130 bp、150 bp、186 bp片段大小處檢出特異峰，16S rRNA基因片段大小為229 bp，結果與預期相符，而對其他耐藥基因無交叉反應。見圖1。

注：A，攜帶blaNDM-1的肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae)； B，攜帶blaVIM的惡臭假單胞菌(P. putida)； C，攜帶blaKPC-2的K. pneumonia(ATCC BAA-1705)；D，攜帶部分blaOXA-48基因序列的E. Coli(DH5α)；E，分別攜帶TEM-1、CTX-M-5、AmpC、SHV-1、MIR-1、IMP-4、IMP-9的臨床分離菌株。

2.2靈敏度 mPCR-CE檢測blaNDM、blaVIM和blaKPC的檢測限為1.5×102CFU/mL，blaOXA-48的檢測限為1.5×103CFU/mL。見圖2。

注：A—E濃度依次為1.5×105 CFU/mL、1.5×104 CFU/mL、1.5×103 CFU/mL、1.5×102 CFU/mL、1.5×101 CFU/mL。

2.3臨床分離菌株PCR-CE檢測結果 經PCR結合測序分析，68株菌株中檢出45株攜帶碳青霉烯酶基因，包括攜帶blaKPC37株和攜帶blaNDM8株；未檢出攜帶blaVIM和blaOXA-48菌株。22株肺炎克雷伯菌中檢出攜帶blaKPC基因16株，攜帶blaNDM基因1株；10株大腸埃希菌中檢出攜帶blaKPC6株，攜帶blaNDM2株。16株銅綠假單胞菌檢出攜帶blaKPC基因5株，未檢出攜帶其他3種碳青霉烯酶基因。黏質沙雷菌、奇異變形桿菌和摩根摩根菌中均發(fā)現(xiàn)了攜帶blaKPC和blaNDM的耐藥菌株，同時2株奇異變形桿菌同時攜帶了blaKPC和blaNDM2種耐藥基因。mPCR-CE檢測68株碳青霉烯耐藥菌株碳青霉烯酶攜帶情況與PCR擴增結合測序結果一致性為100%。見表2和圖3。

表2 mPCR-CE與單重PCR測序檢測碳青霉烯酶基因情況

圖3 攜帶blaKPC(A和C)和blaNDM(B和D)的肺炎克雷伯菌的單重PCR Sanger測序與參考序列比對結果

3 討論

在臨床微生物學實驗室中，細菌耐藥性多采用表型分析的方法，如稀釋法、藥敏紙片法等，而對于細菌是否產碳青霉烯酶，還需表型確認實驗，如Hodge試驗、mCIM試驗等。這些方法普遍存在檢測時間過長、操作復雜等缺點[7]。碳青霉烯類耐藥基因分子診斷技術主要是采用多重PCR或實時熒光PCR方法進行檢測，這兩種方法各有各的優(yōu)缺點，比如多重PCR可檢測超過4種以上的碳青霉烯酶基因或多種β-內酰胺酶基因，但是擴增產物需采用瓊脂糖凝膠電泳的方式進行分析，敏感性低，重復性差[6,8]；而實時熒光PCR具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，但是受到檢測通道的限制，靶標基因檢測數量有限[9]。因此，在一些實時熒光PCR方法中將碳青霉烯酶基因分組，而后通過多管多重PCR反應檢測[10]；同時，也有一些方法通過設計特殊的裝置達到擴增反應的物理分離，如賽沛Xpert Carba-R[4-5]以及微流控芯片方法[11]，從而達到多靶標基因的檢測。

本研究利用毛細管電泳技術代替瓊脂糖凝膠電泳，以攜帶4種碳青霉烯酶基因的耐藥菌作為參考菌株，分析該方法的靈敏度。研究發(fā)現(xiàn)，多重PCR毛細管電泳的最低檢測限處于1.5×102～1.5×103CFU/mL之間，雖然明顯高于單重實時熒光PCR的最低檢測限，但與多重實時熒光PCR的最低檢測限相差不大[12-13]。用該方法檢測攜帶其他β-內酰胺酶基因的細菌，結果顯示無明顯的交叉反應。同時，我們在mPCR-CE中加入了16S rRNA基因用于監(jiān)控整個反應體系，大大提高了檢測過程的準確性。多重PCR毛細管電泳技術具有以下3點不足：(1)耗時長，因多重PCR的擴增產物需先進行變性，而后通過毛細管電泳進行分析，從而導致該方法不適合于快速檢測，尤其是臨床標本的快速檢測；(2)相比于瓊脂糖凝膠電泳方法，成本較高；(3)檢測的靶標基因數量有限，如缺少blaIMP，相對于毛細管電泳技術的高分辨率，可通過進一步優(yōu)化多重PCR反應，增加靶標基因的數量。對臨床分離68株碳青霉烯耐藥菌株檢測，并與常規(guī)PCR測序結果進行比較，結果顯示，2種方法的檢測結果完全一致。結果表明，該方法可有效用于4種碳青霉烯酶基因的檢測。在耐藥菌株碳青霉烯酶基因的檢測中，并未發(fā)現(xiàn)攜帶blaVIM和blaOXA-48的菌株，這主要是由于這兩種基因分別流行于地中海國家和歐美國家，在我國較少出現(xiàn)[14]。

綜上所述，本研究建立了一種可用于同時檢測4種常見的碳青霉烯酶基因的多重PCR毛細管電泳方法，并且設置16S rRNA基因為內參基因，用于監(jiān)控整個檢測過程，該方法可有效用于調查臨床分離菌株的碳青霉烯酶基因的攜帶情況。