李雁羽 劉天潤(rùn) 吳 啟 王 磊

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 安徽合肥 230036）

透明骨骼標(biāo)本是通過(guò)透明劑、染色劑、脫色劑的處理，讓動(dòng)物肌肉組織透明化，骨骼由染色劑凸顯出形狀的標(biāo)本[1-3]。染色劑中的茜素紅可特異性與硬骨中的鈣結(jié)合，讓其呈現(xiàn)紅色，而阿利新藍(lán)在合適的pH 值下可讓軟骨中硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素等主要成分呈現(xiàn)藍(lán)色。二者配合使用，可讓觀察者透過(guò)肌肉組織直觀地觀察動(dòng)物體內(nèi)硬骨和軟骨的結(jié)構(gòu)和分布[4]。

為了讓包埋劑起到更好的包埋效果，需對(duì)透明骨骼標(biāo)本進(jìn)行塑化處理，而聚乙二醇可用于簡(jiǎn)易塑化標(biāo)本的制作[5-6]。PEG-600，即分子量為600的聚乙二醇，常溫下為液態(tài)，是水溶性聚合物，利用梯度浸漬的方法可讓PEG-600 對(duì)生物標(biāo)本起到較好的塑化作用。傳統(tǒng)的包埋標(biāo)本使用的AB膠（室溫固化環(huán)氧樹(shù)脂）固化時(shí)間較長(zhǎng)，UV 膠（又稱“紫外光固化膠”）是一種必須通過(guò)紫外光照射才能固化的膠粘劑，固化速度快，透光性強(qiáng)，它作為包埋劑已應(yīng)用于植物標(biāo)本制作領(lǐng)域[7]。

本研究工作主要通過(guò)塑化技術(shù)處理透明骨骼標(biāo)本，再利用UV 膠的紫外固化特性實(shí)現(xiàn)快速包埋，改良了透明骨骼標(biāo)本的保存方法，使其便于運(yùn)輸，促進(jìn)其實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)及推廣應(yīng)用[8-9]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 出生2～4 d 的小鼠、無(wú)水乙醇、丙酮、茜素紅、阿利新藍(lán)、氫氧化鉀、甘油、PEG-600、UV 膠、長(zhǎng)方體硅膠模具（大小：50 mm×85 mm×50 mm）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1）初步處理方法。處死小鼠，剝離皮膚，在接近肢端時(shí)不要?jiǎng)冸x皮膚，避免損傷小鼠趾端和尾部的結(jié)構(gòu)，去除其內(nèi)臟，并用清水沖洗干凈。

2）試劑配制方法。A 液：茜素紅原液。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液中加入茜素紅直至飽和。

B 液：茜素紅應(yīng)用液。將A 液與體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液以體積比1∶9 的比例混合均勻，再加入等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的KOH 溶液，即配制成茜素紅應(yīng)用液。

C 液：阿利新藍(lán)軟骨染液。10 mg 阿利新藍(lán)、80 mL 體積濃度95%的乙醇溶液、20 mL 冰醋酸，混合均勻，靜置一夜后次日使用。

D 液：預(yù)透明液。質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的KOH 溶液。

E 液：透明液Ⅰ。氫氧化鉀1 g、甘油20 g，加蒸餾水至1 000 mL。

F 液：透明液Ⅱ。甘油與蒸餾水1∶1 混合。

1.3 透明骨骼標(biāo)本制作

1）脫水固定。將初步處理的材料依次放入80%、90%、100%3 個(gè)濃度梯度的乙醇中浸泡，每個(gè)濃度浸泡24 h?？筛鶕?jù)標(biāo)本大小及實(shí)際的脫水情況，增減每個(gè)濃度浸泡的時(shí)間。

2）脫脂。將脫水固定之后的標(biāo)本放入丙酮中進(jìn)行脫脂，時(shí)間為1～3 d，脫脂完成后將標(biāo)本使用清水浸泡，直至標(biāo)本沉底。

3）軟組織染色。將脫脂完成的材料在C 液中浸泡1～2 d。具體浸泡的時(shí)間，可根據(jù)標(biāo)本的染色情況靈活地進(jìn)行調(diào)整?？蓹z查腕關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)等處是否上色，以此確定是否繼續(xù)染色。

4）復(fù)水。將標(biāo)本從C 液中取出，置于無(wú)水乙醇中1～3 d。而后將標(biāo)本從無(wú)水乙醇中取出，依次浸泡于95%、75%、45%、15%的梯度濃度乙醇溶液中，在每個(gè)梯度浸泡至標(biāo)本在容器中沉底為止，最后浸泡于蒸餾水中。

5）預(yù)透明。將復(fù)水之后的材料置于D 液中進(jìn)行預(yù)透明。預(yù)透明的作用是脫色和提升后續(xù)試劑的穿透能力，預(yù)透明的時(shí)長(zhǎng)把握很重要，一般在隱約可見(jiàn)骨骼，肌肉呈果凍狀時(shí)停止預(yù)透明。

6）硬骨染色。將標(biāo)本置于B 液中浸泡，直至硬骨被染成紫紅色為止。浸泡時(shí)間一般為1 d，需根據(jù)標(biāo)本是否剝皮，預(yù)透明程度等實(shí)際情況靈活調(diào)整染色時(shí)間。

7）分色及再度透明。將標(biāo)本在E 液中浸泡1～2 d，而后入F 液中浸泡，直至標(biāo)本肌肉組織脫色，可觀察到被染色的骨骼結(jié)構(gòu)為止。

8）甘油梯度透明。將標(biāo)本依次浸入體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、80%的甘油各2 d，然后浸入純甘油浸泡，直至肌肉無(wú)色透明，骨骼結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)為止。

9）塑化。選擇PEG-600 作為塑化劑。向質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的氫氧化鉀溶液加入幾粒麝香草酚晶體，充分混合。再加入適量PEG-600，分別配制成體積濃度為15%、25%、50%、75%、100%的PEG-600 溶液，將標(biāo)本依次放入其中浸泡。15%濃度時(shí)浸泡1～2 d，后續(xù)每個(gè)梯度的浸泡時(shí)間為2～3 d，這樣即可使PEG-600完全替換其中的甘油，完成塑化。

10）包埋。向硅膠模具中傾倒UV 膠，待其沒(méi)過(guò)模具底部1 cm 左右時(shí)停止傾倒，將模具置于紫外線照射環(huán)境中。待底層的UV 膠固化之后，將塑化好的標(biāo)本放入模具，調(diào)整姿勢(shì)，再灌注UV膠，直至沒(méi)過(guò)標(biāo)本1 cm 左右。將模具置于紫外線照射環(huán)境下，待UV 膠完全固化之后，將包埋好的標(biāo)本脫模取出即可。

圖1 小鼠不同制作時(shí)期的透明骨骼塑化包埋標(biāo)本

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本整體效果 所制的小鼠標(biāo)本顯著地展示了硬骨和軟骨的分布情況（圖2），肋軟骨、關(guān)節(jié)軟骨、鼻軟骨等軟骨被染成藍(lán)色，肱骨、脊椎、肩胛骨等硬骨被染成紅色，尚未完全硬骨化的尾椎為淡紅色（圖3、圖4）。標(biāo)本被UV 膠包埋，堅(jiān)固透明，便于運(yùn)輸和觀察骨骼結(jié)構(gòu)，具有很好的觀賞價(jià)值和科學(xué)教育價(jià)值。

圖2 小鼠透明骨骼塑化包埋標(biāo)本正面圖

圖3 標(biāo)本軀干前部細(xì)節(jié)圖

圖4 標(biāo)本軀干后部細(xì)節(jié)圖

2.2 UV 膠固化效果 傳統(tǒng)包埋標(biāo)本所使用的AB 膠在室溫條件下，完全固化需要1 d 左右。本文采用的UV 膠，在紫外光照射下發(fā)生紫外固化反應(yīng)，凝固速度可控，節(jié)省成本，更適合于批量生產(chǎn)包埋標(biāo)本。在本次小鼠標(biāo)本的制作過(guò)程中使用太陽(yáng)光照射，5 min 左右即可觀察到表面固化現(xiàn)象，1 h 后即達(dá)到較好的固化效果，固化完成的包埋標(biāo)本堅(jiān)固又透明。

3 討論

制作標(biāo)本的原料盡可能選擇幼體或體型較小的個(gè)體，因?yàn)槌赡陚€(gè)體的肌肉發(fā)達(dá)，各種試劑不易穿透，不利于標(biāo)本制作。制作透明骨骼標(biāo)本時(shí)梯度濃度浸泡是一種常用技術(shù)，在脫水固定步驟中，不使用無(wú)水乙醇直接浸泡標(biāo)本的原因是該操作會(huì)使標(biāo)本快速脫水而硬化皺縮，不利于美觀和后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作[10]。

聚乙二醇在小型動(dòng)物的簡(jiǎn)易塑化方面有著廣泛地應(yīng)用。這種水溶性高分子材料制作出的塑化標(biāo)本具有防腐、防霉的特征[11-12]。

本研究不足之處是由于初次操作，制作完成的標(biāo)本中含有微小的氣泡。對(duì)此的解決方法是對(duì)標(biāo)本進(jìn)行紫外線照射之前，用真空泵除去氣泡。并且由于丙酮脫脂不充分，小鼠的肩部脂肪沒(méi)有去除干凈，影響對(duì)頸椎的觀察（圖3）。在今后的制作過(guò)程中，將不斷完善技術(shù)流程以制備更好的骨骼標(biāo)本，以適應(yīng)教學(xué)及商業(yè)化的要求。