崔莉 李瑩 馮進 柴智

摘要：提高益生菌抗熱性的研究一直是工業(yè)化噴霧干燥生產(chǎn)益生菌奶粉的熱點與難點，研究益生菌 FM-LP-4 的熱激預(yù)處理條件，優(yōu)化菌體經(jīng)熱激預(yù)處理后使用牛蒡復(fù)合抗熱保護劑的噴霧干燥工藝。結(jié)果表明，適宜進行熱激的益生菌培養(yǎng)時間段為10～11 h，最適熱激溫度為55 ℃，熱激時間為25 min。噴霧干燥的最優(yōu)工藝為：出口溫度80 ℃，進口溫度170 ℃，進料速率0.8 L/h，此時活菌數(shù)為4.64×109 CFU/mL。熱激菌體加牛蒡復(fù)合抗熱保護劑經(jīng)優(yōu)化的噴霧干燥工藝獲得益生菌奶粉，其中益生菌活菌數(shù)比對照提高約1個數(shù)量級。

關(guān)鍵詞：牛蒡;益生菌;熱激;噴霧干燥;奶粉

中圖分類號：TS252.51 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）10-0166-04

中國已經(jīng)趕超日本、美國成為全球第一大奶粉消費國。隨著人們營養(yǎng)保健意識的不斷提高和消費觀念的轉(zhuǎn)變，具有營養(yǎng)保健功能的高端乳制品日益成為新的消費引擎。益生菌奶粉為含有益生菌的奶粉，具有改善人體腸道宿主環(huán)境的作用。目前，我國市場上高檔的功能性益生菌乳制品已出現(xiàn)，然而，大多以發(fā)酵乳的形式出現(xiàn)，需冷鏈運輸，且保質(zhì)期短。功能性益生菌奶粉的研制，突破了運輸壁壘，擴大消費區(qū)域，具有廣闊的市場化前景。

益生菌奶粉常采用將奶粉和凍干益生菌粉混合的方法制備，冷凍干燥的高成本是其瓶頸。若能采用噴霧干燥1次制備益生菌奶粉，則有望大幅降低成本。噴霧干燥過程對益生菌帶來脫水、氧化和熱損傷，造成活菌數(shù)大量下降。有學者提出，多種方法來提升噴霧干燥益生菌的活性，主要有加強對細胞結(jié)構(gòu)的保護、提升益生菌的外界應(yīng)激抗性，優(yōu)化噴霧干燥參數(shù)，篩選應(yīng)用抗熱保護劑等[1]。益生菌在外界應(yīng)激下會生成應(yīng)激蛋白用于修復(fù)受損細胞，提升菌體應(yīng)激抗性。熱激處理是利用上述特性，通過模擬外界應(yīng)激條件以增加菌體對應(yīng)激環(huán)境的耐受能力，是一種較常用的提升菌體耐熱能力的途徑。

噴霧干燥抗熱保護劑的篩選已成為相關(guān)學者關(guān)注熱點，合適的保護劑能有效提高益生菌在干燥、儲藏和體內(nèi)消化過程等嚴苛環(huán)境下的存活率。Chaikham等研究發(fā)現(xiàn)，益生元（菊糖、木糖和低聚果糖等）對益生菌的耐熱性有保護作用[2]。牛蒡塊根富含菊糖、酚酸、黃酮、牛蒡苷及多種維生素等營養(yǎng)功能成分?，F(xiàn)代醫(yī)學證明，牛蒡具有抗氧化、抑菌、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、保護肝臟[2-3]、促進益生菌生長等多種功效[4-5]。雷張騰將菊糖作為保拉迪酵母的復(fù)合凍干保護劑成分，并認為菊糖中的羥基通過與細胞膜磷脂和蛋白質(zhì)以氫鍵結(jié)合，對菌體起到保護作用[6]。崔莉等通過單因素和正交設(shè)計優(yōu)化獲得FM-LP-4牛蒡復(fù)合抗熱保護劑配方（豐縣牛蒡粉2.0%、葡萄糖4%、沛縣牛蒡粉2.0%），菌體在復(fù)合保護劑保護下經(jīng)75 ℃熱處理10 min后活菌數(shù)為2.12×106 CFU/mL[7]。本研究在獲得保護劑配方的基礎(chǔ)上，探討熱激處理和噴霧干燥工藝參數(shù)優(yōu)化對益生菌奶粉中益生菌FM-LP-4的耐熱保護作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

副干酪乳桿菌FM-LP-4為研究室保藏。試驗時間為2019年7月12日至8月17日。明膠，用PBS溶解后滅菌備用，使用前水浴加熱溶解。蔗糖和甘油：需經(jīng)微孔濾膜過濾。陸橋MRS肉湯培養(yǎng)基。MRS固體培養(yǎng)基，在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5%瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-ID 型凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;上海第三分析儀器廠;高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;H1850R型高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司;HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;HYG-A全溫搖瓶柜，太倉實驗設(shè)備廠;FW100高速萬能打粉機，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及擴大培養(yǎng) 將副干酪乳桿菌 FM-LP-4 凍干菌種接入液體培養(yǎng)基中，34 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，活化2～3次?；罨玫姆N子液以5%的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，同樣條件擴大培養(yǎng)后菌液離心取菌泥，用無菌生理鹽水或牛奶沖洗，制成活菌數(shù)為1010 CFU/mL的菌懸液。

1.3.2 活菌數(shù)測定 按照GB 4789.35—2010，采用稀釋涂布平板計數(shù)法。

1.3.3 牛蒡復(fù)合抗熱保護劑的制備 牛蒡超微粉的制備：將豐縣和沛縣牛蒡于60 ℃下干燥4 h，至水分6%以下，經(jīng)粉碎機超低溫粉碎，過325目篩得牛蒡超微粉。牛蒡復(fù)合抗熱保護劑配方為豐縣牛蒡粉2.0%、葡萄糖4%、沛縣牛蒡粉2.0%。

1.3.4 抗氧化能力的測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測定 參考Shen 等的方法[8]，略做改進。1 mL經(jīng)熱激預(yù)處理菌液溶解到9 mL 95% 乙醇溶液，取2 mL樣品混合溶液加 2 mL 0.16 mmol/L DPPH 溶液，25 ℃ 水浴加熱 0 min，在517 nm處測試樣吸光度（Di），用蒸餾水代替上述體系中樣品混合溶液測得空白吸光度（D0），用 95% 乙醇代替上述體系中 DPPH 溶液。測得樣品本底吸光度（Dj），清除率=1-（Di-Dj）/D0×100%，其中D0取0.552。

1.3.4.2 OH自由基清除能力的測定 參考Shen等的方法[8]，略做改進。1 mL經(jīng)熱激預(yù)處理菌液溶解到9 mL 95%乙醇溶液，取4 mL樣品混合溶液加入8.8 mmol/L H2O2、9 mmol/L FeSO4 和 9 mmol/L水楊酸各 0.5 mL，混勻，37 ℃水浴加熱30 min，在 510 nm 處測定吸光度（Di′），用蒸餾水代替體系中樣品混合溶液，測得空白吸光度（D0′），用蒸餾水替代HO溶液，測得樣品本底吸光度（Dj′），清除率=1-（Di′-Dj′）/D0′×100%，其中D0′取0.602。

1.3.4.3 Fe3+還原力的測定[9] 1 mL經(jīng)熱激預(yù)處理菌液溶解到9 mL 95% 乙醇溶液。取2 mL樣品混合溶液加入10 g/L鐵氰化鉀溶液和 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH值6.6）各2 mL，于50 ℃ 保溫 20 min，加入2 mL 1 g/mL 三氯乙酸溶液，混勻，3 000 r/min 離心10 min，取 2 mL 上清液，加入 2 mL 蒸餾水和 0.4 mL 1 g/L 三氯化鐵溶液，室溫反應(yīng)10 min，于700 nm 處測定吸光度。

1.3.5 熱激條件

1.3.5.1 熱激菌體培養(yǎng)時間的選擇 根據(jù)FM-LP-4生長曲線，選擇對數(shù)期菌數(shù)較多的時間段作為熱激菌體培養(yǎng)最佳時間段。

1.3.5.2 耐熱曲線 選擇45、50、55、60 ℃為熱處理溫度，將益生菌液在上述溫度下水浴，每隔5 min測定活菌數(shù)，以熱處理時間為橫坐標、活菌數(shù)為縱坐標繪制其耐熱曲線。

1.3.5.3 不同熱激條件對菌體抗氧化活性的影響 在選定的熱激條件下對FM-LP-4熱激處理，測定抗氧化活性變化，選擇菌體抗氧化活性較高的熱激條件。

1.3.6 噴霧干燥條件對益生菌奶粉中益生菌活菌數(shù)的測定的影響 經(jīng)熱激預(yù)處理菌液離心得菌泥，溶解于不同濃度含牛蒡復(fù)合抗熱保護劑無菌牛奶中，采用正交試驗L9（34）對出口溫度（A）、進口溫度（B）、進料速率（C）3項噴霧干燥工藝參數(shù)對益生菌奶粉中益生菌活菌數(shù)的測定的影響進行檢測，正交試驗因素水平見表1。試驗結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，以篩選出最佳噴霧干燥條件。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 用Microsoft Excel 1997—2003進行數(shù)據(jù)整理和作圖分析，采用SAS V8統(tǒng)計進行方差分析，并應(yīng)用t檢驗進行樣品間的顯著性差異分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 FM-LP-4亞致死熱激條件確定

2.1.1 最佳耐熱時間的選擇 從圖1可以看出，10～12 h 的FM-LP-4生長速率最快，此時LA達到對數(shù)生長期，并在培養(yǎng)12 h的時候達到了菌數(shù)的最大值，Corcoran等認為，對數(shù)生長期的菌體較穩(wěn)定生長期的菌體可塑性強，應(yīng)對脅迫情況提升抗逆性好，可以很快調(diào)整體內(nèi)代謝途徑以適應(yīng)不利環(huán)境[10-11]。張書猛等研究比較嗜酸乳桿菌在不同菌體生長期的耐熱性，提出其在穩(wěn)定期即培養(yǎng)11 h時，抗熱性能較優(yōu)[12]。結(jié)合相關(guān)研究，選擇10～12 h 為熱激菌體培養(yǎng)最佳時間段。

2.1.2 FM-LP-4耐熱曲線 從圖2可以看出，F(xiàn)M-LP-4在60 ℃條件下處理15 min基本失活。在45、50、55 ℃條件下，處理25 min時，菌數(shù)均有較明顯的下降，但依然保持較好的存活率。胡榴榴研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌1.12.8 在50 ℃熱處理25 min后，活菌數(shù)下降不到1個數(shù)量級;60 ℃熱處理 25 min，菌體數(shù)量下降了約1個數(shù)量級[13]，因此確定60 ℃ 25 min 為其熱激處理條件。

L. plantarum 299v在噴霧干燥前經(jīng)過49.5 ℃的亞致死溫度處理30、60 min于室溫下貯藏180 d，其存活性顯著增強，并推測熱應(yīng)激引起的保護作用有可能是生成了熱休克蛋白[14]。L.acidophilus以 50 ℃、L. rhamnosus以 52.5 ℃亞致死預(yù)處理12 min后，均能夠耐受隨后的92 ℃的噴霧干燥出口溫度，而通常乳酸菌能夠耐受的溫度為 85～90 ℃[15]。經(jīng)過亞致死溫度（52 ℃，15 min）預(yù)處理后再噴霧干燥將使L. casei Nad、L. plantarum 8329的菌數(shù)下降0.16、0.49 lg（CFU/mL），而未經(jīng)預(yù)處理直接噴霧干燥其菌數(shù)下降0.85、0.95 lg（CFU/mL）[16]。

2.1.3 不同熱激溫度對抗氧化活性的影響 從表2可以看出，F(xiàn)M-LP-4在55 ℃條件下處理25 min時，各項抗氧化指標均高于50 ℃。張書猛等選取40、45、50、55、60 ℃進行30 min熱激處理，研究其熱激后的菌數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)在45 ℃時菌體具有較高的活菌數(shù)，存活率也較高，并且具有較好的發(fā)酵性能[12]，所以選擇45 ℃作為熱激溫度。從圖2、表2可以看出，F(xiàn)M-LP-4在55 ℃條件下的存活率較高，而且抗氧化活性最高，推測其經(jīng)熱激休克后產(chǎn)生了熱適應(yīng)，故選擇55 ℃處理25 min為最佳熱激條件。

2.2 含F(xiàn)M-LP-4 奶粉的噴霧干燥工藝確定

2.2.1 噴霧干燥正交試驗 含F(xiàn)M-LP-4 奶粉的噴霧干燥工藝參數(shù)L9（34）正交試驗因素水平取值及結(jié)果見表3。經(jīng)直觀分析比較3個因素的極差R值可知各因素對噴霧干燥后菌存活的影響程度為A>B>C，由各因素的均值大小可知最佳組合為A1B3C3，即噴霧干燥工藝參數(shù)為：出口溫度 80 ℃，進口溫度170 ℃，進料速率0.8 L/h。

2.3 熱激、牛蒡復(fù)合抗熱保護劑和噴霧干燥工藝優(yōu)化及聯(lián)合對益生菌抗熱性能的影響

從表4可知，牛蒡復(fù)合抗熱保護劑可以提升益生菌的存活率近2倍，熱激聯(lián)合牛蒡復(fù)合抗熱保護劑則可以將益生菌的活菌數(shù)提高約1個數(shù)量級。

3 結(jié)論

FM-LP-4適宜進行熱激的培養(yǎng)時間段為 10～11 h，最適熱激溫度為55 ℃，熱激時間為 25 min。含F(xiàn)M-LP-4益生菌奶粉噴霧干燥的最優(yōu)工藝為：出口溫度80 ℃，進口溫度170 ℃，進料速率0.8 L/h，熱激聯(lián)合牛蒡復(fù)合抗熱保護處理益生菌經(jīng)噴霧干燥后活菌數(shù)比對照提高約1個數(shù)量級。

參考文獻：

[1]傅 楠，陳曉東. 益生菌在噴霧干燥過程中的活性變化與保護策略[J]. 化工進展，2018，37（5）：1633-1645.

[2]Chaikham P，Kemsawasd V，Seesuriyachan P. Spray drying probiotics along with maoluang juice plus Tiliacora triandra gum for exposure to the in vitro gastrointestinal environments[J]. LWT，2017，78：31-40.

[3]Irene A R，Ethel E P，Genovese D B，et al. In vitro prebiotic activity of inulin-rich carbohydrates extracted from Jerusalem artichoke （Helianthus tuberosus L.） tubers at different storage times by Lactobacillus paracasei[J]. Food Research International，2014，62：59-65.

[4]Velázquez-Martínez J R，González-Cervantes R M，Hernández-Gallegos M，et al. Prebiotic potential of agave angustifolia Haw fructans with different degrees of polymerization[J]. Molecules，2014，19（8）：12660-12675.

[5]Moro T M A，Celegatti C M，Pereira A P A，et al. Use of burdock root flour as a prebiotic ingredient in cookies[J]. LWT，2018，90：540-546.

[6]雷張騰. 保拉迪酵母菌粉的制備及穩(wěn)定性研究[D]. 西安：陜西科技大學，2017：17-18.

[7]崔 莉，潘 超，張曉曉，等. 益生菌抗熱牛蒡復(fù)合保護劑篩選優(yōu)化研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（18）：211-214.

[8]Shen Y，Zhang H，Cheng L，et al. In vitro and in vivo antioxidant activity of polyphenols extracted from black highland barley[J]. Food Chemistry，2016，194：1003-1012.

[9]Benzie I F，Strain J J. The ferric reducing ability of plasma （FRAP） as a measure of “antioxidant power”：the FRAP assay[J]. Analytical Biochemistry，1996，239（1）：70-76.

[10]Corcoran B M，Ross R P，F(xiàn)itzgerald G F，et al. Enhanced survival of GroESL-overproducing Lactobacillus paracasei NFBC 338 under stressful conditions induced by drying[J]. Applied and Environmental Microbiology，2006，72（7）：5104-5107.

[11]Corcoran B M，Ross R P，F(xiàn)itzgerald G F，et al. Comparative survival of probiotic lactobacilli spray-dried in the presence of prebiotic substances[J]. Journal of Applied Microbiology，2004，96（5）：1024-1039.

[12]張書猛，呂嘉櫪，侯 蓓，等. 熱激處理對嗜酸乳桿菌耐熱性的影響[J]. 中國乳品工業(yè)，2011，39（9）：28-30.

[13]胡榴榴. 干酪乳桿菌高密度培養(yǎng)及干燥工藝的研究[D]. 揚州：揚州大學，2014：52-53.

[14]Barbosa J，Borges S，Teixeira P. Influence of sub-lethal stresses on the survival of lactic acid bacteria after spray-drying in orange juice[J]. Food Microbiology，2015，52：77-83.

[15]Anekella K，Orsat V. Optimization of microencapsulation of probiotics in raspberry juice by spray drying[J]. LWT，2013，50（1）：17-24.

[16]Paéz R，Lavari L，Vinderola G，et al. Effect of heat treatment and spray drying on lactobacilli viability and resistance to simulated gastrointestinal digestion[J]. Food Research International，2012，48（2）：748-754.