蔡升 楊平 續(xù)晨 蔡小寧

摘要：用1對通用引物對采集自湖北省恩施市魚塘壩獨特富硒礦床土壤上的壺瓶碎米薺葉片DNA進行PCR擴增，然后對PCR擴增產(chǎn)物測序，獲得了長度為852 bp的包含核糖體基因轉錄間隔區(qū)的DNA序列。將獲得的多條碎米薺屬不同物種的核糖體基因轉錄間隔區(qū)的DNA序列進行比對，拼接出“基準”序列，然后再比較不同物種核糖體基因轉錄間隔區(qū)的序列與“基準”序列的堿基差異。結果表明，壺瓶碎米薺與“基準”序列相比，堿基差異最多，達到17處，遠遠超過同屬其他物種與“基準”序列的堿基差異，是平均數(shù)的3.3倍。據(jù)此推測，某種碎米薺長期生長于恩施市富硒地區(qū)，產(chǎn)生了能夠適應高含量硒土壤逆境的遺傳變異，形成了超強富硒的能力，進化出了壺瓶碎米薺這一新物種，從而提出了壺瓶碎米薺在高含量硒土壤逆境中加速進化假說。

關鍵詞：壺瓶碎米薺;硒;核糖體轉錄間隔區(qū);遺傳;進化;假說

中圖分類號： Q755;S188 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）10-0048-04

壺瓶碎米薺（Cardamine hupingshanensis）是一種超富硒植物，能夠忍耐土壤中高含量的硒，并能在體內(nèi)大量積累。Yuan等測得壺瓶碎米薺葉片中硒含量可達1 965 mg/kg（干質量）[1];Shao等測得壺瓶碎米薺葉片中硒的含量為1 427 mg/kg（干質量）[2]。能夠積累如此高含量的硒，說明壺瓶碎米薺具有獨特的富硒機制，對其富硒的生理生化和分子機制開展研究，揭示富硒的科學原理，將有助于對農(nóng)產(chǎn)品中硒含量進行調控，獲得更多有益于健康的農(nóng)產(chǎn)品，以造福于人類。

以往通過傳統(tǒng)的分類學方法鑒定從野外采集的壺瓶碎米薺種質資源，對鑒定人的專業(yè)要求較高，經(jīng)驗不足就可能誤采。隨著分子生物學技術的發(fā)展，科學家已經(jīng)研究出條形碼識別技術，例如通過測定植物的核糖體基因轉錄間隔區(qū)序列（internal transcribed spacer，ITS）來對物種進行鑒定，為廣大科技人員提供了便利[3]。

本試驗中，擬對采集自湖北省恩施土家族苗族自治州（恩施州）魚塘壩獨特富硒礦床土壤中生長的壺瓶碎米薺提取DNA，用通用引物進行PCR，擴增其核糖體基因轉錄間隔區(qū)序列，獲得相應的參考序列，為今后準確鑒定壺瓶碎米薺種質資源打下基礎，同時為今后進一步研究壺瓶碎米薺超常富硒能力的分子機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2020年8月將從湖北省恩施州新塘鄉(xiāng)雙河社區(qū)魚塘壩富硒土壤中采集的壺瓶碎米薺植株移栽于南京曉莊學院實驗室的盆缽中，待其生長3個月后，取新鮮嫩葉提取DNA。

1.2 DNA提取和PCR擴增

DNA提取采用北京艾德萊生物科技有限公司生產(chǎn)的DN14試劑盒;PCR擴增采用北京艾德萊生物有限公司生產(chǎn)的2×F8 FastLong PCR Master Mix，復性溫度為56 ℃，72 ℃延伸時間為10 s。

1.3 選用的引物序列

引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物代號、位置和詳細序列見表1。

1.3 PCR產(chǎn)物測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定后，交由南京擎科生物科技有限公司測序，DNA測序峰圖用Chromas軟件顯示。

1.4 序列分析

將測序獲得的序列去除兩端測序質量較差的部分，然后用Contigexpress 軟件進行拼接;登錄NCBI網(wǎng)站獲取所需要的其他碎米薺物種的含ITS的序列;用Lasergene 7.1的子軟件SeqMan 分析各種碎米薺物種ITS序列的變異;用ClustalX 1.83和MEGA 6軟件構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 壺瓶碎米薺ITS序列的獲得

采用引物ITC-5和引物ITC-3組合（引物序列見表1）對壺瓶碎米薺核糖體基因轉錄間隔區(qū)序列DNA進行PCR擴增，得到了長度約900 bp的DNA產(chǎn)物，圖1為PCR擴增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳的結果。

然后以同樣的引物對PCR產(chǎn)物測序，獲得了原始的DNA序列（圖2），對獲得的這些序列去除兩端不可靠序列，用Contigexpress軟件進行拼接，獲得了長度為852 bp的DNA序列，包含部分的18S基因、完全的ITS1（核糖體基因轉錄間隔區(qū)1）、完全的 5.8S 基因、完全的ITS2（核糖體基因轉錄間隔區(qū)2）、部分的28S基因的DNA序列，已經(jīng)提交GenBank，序列登錄號（ID）為MW282045。

2.2 不同物種間ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

將所獲得的壺瓶碎米薺的ITS序列和其他碎米薺物種的ITS序列用ClustalX 1.83軟件和MEGA 6軟件鄰接法（NJ法）構建系統(tǒng)進化樹，以擬南芥（Arabidopsis thaliana）的ITS序列（登錄號：AJ232900）為參照，結果見圖3。

從圖3可以看出，明顯可以分為3個聚類，Cardamine digitata （登錄號：EU819328，下同）、Cardamine purpurea（EU819358）、Cardamine blaisdellii（EU819312）、Cardamine pedata （EU819356）、Cardamine umbellata（EU819379）、Cardamine victoris （EU819382）、Cardamine nuttallii （EU819350）、Cardamine rupicola （EU819368）、大葉碎米薺[Cardamine macrophylla（EU819344）]聚為一

類;Cardamine amporitana （AY260598）、大碎米薺[Cardamine amara（KF988052）]、碎米薺[Cardamine hirsuta（MH808258）]、彎曲碎米薺[Cardamine flexuosa（DQ268409）]、圓齒碎米薺[Cardamine scutata（DQ268475）]、Cardamine niigatensis （DQ268493）、Cardamine clematitis（EU819318）聚為一類;壺瓶碎米薺[Cardamine hupingshanensis（MW282045）]單獨聚為一類，與其他碎米薺物種遺傳距離最遠。

2.3 不同碎米薺物種ITS序列的比較分析

為進一步分析比較壺瓶碎米薺和其他碎米薺物種進化過程中產(chǎn)生的變異大小，將這些ITS序列用Lasergene的子軟件SeqMan進行拼接，得到一個“基準”的包含ITS1序列、5.8S基因序列和ITS2序列的長度為617 bp的DNA序列（圖4）。然后將各個碎米薺物種的ITS1序列和ITS2序列與“基準”序列進行比較，考察在對應位置的堿基變異情況。

由表2可知，與“基準”序列相比，每條序列的ITS1區(qū)和ITS2區(qū)平均有5.2個變異，變異最少的物種是Cardamine digitata，只有2處發(fā)生了變異;變異最多的是壺瓶碎米薺（Cardamine hupingshanensis ），有17處發(fā)生了變異，遠遠超過平均水平，是平均數(shù)的3.3倍，與變異第2多的Cardamine niigatensis相比，變異數(shù)也達到了它的2.1倍。

3 討論與結論

壺瓶碎米薺具有驚人的耐硒和聚集硒的能力，即使在全球唯一沉積型的獨立硒礦床——恩施市漁塘壩硒礦床的土壤中也能生長良好[4-6]，顯然有其獨特的遺傳特性。從前述的分析可知，壺瓶碎米薺與其同屬的其他物種相比，在核糖體轉錄間隔區(qū)的DNA序列上的差異很大，表明其進化速度遠遠超過同類物種，而其他物種的耐硒聚硒能力遠低于壺瓶碎米薺。因此推測，最初某種原始的碎米薺生長于恩施市富硒土壤上，經(jīng)受了長期的高硒環(huán)境壓力，遺傳基因產(chǎn)生了很多突變，經(jīng)過若干年的選擇，那些能夠耐受高含量硒土壤逆境的突變個體及其后代存活了下來并繁衍至今，從而進化成新物種——壺瓶碎米薺[7]。也就是說，高含量硒土壤環(huán)境加速了壺瓶碎米薺的遺傳進化，造成其遠遠多于同屬其他物種的DNA序列的變異。今后進一步的研究工作，可以找出耐受和富集硒的相關基因，研究其功能和作用機制。還可以對多種碎米薺物種的基因進行橫向比較，研究耐受和富集硒相關基因的進化路徑。

此外，筆者先建立“基準”序列，然后再與其比較DNA堿基的變異情況，可以很直觀地觀察到物種的進化速度，該方法可應用到同類研究上。如果能編制出對應的軟件，則可以大大提高效率。

在本試驗中，筆者對取自恩施市魚塘壩獨特富硒礦床土壤上生長的壺瓶碎米薺DNA進行PCR擴增，然后再對PCR擴增產(chǎn)物測序，得到了壺瓶碎米薺核糖體基因轉錄間隔區(qū)序列，為其分子鑒定提供了參考序列。本試驗所選用的引物擴增出來的條帶特異性好，幾個獨立的PCR產(chǎn)物雙向測序獲得的序列在去除了兩端的部分序列后，重復性很好，因此建立了有效的壺瓶碎米薺分子鑒定方法。

參考文獻：

[1]Yuan L X，Zhu Y Y，Lin Z Q，et al. A novel selenocystine-accumulating plant in selenium-mine drainage area in Enshi，China[J]. PLoS One，2013，8（6）：e65615.

[2]Shao S X，Deng G D，Mi X B，et al. Accumulation and speciation of selenium in Cardamine sp. in Yutangba Se Mining Field，Enshi，China[J]. Chinese Journal of Geochemistry，2014，33（4）：357-364.

[3]Chen S L，Yao H，Han J P，et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J]. PLoS One，2010，5（1）：e8613.

[4]王玉兵，陳發(fā)菊，梁宏偉. 湖北省碎米薺屬一新記錄種——壺瓶碎米薺[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2010，49（9）：2160-2161.

[5]戴光忠. 我國富硒農(nóng)業(yè)地質環(huán)境調查進展分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2013，41（30）：12140-12143.

[6]羅金玲，楊 珖，陳鴻輝，等. 壺瓶碎米薺對硒酸鈉脅迫響應研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2020，59 （11）：47-50.

[7]Bai H F，Chen L B，Liu K M，et al. A new species of Cardamine （Brassicaceae） from Hunan，China[J]. Novon，2008，18（2）：135-137.