劉波，單南冰，雷習(xí)群，李輝(阜陽市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，安徽阜陽236000)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)屬于β屬冠狀病毒，人群對(duì)SARS-CoV-2缺乏免疫能力，具有普遍易感、傳播迅速和致病能力強(qiáng)的特點(diǎn)[1]。當(dāng)前，我國(guó)新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情總體相對(duì)穩(wěn)定，但仍需警惕境外輸入性病例以及局部地區(qū)的新發(fā)病例。病毒核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間是評(píng)估病情進(jìn)展的重要指標(biāo)，也是患者解除傳播風(fēng)險(xiǎn)、達(dá)到出院標(biāo)準(zhǔn)的主要參考[2]。臨床經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使部分患者臨床癥狀消失、復(fù)查胸部影像發(fā)現(xiàn)肺部陰影已明顯吸收，但核酸檢測(cè)反復(fù)陽性，而不得不繼續(xù)延長(zhǎng)治療和隔離的時(shí)間，因此，分析可能影響核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的因素對(duì)于指導(dǎo)臨床診療有一定意義。根據(jù)國(guó)家臨床指南推薦的診療方案，不同臨床中心、不同患者之間抗病毒藥物種類的選擇趨于同質(zhì)化，因此多數(shù)學(xué)者認(rèn)為影響病毒清除效率主要的因素仍然為機(jī)體的自身免疫能力。淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞之一，分為T細(xì)胞、B細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞等，其中T淋巴細(xì)胞在抵抗病毒感染方面發(fā)揮主要作用。本研究對(duì)COVID-19患者T淋巴細(xì)胞亞群和核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間進(jìn)行分析。

1 資料和方法

1.1臨床資料 2020年2月16日—3月12日阜陽市第二人民醫(yī)院累計(jì)收治COVID-19患者159例，其中包括由周邊城市轉(zhuǎn)入的危重型病例4例。所有患者均采集鼻咽、口咽部咽拭子，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)SARS-CoV-2核酸陽性，符合《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中COVID-19診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)COVID-19診斷明確；(2)臨床資料齊全；(3)無院外COVID-19相關(guān)性治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)外市轉(zhuǎn)入病例；(2)出院后隨訪計(jì)劃中出現(xiàn)核酸檢測(cè)復(fù)陽病例；(3)合并血液系統(tǒng)基礎(chǔ)疾病，如淋巴瘤。

1.2資料收集 結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果和臨床經(jīng)驗(yàn)，收集可能影響核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的相關(guān)資料，包括：(1)人口和流行病學(xué)資料：性別、年齡、武漢旅居史、基礎(chǔ)疾病。(2)臨床癥狀：發(fā)熱持續(xù)時(shí)間和咳嗽持續(xù)時(shí)間。(3)抗病毒和抗菌藥物使用方案：藥物名稱，聯(lián)合應(yīng)用的種類。我院采取的抗病毒藥物主要有洛匹那韋/利托那韋500 mg口服bid，阿比多爾0.2 g口服tid，奧司他韋75 mg口服bid；抗菌藥物有第三代頭孢菌素類和莫西沙星0.4 g靜脈滴注qd。是否使用糖皮質(zhì)激素和免疫球蛋白。(4)肺部影像學(xué)資料：采用美國(guó)GE螺旋CT掃描儀，動(dòng)態(tài)復(fù)查胸部CT了解肺部炎癥演變，采用半定量評(píng)分方法進(jìn)行CT評(píng)分，多次CT攝片取肺部炎癥最重的影像評(píng)分結(jié)果作為CT評(píng)分。根據(jù)各肺葉累及范圍得分0～4分，肺葉內(nèi)未見明顯炎癥病灶計(jì)0分，病變累計(jì)肺葉面積1%～25%計(jì)1分，累及26%～50%計(jì)2分，累及51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分，合計(jì)總分0～20分。

1.3淋巴細(xì)胞亞群和核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間 所有患者核酸檢測(cè)陽性確診后當(dāng)日采集血液樣本5 mL，用邁瑞B(yǎng)riCyte E6型流式細(xì)胞儀(FITC、PE、PreCP以及APC步驟所需材料均來自邁瑞醫(yī)療公司)，檢測(cè)T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，包括CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)?；颊叽_診后每間隔1 d采集咽拭子標(biāo)本1次，連續(xù)2次核酸檢測(cè)呈陰性視為核酸轉(zhuǎn)陰，截取患者發(fā)病的日期至首次核酸檢測(cè)陰性的時(shí)間，計(jì)為核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間。

1.4臨床分型 根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》將患者進(jìn)行臨床嚴(yán)重程度分型。輕型：臨床癥狀輕微，影像學(xué)未見肺炎表現(xiàn)。普通型：具有發(fā)熱、呼吸道等癥狀，影像學(xué)檢查可見肺炎表現(xiàn)。重型：符合下列任何一條：(1)呼吸窘迫，RR≥30次/分；(2)靜息狀態(tài)下，指氧飽和度≤93%；(3)動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)/吸氧濃度(FiO2)≤300 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。危重型：符合以下情況之一者：(1)出現(xiàn)呼吸衰竭，且需要機(jī)械通氣；(2)出現(xiàn)休克；(3)合并其他器官功能衰竭需ICU監(jiān)護(hù)治療。重型和危重型患者統(tǒng)稱為重癥病例。

2 結(jié)果

2.1一般結(jié)果 最終納入COVID-19患者共計(jì)155例，首例患者于1月16日入院，2月20日出院，最后1例于2月13日入院，3月12日出院，住院時(shí)間(17.29±6.20) d，范圍9～35 d。102例(65.81%)為家族聚集性病例，53例(34.19%)為散發(fā)病例。臨床癥狀表現(xiàn)多種多樣，多數(shù)伴有2種和2種以上癥狀，其中以發(fā)熱(92例，80.70%)和咳嗽(54例，47.37%)為主，發(fā)熱患者中43例單純表現(xiàn)為發(fā)熱，占37.72%，持續(xù)發(fā)熱時(shí)間(38.65±12.25)h，范圍17～146 h；咳嗽時(shí)間(5.41±2.07)d，范圍2～13 d。嚴(yán)重程度分級(jí)：入院時(shí)155例患者中輕型11例，普通型144例；根據(jù)分型標(biāo)準(zhǔn)，26例患者進(jìn)展為重型，4例進(jìn)展為危重型，重癥患者占19.35%。期間每間隔1 d檢測(cè)核酸，核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間(15.88±6.36) d，范圍6～38 d。經(jīng)過治療和護(hù)理，所有患者均到達(dá)出院標(biāo)準(zhǔn)，無死亡病例。

2.2影響核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的單因素分析 核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間15.88 d(修約后取16 d)，分為核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間≥16 d組(A組)和<16 d組(B組)，A組84人，B組71人。單因素分析顯示，兩組患者間性別、基礎(chǔ)疾病合并率、武漢旅居史、發(fā)熱持續(xù)時(shí)間、咳嗽持續(xù)時(shí)間、糖皮質(zhì)激素、丙種球蛋白、抗病毒藥物種類之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而年齡、臨床分型、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、肺CT評(píng)分之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 影響核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的單因素分析

2.3多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析顯示，年齡≥60歲、重癥患者以及CD8+T細(xì)胞水平降低是影響核酸轉(zhuǎn)陰的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的多因素Logistic分析

2.4核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間和淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系 COVID-19患者中位CD4+、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為428個(gè)/μL和299個(gè)/μL；核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間與CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.689，P=0.024)，與CD4+T計(jì)數(shù)無相關(guān)性(r=-0.544，P=0.137)。

2.5CD8+T淋巴細(xì)胞預(yù)測(cè)核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間延遲的價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，CD8+T細(xì)胞預(yù)測(cè)核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間延長(zhǎng)的曲線下面積(AUC)為0.714，95%可信區(qū)間(95%CI)為0.630～0.799，最佳臨界值為236個(gè)/μL，敏感性和特異性分別為80.5%和51.5%。見圖1。

圖1 CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)預(yù)測(cè)核酸轉(zhuǎn)陰延遲的ROC曲線

3 討論

COVID-19潛伏期相對(duì)較短，早期癥狀往往不典型，無癥狀感染者也是潛在的傳染源。目前，COVID-19的治療仍缺乏特異性抗病毒藥物，早隔離、早治療是扼制病情蔓延的主要手段。核酸檢測(cè)是COVID-19患者常規(guī)檢查項(xiàng)目，也是解除隔離和出院的主要條件之一，需連續(xù)2次呼吸道標(biāo)本核酸檢測(cè)陰性(采樣時(shí)間至少間隔1 d)，同時(shí)結(jié)合患者體溫、呼吸道癥狀和肺部CT表現(xiàn)判斷[4]。臨床經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間具有明顯的滯后性，部分患者臨床癥狀消失、肺部炎癥吸收，但核酸檢測(cè)反復(fù)陽性，分析可能影響核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的因素對(duì)于預(yù)判病程、指導(dǎo)治療有一定意義。

本研究中，核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間為6～38 d，平均15.88 d，時(shí)間跨度較大，均數(shù)超出2周，與之相關(guān)的平均住院時(shí)間也達(dá)17 d以上。年齡和臨床嚴(yán)重程度與核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間相關(guān)，Logistics回歸分析顯示≥60歲的老年人群和重癥患者出現(xiàn)核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間延長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)分別是非老年人群的1.72倍和2.33倍。研究證實(shí)，兒童、青少年危重癥患者的比例明顯較低，死亡病例的報(bào)道更是少見[5]，而老年COVID-19患者的治愈率低于中青年，治愈的老年患者平均住院時(shí)間更長(zhǎng)、危重癥的比例更高[6-7]。老年患者機(jī)體的自身免疫能力低下，基礎(chǔ)疾病合并率高，免疫防御和清除能力不足，病毒增殖復(fù)制相對(duì)活躍。同時(shí)，SARS-CoV-2誘導(dǎo)機(jī)體過度免疫反應(yīng)引發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，這在重型和危重型COVID-19患者中較為常見，近期在COVID-19死亡病例的肺組織病理分析中得到進(jìn)一步證實(shí)[8]。因此，危重癥患者的免疫紊亂、免疫失衡不利于病毒的清除，引起病程遷延。

在2003年嚴(yán)重急性呼吸綜合征流行期間，大量研究證明，淋巴細(xì)胞減少和T淋巴細(xì)胞亞群的持續(xù)消耗是病情進(jìn)展的參考標(biāo)準(zhǔn)之一，長(zhǎng)時(shí)間低水平CD4+、CD8+T細(xì)胞提示預(yù)后不良[9]。此次報(bào)道顯示，COVID-19患者淋巴細(xì)胞水平減低亦十分常見，危重癥患者細(xì)胞免疫功能受損，CD4+、CD8+T細(xì)胞水平相對(duì)更低。凌云等[10]指出，CD8+T淋巴細(xì)胞水平下降是影響病情向重癥方向轉(zhuǎn)化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在本研究中，CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，多因素回歸分析顯示，CD8+T細(xì)胞水平降低是影響核酸轉(zhuǎn)陰的危險(xiǎn)因素。值得一提的是，各研究間對(duì)于CT分級(jí)評(píng)分的報(bào)道存在一定差異。龔惠莉等[11]納入179例COVID-19患者進(jìn)行分析指出，CT評(píng)分是影響核酸轉(zhuǎn)陰的影響因素之一。在本研究中，不同核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間的COVID-19患者CT評(píng)分差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但多因素分析CT評(píng)分并不是相關(guān)因素。除此之外，抗菌藥物、抗病毒藥物、糖皮質(zhì)激素以及丙種球蛋白的使用對(duì)核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間均無影響，提示上述治療對(duì)改善癥狀、調(diào)節(jié)免疫有一定幫助，但不能加速機(jī)體對(duì)病毒的清除效率，COVID-19患者的恢復(fù)主要與自身免疫有關(guān)[12]。我們進(jìn)一步采用ROC曲線的方法驗(yàn)證CD8+T細(xì)胞下降的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示AUC為0.714，統(tǒng)計(jì)學(xué)上達(dá)到“較為準(zhǔn)確”的標(biāo)準(zhǔn)(0.7

綜上所述，COVID-19患者CD8+T淋巴細(xì)胞降低，老年人群和重癥患者以及CD8+T細(xì)胞水平顯著下降可能影響SARS-CoV-2核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間，病程相對(duì)更長(zhǎng)。