郭金博， 華建峰， 殷云龍， 楊 穎，①

〔1. 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省落羽杉屬樹木種質(zhì)創(chuàng)新與繁育工程研究中心， 江蘇 南京 210014；2. 南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院， 江蘇 南京 210037〕

杉科(Taxodiaceae)落羽杉屬(TaxodiumRich.)植物為落葉或半常綠喬木，原產(chǎn)于北美及墨西哥。落羽杉屬共3種，分別為池杉(T.ascendensBrongn.)、落羽杉〔T.distichum(Linn.) Rich.〕和墨西哥落羽杉(T.mucronatumTenore)，均為二倍體植物，單倍體細(xì)胞染色體數(shù)為11(2n=22)[1]。江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所從1973年起開展落羽杉屬種間雜交試驗(yàn)，已選育出10多個(gè)優(yōu)良無(wú)性系，定名為‘中山杉’(T.‘Zhongshanshan’)[2-7]。提高‘中山杉’的生長(zhǎng)量是其育種工作的主要目標(biāo)之一[8-9]，其生物量與葉片積累的光合作用產(chǎn)物密切相關(guān)，因此，提高葉片光合效率可獲得高光效速生‘中山杉’[10]。

植物葉片的葉綠素含量、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率均屬于微效多基因控制的數(shù)量性狀，遺傳規(guī)律復(fù)雜[11]。分子標(biāo)記技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地改良植物的這些數(shù)量性狀，目前已應(yīng)用于水稻(OryzasativaLinn.)[12]、大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕[13]和玉米(ZeamaysLinn.)[14]等農(nóng)作物的高光效育種研究，但在林木高光效育種研究中卻應(yīng)用較少[15]。迄今為止，‘中山杉’育種仍以傳統(tǒng)雜交方式為主，育種周期較長(zhǎng)，獲得的具優(yōu)良性狀的雜交后代較少，因此，將分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于‘中山杉’育種工作十分必要。

SNP標(biāo)記為第3代分子標(biāo)記，具有分布豐度高、穩(wěn)定性高、全自動(dòng)化操作等優(yōu)勢(shì)，為高密度遺傳圖譜構(gòu)建的理想工具[16]。然而，SNP標(biāo)記的傳統(tǒng)開發(fā)過(guò)程耗時(shí)費(fèi)錢，獲得的標(biāo)記數(shù)量偏少[17]。雖然二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得在全基因組范圍內(nèi)查找SNP分子標(biāo)記成為可能[18]，但多數(shù)林木的全基因組測(cè)序成本較高，為此，人們開發(fā)了簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)(SLAF)。該方法先用限制性內(nèi)切酶降低基因組復(fù)雜程度，再用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)酶切位點(diǎn)附近片段進(jìn)行測(cè)序，大大地降低了SNP標(biāo)記開發(fā)和基因分型的成本。

Yang等[19]利用SLAF測(cè)序技術(shù)在落羽杉屬植物指紋圖譜的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一張更高密度的遺傳圖譜，該圖譜平均圖距0.18 cM，包含11條連鎖群10 710個(gè)SNP標(biāo)記，是目前落羽杉屬植物密度最高的遺傳圖譜。本研究以‘中山杉302’(T.‘Zhongshanshan 302’)×墨西哥落羽杉回交子代BC1群體為研究對(duì)象，對(duì)現(xiàn)存的111株植株葉片的光合性狀(包括凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率)和葉綠素含量(包括葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和相關(guān)性分析，并利用本課題組前期構(gòu)建的落羽杉屬高密度遺傳圖譜[19]對(duì)這7個(gè)目標(biāo)性狀進(jìn)行QTL定位，以期找到調(diào)控落羽杉屬植物相關(guān)光合性狀和葉綠素含量的主效基因，闡明這些性狀的分子遺傳機(jī)制，為開展高光效落羽杉屬植物分子輔助育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

以栽種在江蘇省鎮(zhèn)江市丹陽(yáng)市233國(guó)道與312國(guó)道交叉口(地理坐標(biāo)為東經(jīng)119°34′、北緯31°55′)的‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代BC1群體[19]為研究對(duì)象，現(xiàn)存植株共111株?！猩缴?02’為1988年江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所在落羽杉(母本)和墨西哥落羽杉(父本)的種間雜交子代(F1)中篩選出的優(yōu)良無(wú)性系。

1.2 方法

1.2.1 光合性狀測(cè)定 于2017年7月26日(天氣晴朗)的8：00—11：00及13：00—16：00，以及7月27日(天氣晴朗)的8：00—11：00及13：00—14：40，使用LI-6400便攜式光合測(cè)定儀(美國(guó)LI-COR公司)測(cè)定所有植株距地面約1.5 m處的健康葉片的光合性狀，測(cè)定指標(biāo)包括凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率。每株選取3枚不同方向的葉片，每枚葉片重復(fù)檢測(cè)3次，結(jié)果取平均值。測(cè)定時(shí)，以紅藍(lán)光為光源，光照強(qiáng)度為1 200 μmol·m-2·s-1，葉室CO2濃度為380 μmol·mol-1。

1.2.2 葉面積測(cè)定 由于葉室內(nèi)的葉片不能占滿整個(gè)葉室，因此，待光合性狀測(cè)定完畢后，需要準(zhǔn)確測(cè)量被測(cè)葉片的面積，再根據(jù)被測(cè)葉片面積與葉室面積的比值以及各光合性狀指標(biāo)的測(cè)定值計(jì)算各指標(biāo)的實(shí)際值。測(cè)定時(shí)，將小葉摘下，重新擺放，使葉片完全展開且互不遮擋，用Epson Perfection V700掃描儀(日本Epson公司)掃描，并用WinRHIZO 軟件計(jì)算被測(cè)葉片面積。

1.2.3 葉綠素含量測(cè)定 將掃描后葉片清洗干凈、晾干并剪碎；稱取3份碎葉，每份0.2 g；加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇25 mL，避光浸提24 h。以體積分?jǐn)?shù)95%乙醇為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)665、649和470 nm下分別測(cè)定提取液的吸光度。根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用R/QTL V3.1.1軟件的復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)各性狀進(jìn)行QTL分析，通過(guò)PT檢驗(yàn)1 000次設(shè)定閾值，首先考慮0.99置信度對(duì)應(yīng)的似然函數(shù)比值對(duì)數(shù)值(logarithm of odds，LOD)閾值，若沒(méi)有定位區(qū)間則考慮0.95和0.90置信度對(duì)應(yīng)的LOD閾值。參照楊柳等[21]的標(biāo)準(zhǔn)，將LOD值大于2.0作為判定主效QTL存在的閾值，并將同一連鎖群上重疊的或遺傳距離小于5 cM的QTL歸為一個(gè)基因座。同時(shí)，統(tǒng)計(jì)各主效QTL的加性效應(yīng)值(additive effect value，ADD)和解釋表型變異率(rate of explaining phenotypic variation，EXP)。

利用EXCEL 2007軟件記錄各指標(biāo)的原始數(shù)據(jù)并計(jì)算各指標(biāo)的最大值、最小值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)；利用SPSS 19.0軟件對(duì)各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 ‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代葉片光合性狀和葉綠素含量統(tǒng)計(jì)分析

從供試‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代葉片光合性狀和葉綠素含量的頻率分布圖(圖1)看，供試7個(gè)性狀的頻率均呈現(xiàn)明顯的正態(tài)分布。

圖1 ‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代葉片光合性狀和葉綠素含量的頻率分布

供試植株葉片光合性狀和葉綠素含量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表1)表明：供試植株的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率的變幅分別為0.50～7.98 μmol·m-2·s-1、0.06～0.52 mmol·m-2·s-1、150.60～216.01 μmol·mol-1和1.62～10.92 mmol·m-2·s-1，均值分別為3.91 μmol·m-2·s-1、0.23 mmol·m-2·s-1、190.94 μmol·mol-1和5.17 mmol·m-2·s-1。4個(gè)光合性狀中，胞間CO2濃度的變異系數(shù)最小，為7.39%，而凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率的變異系數(shù)則較大，均高于30%。其中，氣孔導(dǎo)度的變異系數(shù)為43.48%，凈光合速率的變異系數(shù)為40.15%，蒸騰速率的變異系數(shù)為33.27%。

表1 ‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代葉片光合性狀和葉綠素含量的統(tǒng)計(jì)

由表1還可見：葉綠素a含量、葉綠素b含量和總?cè)~綠素含量的變幅分別為0.16～0.83、0.03～0.29和0.19～1.12 mg·g-1，均值分別為0.48、0.16和0.64 mg·g-1。3個(gè)指標(biāo)中，葉綠素b含量的變異系數(shù)最大(37.50%)，葉綠素a含量和總?cè)~綠素含量的變異系數(shù)也較大，分別為25.00%和26.56%。

2.2 ‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代葉片光合性狀和葉綠素含量的QTL定位分析

QTL定位結(jié)果表明：‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代葉片的蒸騰速率和葉綠素b含量未定位到QTL，而凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、葉綠素a含量和總?cè)~綠素含量均定位到主效QTL，且葉綠素a含量和總?cè)~綠素含量的似然函數(shù)比值對(duì)數(shù)值(LOD)和加性效應(yīng)值(ADD)輪廓圖相似(圖2)。

LOD： 似然函數(shù)比值對(duì)數(shù)值Logarithm of odds； ADD： 加性效應(yīng)值A(chǔ)dditive effect value.

LOD值大于2.0的主效QTLs共8個(gè)，詳細(xì)特征見表2。由表2可見：這8個(gè)主效QTLs分別位于1號(hào)連鎖群(LG1)、6號(hào)連鎖群(LG6)和11號(hào)連鎖群(LG11)，其中，LG1和LG6各有2個(gè)主效QTLs，LG11有4個(gè)主效QTLs，共包含98個(gè)SLAF標(biāo)記。并且，這些主效QTLs的置信區(qū)間不同。

表2 ‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代葉片光合性狀和葉綠素含量的主效QTLs特征

由表2還可見：凈光合速率僅定位到1個(gè)主效QTL(q1-1)，位于LG1，q1-1包含25個(gè)SLAF標(biāo)記，解釋表型變異率為5.68%，LOD值為2.08，ADD值為-0.78，說(shuō)明該QTL區(qū)間基因參與凈光合速率負(fù)調(diào)控。氣孔導(dǎo)度也只定位到1個(gè)主效QTL(q11-1)，位于LG11，q11-1包含3個(gè)SLAF標(biāo)記，解釋表型變異率為7.85%，LOD值為2.29，ADD值為-0.05，說(shuō)明該QTL區(qū)間基因參與氣孔導(dǎo)度負(fù)調(diào)控。胞間CO2濃度定位到2個(gè)主效QTLs，均位于LG6，分別為q6-1和q6-2。其中，q6-1包含3個(gè)SLAF標(biāo)記，解釋表型變異率為9.76%～10.70%，LOD值為3.83～4.65，ADD值為-8.67～-8.19，說(shuō)明該QTL區(qū)間基因參與胞間CO2濃度負(fù)調(diào)控；q6-2只包含1個(gè)SLAF標(biāo)記，解釋表型變異率為0.62%，LOD值為2.65，ADD值為2.08，說(shuō)明該QTL區(qū)間基因參與胞間CO2濃度正調(diào)控。

由表2還可見：葉綠素a含量?jī)H定位到1個(gè)主效QTL(q11-2)，位于LG1，q11-2包含13個(gè)SLAF標(biāo)記，解釋表型變異率為10.95%，LOD值為2.94，ADD值為-0.08，說(shuō)明該QTL區(qū)間基因參與葉綠素a含量負(fù)調(diào)控?？?cè)~綠素含量在LG1上定位到1個(gè)主效QTL(q1-2)，在LG11上定位到2個(gè)主效QTLs，分別為q11-3和q11-4。其中，q1-2包含26個(gè)SLAF標(biāo)記，解釋表型變異率為6.51%～6.64%，LOD值為2.27～2.40，ADD值為-0.09，說(shuō)明該QTL區(qū)間基因參與總?cè)~綠素含量負(fù)調(diào)控；q11-3包含26個(gè)SLAF標(biāo)記，解釋表型變異率為9.66%，LOD值為3.01，ADD值為-0.10，說(shuō)明該QTL區(qū)間基因參與總?cè)~綠素含量負(fù)調(diào)控；q11-4僅包含1個(gè)SLAF標(biāo)記，解釋表型變異率為6.60%，LOD值為2.13，ADD值為-0.09，說(shuō)明該QTL區(qū)間基因參與總?cè)~綠素含量負(fù)調(diào)控。

3 討 論

相關(guān)研究結(jié)果表明：從基因組差異較大的親本雜交后代中能獲得更多的多態(tài)性標(biāo)記[22]。但是，當(dāng)雙親基因組差異較大時(shí)，其染色體的非同源區(qū)段也可能增多，致使連鎖分析難度增大[23]；同時(shí)，雙親基因組差異較大還會(huì)造成染色體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，致使同源染色體在配對(duì)時(shí)更易發(fā)生交叉互換[24]，嚴(yán)重破壞標(biāo)記和性狀間的穩(wěn)定性。本研究從‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代中共定位到8個(gè)主效QTLs，LOD值為2.08～4.65，解釋表型變異率為0.62%～10.95%，上述原因可能是導(dǎo)致獲得的主效QTLs較少、LOD值偏低及解釋表型貢獻(xiàn)率較低的主要原因。

本研究定位到的8個(gè)主效QTLs分別位于LG1、LG6和LG11連鎖群上，其中，LG1和LG6各有2個(gè)主效QTLs，LG11有4個(gè)主效QTLs，且各主效QTLs的置信區(qū)間不同，說(shuō)明這8個(gè)主效QTLs不存在“一因多效”現(xiàn)象。值得注意的是，僅q6-2位點(diǎn)基因參與胞間CO2濃度正調(diào)控，其余7個(gè)主效QTLs區(qū)間基因均參與相應(yīng)性狀的負(fù)調(diào)控。植物光合作用是一系列復(fù)雜的代謝反應(yīng)的總和，極易受環(huán)境因子的影響[25-26]。本研究實(shí)驗(yàn)期間正處于當(dāng)?shù)刈顭犭A段，供試植株在高溫條件下會(huì)閉合氣孔以減少水分蒸發(fā)，必然導(dǎo)致光合作用下降，這可能是本研究定位到的主效QTL區(qū)間基因主要參與光合性狀負(fù)調(diào)控的重要原因。另外，供試植株在7月份已度過(guò)快速生長(zhǎng)期，此時(shí)參與光合性狀負(fù)調(diào)控的基因可能較參與光合性狀正調(diào)控的基因更多、更活躍。

本研究獲得的8個(gè)主效QTLs主要參與光合性狀和葉綠素含量負(fù)調(diào)控，結(jié)合相關(guān)研究結(jié)果[19]，認(rèn)為這些主效QTLs與‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代的相關(guān)生長(zhǎng)性狀呈不同程度負(fù)相關(guān)，在速生和高光效‘中山杉’育種工作中，可選擇沉默或敲除這些主效QTL區(qū)間基因的方式達(dá)到育種目標(biāo)。此外，調(diào)控‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代生根性狀的q11-1(標(biāo)記區(qū)間為7 574～55 445)[27]與本研究獲得的調(diào)控總?cè)~綠素含量的q11-3(標(biāo)記區(qū)間為7 685～104 488)部分重合，且完全位于本研究獲得的調(diào)控葉綠素a含量的q11-2(標(biāo)記區(qū)間為3 256～77 731)內(nèi)，說(shuō)明‘中山杉302’×墨西哥落羽杉回交子代的光合、生長(zhǎng)和生根性狀間存在密切關(guān)系。