劉志恬，董玉鵬，李永才，畢 陽，李寶軍，景春苑

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

早酥梨（Pyrus bretchneidericv.Zaosu）是以‘蘋果梨'為母本、‘身不知'為父本雜交選育而成的早熟梨品種。該品種具有良好的栽培性狀和較強的生態(tài)適應(yīng)性，在甘肅表現(xiàn)出長勢優(yōu)良、結(jié)果早、豐產(chǎn)、果實個大、品質(zhì)好等特性[1]。因其果肉細膩雪白、汁多味甜，果皮翠綠且薄，品質(zhì)佳、上市早等優(yōu)點，成為我國栽培廣泛的早熟梨品種之一[2]。早酥梨通常采收于夏季高溫時節(jié)，快速的品質(zhì)劣變及腐敗致使采后果實損失嚴重，制約了早酥梨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[3]。其中由互隔交鏈孢霉（Alternaria alternata）引起的黑斑病是早酥梨采后主要的病害之一[4]，A.alternata能在室溫或低溫環(huán)境下快速生長而使果實腐敗變質(zhì)，并在生長過程中產(chǎn)生多種有毒代謝產(chǎn)物，對人類和動物健康造成潛在安全風(fēng)險[5]。目前主要采用化學(xué)殺菌劑控制梨果實采后病害，但長期使用化學(xué)殺菌劑會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性和環(huán)境污染，并危害人體健康[6]。因此，尋求和開發(fā)更加安全、高效的天然防腐劑以防治A.alternata引起的早酥梨黑斑病迫在眉睫[7]。

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）是25～35 個賴氨酸殘基通過α-羥基和ε-氨基之間形成酰胺鍵構(gòu)成的同型均聚多肽[8]，由小白鏈霉菌經(jīng)發(fā)酵作用產(chǎn)生，在人體內(nèi)可分解成必需氨基酸——賴氨酸[9]，其分子質(zhì)量約為5 kDa[10]。因具有效價高、安全無毒、水溶性好、作用pH值范圍廣、熱穩(wěn)定性強、抑菌譜廣等特點，ε-PL已被廣泛用作食品防腐劑[11]。研究表明相對分子質(zhì)量在3 600～4 300之間的ε-PL具有高抑菌活性[12]。李誠等[13]的研究發(fā)現(xiàn)ε-PL對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黃曲霉菌等的生長均有顯著的抑制效果，且ε-PL的抑菌活性隨其濃度的增加而增強。肖媛等[14]發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為1 600、3 200、6 400 mg/L的ε-PL處理可顯著降低柑橘果實酸腐病的發(fā)病率和病斑直徑。Li Hua等[15]研究發(fā)現(xiàn)150 mg/L的ε-PL能顯著抑制棗灰霉病離體菌絲生長、孢子萌發(fā)和芽管伸長，質(zhì)量濃度達到4 000 mg/L時能夠完全抑制棗灰霉病的發(fā)生。吳倩等[16]研究發(fā)現(xiàn)20 mg/Lε-PL處理對厚皮甜瓜采后致腐病菌爪甲曲霉有一定的抑制作用。Liu Kewei等[17]研究發(fā)現(xiàn)ε-PL處理會刺激指狀青霉活性氧的產(chǎn)生，加速細胞質(zhì)膜過氧化，進而導(dǎo)致丙二醛的積累。Wei Meilin等[18]研究發(fā)現(xiàn)ε-PL處理導(dǎo)致粉紅單端孢孢子表面粗糙收縮，嚴重破壞細胞壁和細胞質(zhì)膜完整性。同時孟岳成等[19]研究發(fā)現(xiàn)ε-PL能使黃曲霉細胞膜通透性增加，線粒體嵴模糊，細胞核降解，蛋白質(zhì)及核酸泄露，細胞空腔化，細胞生理代謝紊亂。目前有關(guān)ε-PL對梨果實黑斑病菌A.alternata的抑菌作用及其機理鮮見報道。因此本實驗以梨果實黑斑病菌A.alternata為研究對象，研究天然防腐劑ε-PL對A.alternata生長的抑制作用和對黑斑病的控制作用，并進一步探討其可能的抑菌機理，以期為將ε-PL作為天然防腐殺菌劑在果蔬采后病害控制應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

早酥梨采摘于甘肅省景泰縣條山農(nóng)場，挑選大小一致、無機械損傷、無病蟲害的果實，紙箱包裝后運達實驗室，于低溫條件（（3±2）℃）、相對濕度85%的冷庫中貯藏待用。

A.alternata由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院采后實驗室分離于貯藏過程中自然發(fā)病的梨果實，純化、鑒定后于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基保存待用。

ε-PL 鄭州拜納佛生物工程股份有限公司；線粒體膜電位熒光探針（JC-1） 北京索萊寶科技有限公司；毒素標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；氯化鈉、硫酸鎂和乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；CX21FSIC光學(xué)顯微鏡、DDS-370型微型電導(dǎo)儀日本奧林巴斯工業(yè)有限公司；UV2450型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；H-1850R型臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機有限公司；AWL-1002-M實驗室超純水儀 美國艾科浦國際有限公司；U-LH100-3型熒光顯微鏡 上海永科光學(xué)儀器公司；1290-6040型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1A.alternata孢子懸浮液的配制

參照高春麗等[20]的方法并略作修改，在無菌操作條件下向培養(yǎng)5 d的A.alternata培養(yǎng)皿中倒入少量無菌水，并加入少量質(zhì)量分數(shù)0.01% Tween-80，用滅菌的涂布器輕刮，將所得溶液通過4 層紗布過濾到滅菌三角瓶中，用無菌水稀釋，在混合器上振蕩15 s，用血球計數(shù)板計數(shù)，配制成1×106個/mL孢子懸浮液。

1.3.2ε-PL處理后A.alternata生長情況分析

1.3.2 .1ε-PL處理后A.alternata菌落直徑的測定

參照刁春英等[21]的方法，并作修改。稱取5、10、15、20 mg的ε-PL分別溶解于100 mL滅過菌的PDA培養(yǎng)基中，混合均勻，倒入直徑為7 cm的培養(yǎng)皿中。待培養(yǎng)基凝固后，分別接種28 ℃培養(yǎng)7 d直徑為8 mm的A.alternata菌餅，然后于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，每隔1 d測量其菌落直徑，以不添加ε-PL的PDA培養(yǎng)基作為對照。每個處理3 個平行，重復(fù)3 次。

1.3.2 .2ε-PL處理后A.alternata生物量的測定

按1.3.2.1節(jié)所述操作，待培養(yǎng)基凝固后在其表面鋪上無菌玻璃紙，分別接種28 ℃培養(yǎng)7 d的直徑為8 mm的A.alternata菌餅，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后取下玻璃紙，稱質(zhì)量并收集菌絲體用于后續(xù)實驗，以培養(yǎng)前后菌餅連同玻璃紙的質(zhì)量差表征生物量。以不添加ε-PL的PDA培養(yǎng)基作為對照，每個處理3 個平行，重復(fù)3 次。

1.3.3ε-PL處理后早酥梨黑斑病病斑直徑的測定

參照張彥東等[22]的方法并作修改。選擇大小均勻、無病無損傷的早酥梨果實，浸入質(zhì)量分數(shù)2%的NaClO溶液消毒2 min，之后用蒸餾水沖洗，晾干，再用體積分數(shù)75%的乙醇溶液對果實表皮進行擦拭消毒，然后用直徑3 mm的打孔鐵釘均勻地在果實赤道部位打3 個孔，每孔中接種1.3.1節(jié)所述濃度為1×106個/mL的A.alternata孢子懸浮液20 μL，在接種2 h后向每個孔中各接入10 μL的質(zhì)量濃度分別為400、800、1 200、1 600 mg/L的ε-PL溶液。以無菌水作為對照。在室溫下晾干，用規(guī)格為30 cm×45 cm、厚0.02 mm的市售保鮮袋包裝，室溫條件下，以十字交叉法每隔2 d測一次果實的病斑直徑，每個處理用果9 個，每個處理分別重復(fù)3 次。

1.3.4ε-PL處理后A.alternata孢子細胞膜的完整性測定

1.3.4 .1 PI染色檢測ε-PL處理后A.alternata孢子細胞膜完整性

參照沈科萍[23]的方法，并作修改。準(zhǔn)確吸取0.8 mL 1.3.1節(jié)所述濃度為1×106個/mLA.alternata孢子懸浮液于1.5 mL無菌離心管中，在5 000×g條件下離心5 min，棄上清液，在孢子沉淀中加入0.8 mL質(zhì)量濃度分別為100、200 mg/L的ε-PL溶液，28 ℃溫育2 h，5 000×g離心5 min，棄上清液，立即向孢子沉淀中加入1 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.0），室溫下避光靜置30 min，離心，棄上清液，加入PBS（pH 7.0）1 mL進行洗滌，離心，棄上清液，最后加入1 mL PBS（pH 7.0），用U-LH100-3型熒光顯微鏡（激發(fā)波長為620 nm）進行觀察拍照并用計數(shù)器統(tǒng)計染色率。以無菌水處理作為對照，實驗重復(fù)3 次。

1.3.4 .2ε-PL處理后A.alternata菌絲體電導(dǎo)率的測定

菌絲體電導(dǎo)率測定參照Meng Xianghong等[24]的方法，并作修改。在無菌條件下，將滅過菌的PDA培養(yǎng)基均勻倒入直徑60 mm培養(yǎng)皿中，待凝固后將無菌的玻璃紙小心鋪在培養(yǎng)基表面，接種培養(yǎng)7 d直徑為8 mm的A.alternata菌餅，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后取下玻璃紙并收集上面的菌絲體。準(zhǔn)確稱取0.25 g菌絲于15 mL無菌離心管中，之后分別加入10 mL質(zhì)量濃度為100、200 mg/L的ε-PL溶液，28 ℃溫育，在0、30、60、90、120、150 min和180 min時用DDS-370型微型電導(dǎo)儀連續(xù)測定懸浮液的電導(dǎo)率。

1.3.5ε-PL處理后A.alternata線粒體形態(tài)的觀察

線粒體形態(tài)觀察參照Shi Xuequn等[25]的方法，并作修改。用二甲基亞砜溶解線粒體膜電位熒光探針JC-1，配成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的溶液，置于－20 ℃避光保存。取1.3.1節(jié)所述濃度為1×106個/mL的A.alternata孢子懸浮液1 mL于1.5 mL無菌離心管，在5 000×g條件下離心10 min，棄上清液，在孢子沉淀中加入1 mL質(zhì)量濃度分別為100、200 mg/L的ε-PL溶液，28 ℃溫育2、4 h后，5 000×g離心10 min，棄上清液，立即向孢子沉淀中加入1 mL PBS（pH 7.0）、0.1 μL 10 μg/mL JC-1，室溫下避光靜置30 min，5 000×g離心5 min，棄上清液，加入PBS（pH 7.0）1 mL進行洗滌，5 000×g離心5 min，棄上清液，最后加入1 mL PBS（pH 7.0），立即置于熒光顯微鏡下觀察拍照。每處理設(shè)3 組平行，實驗重復(fù)2 次。以無菌水作為對照。

1.3.6ε-PL處理后A.alternata生成黑色素的分析

1.3.6 .1 黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別配制質(zhì)量濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 mg/L的黑色素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在400 nm波長處測定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 .2 黑色素提取

菌絲體收集如1.3.2.2節(jié)所述，在PDA培養(yǎng)基無菌玻璃紙上接種培養(yǎng)4 d的A.alternata菌絲體，準(zhǔn)確稱取0.25 g置于研缽中，加入液氮，研磨，置于裝有30 mL 1 mol/L NaOH溶液的錐形瓶中，沸水浴提取5 h，每30 min左右振蕩一次。－20 ℃冷卻20 min，雙層濾紙過濾，濾液用7 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)至pH 2.0，10 000×g離心15 min，得到沉淀即為黑色素粗提物。

1.3.6 .3 黑色素的純化與含量測定

向上述黑色素粗提物中加入5 mL 7 mol/L HCl溶液，充分混勻，沸水浴2 h，10 000×g離心15 min，沉淀用1 mol/L NaOH溶液溶解，再用7 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至2.0，10 000×g離心15 min，重復(fù)3 次。沉淀用1 mol/L NaOH溶液定容至1 mL。以1 mol/L NaOH溶液為空白，用紫外-可見分光光度計于400 nm波長處測定溶液的吸光度。A.alternata菌絲體中黑色素含量按下式計算。

式中：x為測定的吸光度；y為黑色素含量/（mg/g）。

1.3.7ε-PL處理后A.alternata毒素合成的分析

1.3.7 .1A.alternata毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備：用無水甲醇準(zhǔn)確定容1 mg標(biāo)準(zhǔn)品至1 mL，配成1 mg/mL質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，密封冷凍儲存于－20 ℃冰箱中。標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：分別配制10、20、50、100、200、1 000 μg/mL的鏈格孢酚單甲醚（alternariol monomethyl ether，AME）、鏈格孢酚（alternariol，AOH）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，5、50、100、200、500、1 000 μg/mL的交鏈格烯（altenuene，ALT）和騰毒素（tentoxin，Ten）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封保存于－20 ℃冰箱中。

1.3.7.2 真菌毒素的提取與測定

真菌毒素的提取方法參照董玉鵬等[26]的方法。準(zhǔn)確稱取1.3.2.2節(jié)28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d的A.alternata菌絲體0.5 g（精確至0.01 g），冰浴研磨均勻，置于10 mL無菌離心管中，加入2.5 mL含體積分數(shù)0.3%甲酸的乙腈-水（80∶20，V/V）提取液，漩渦混勻，150 r/min常溫提取30 min，再加入0.25 g無水MgSO4和0.04 g NaCl，劇烈振蕩1 min后，以10 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，準(zhǔn)確定容至1.2 mL，用于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

色譜條件：色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為35 ℃；進樣量為5 μL；流動相A為去離子水，流動相B為無水甲醇；梯度洗脫條件為70% A保持1 min，隨后2 min內(nèi)降至50%，隨后1 min內(nèi)繼續(xù)降至10%，保持2 min，之后在0.1 min內(nèi)升至90%，保持2 min；流速0.3 mL/min；總運行時間7.1 min。

質(zhì)譜條件：離子源模式為正離子模式；質(zhì)譜掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測；鞘氣溫度為350 ℃；霧化器壓力為35 psi；鞘氣流速為11.0 L/min；毛細管電壓為4 000 V，其他參數(shù)通過儀器調(diào)至最優(yōu)。

4 種鏈格孢霉毒素的監(jiān)測離子、錐孔電壓和碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 4 種真菌毒素的串聯(lián)質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 Optimized tandem mass parameters for 4 mycotoxins

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013軟件統(tǒng)計計算，并用Origin 2017軟件作圖，用SPSS 25.0軟件對得到的數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Duncan多重差異顯著分析進行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ε-PL處理對A.alternata生長的影響

2.1.1ε-PL處理對A.alternata菌落生長的影響

由圖1可知，ε-PL處理顯著抑制了A.alternata菌絲生長（P＜0.05），且其抑制效果隨處理質(zhì)量濃度的增加而增強。由圖1A可知，各處理組邊緣2～5 mm的白色菌絲擴展未受到明顯的抑制，并且隨著ε-PL質(zhì)量濃度的增加，菌落整體顏色逐漸加深。猜測可能是ε-PL處理促進了A.alternata黑色素的合成。50、100、150、200 mg/Lε-PL處理7 d后菌落直徑分別為對照組的62.72%、43.24%、32.43%和29.54%。

圖1 ε-PL處理對A.alternata菌絲形態(tài)（A）和菌落直徑（B）的影響Fig.1 Effect of ε-PL treatment on mycelial morphology (A) and colony diameter (B) of A.alternata

2.1.2ε-PL對A.alternata生物量的影響

ε-PL處理顯著降低了A.alternata的生物量（P＜0.05）（圖2），其抑制作用存在顯著的濃度依賴性，培養(yǎng)4 d后，50、100、150 mg/L和200 mg/Lε-PL處理的A.alternata生物量分別較對照降低了33.3%、47.8%、55.6%和72.2%。

圖2 ε-PL處理對A.alternata生物量的影響Fig.2 Effect of ε-PL treatment on biomass of A.alternata

2.2 ε-PL處理對早酥梨黑斑病的控制效果

由圖3可知，ε-PL對梨果實黑斑病的擴展有明顯的抑制效果。但提高ε-PL處理質(zhì)量濃度，其控制效果并沒有明顯變化（圖3A），貯藏9 d時質(zhì)量濃度高于800 mg/L的ε-PL處理對早酥梨黑斑病擴展的控制并沒有顯著的增效作用，400 mg/L的ε-PL處理已能達到較佳控制效果。貯藏12 d時，400 mg/Lε-PL處理組果實病斑直徑僅為對照組的59.28%（圖3B）。

圖3 ε-PL處理對早酥梨黑斑病擴展（A）及病斑直徑（B）的影響Fig.3 Effect of ε-PL treatment on the development of black spot disease (A) and lesion diameter (B) of pears

2.3 ε-PL對A.alternata孢子細胞膜完整性的影響

2.3.1 PI染色檢測ε-PL對A.alternata孢子細胞膜完整性的影響

PI染液能夠穿透破損細胞膜，對細胞核染色，其熒光強度越高表明細胞膜受損越嚴重。由圖4A可知，對照組A.alternata孢子只有個別細胞膜可以觀察到較弱的紅色熒光，而ε-PL處理后A.alternata熒光強度隨處理質(zhì)量濃度的增加顯著增強，200 mg/L的ε-PL處理相比對照組染色率增加了59%（圖4B），表明ε-PL處理嚴重地破壞A.alternata孢子的細胞膜。

圖4 ε-PL處理后PI染色檢測A.alternata孢子細胞膜完整性（A）和PI染色率（B）Fig.4 Examination of cell membrane integrity after ε-PL treatment by propidium iodide (PI) staining (A) and PI staining percentage (B)

2.3.2ε-PL對A.alternata菌絲體電導(dǎo)率的影響

由圖5可知，ε-PL處理的A.alternata菌絲體電導(dǎo)率顯著高于對照組（P＜0.05），且隨處理時間延長和處理劑量的增加而逐漸增大。100、200 mg/Lε-PL處理的A.alternata菌絲體電導(dǎo)率在處理后的180 min時分別為對照組的1.25、1.39 倍。

圖5 ε-PL處理對A.alternata菌絲體電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effect of ε-PL treatment on conductivity of A.alternata

2.4 ε-PL對A.alternata線粒體膜電位的影響

由圖6可知，對照組中線粒體分布均勻且形態(tài)完整、熒光強度較強。隨著處理時間延長，線粒體形態(tài)逐漸模糊，密度降低，熒光強度減弱。而ε-PL處理組中線粒體形態(tài)破壞嚴重，處理質(zhì)量濃度越高，熒光強度越弱，表明線粒體膜電位下降越快，菌體凋亡速度越快。

圖6 ε-PL處理對A.alternata線粒體形態(tài)的影響Fig.6 Effect of ε-PL treatment on mitochondrial morphology of A.alternata

2.5 ε-PL對A.alternata黑色素產(chǎn)生的影響

由圖7可知，ε-PL處理顯著刺激了A.alternata黑色素的產(chǎn)生，且黑色素含量與處理的ε-PL質(zhì)量濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，100 mg/L和200 mg/Lε-PL處理組A.alternata黑色素含量分別為對照組的2.63 倍和3.52 倍。

圖7 ε-PL處理對A.alternata產(chǎn)生黑色素的影響Fig.7 Effect of ε-PL treatment on melanin production by A.alternata

2.6 ε-PL對A.alternata毒素合成的影響

對離體條件下A.alternata生長過程中常見的4 種毒素進行分析比較。由圖8A可知，ε-PL處理顯著抑制了A.alternata菌絲體中Ten的產(chǎn)生（P＜0.05）。200 mg/L的ε-PL處理后Ten質(zhì)量濃度為對照組的66.11%。由圖8B～D可知，ε-PL對A.alternata產(chǎn)生ALT、AOH、AME 3 種毒素具有促進作用。其中，200 mg/L的ε-PL處理后A.alternata中ALT、AOH、AME質(zhì)量濃度相比對照組分別增加了101.25%、852.96%和67.28%。

圖8 ε-PL處理對A.alternata毒素產(chǎn)生的影響Fig.8 Effect of ε-PL treatment on toxin production by A.alternata

3 討 論

研究表明，ε-PL對酵母菌屬中的尖銳假絲酵母、紅發(fā)夫酵母，革蘭氏陽性菌中的凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，革蘭氏陰性菌中的產(chǎn)氣節(jié)桿菌、大腸桿菌等引起食物腐敗的多數(shù)微生物均有一定的抑制作用[27]。本研究結(jié)果表明，ε-PL處理能顯著抑制A.alternata菌絲生長（圖1），且能夠有效控制梨果實黑斑病的擴展（圖3）。這一結(jié)果與劉鶴[28]在煙草赤星病菌的研究中得到的結(jié)果相似，他發(fā)現(xiàn)ε-PL可引起病原真菌芽管皺縮畸形，降低分生孢子萌發(fā)率。質(zhì)量濃度高于10 μg/mL的ε-PL對煙草離體葉的病斑擴展有明顯抑制作用。同時他還發(fā)現(xiàn)ε-PL對黃瓜褐斑病控制具有明顯的濃度效應(yīng)，而對水稻惡苗病菌抑制效果并不明顯。此外，劉洪霞[11]發(fā)現(xiàn)62.5～3.906 μg/mL的ε-PL對漢遜酵母、黑曲霉和擴展青霉均有明顯的抑制作用，而ε-PL抑制曲霉菌、青霉菌和鐮刀菌等病原真菌的最低抑菌質(zhì)量濃度普遍偏高，大約為250 μg/mL。付萍[29]發(fā)現(xiàn)ε-PL對Escherichia coli的抑菌能力存在濃度依賴性?？梢?，ε-PL對某些植物常見真菌病害具有一定的抑制作用，但不同病原菌及寄主對ε-PL的敏感性存在差異。

細胞膜是常見的抗真菌劑的重要作用位點[30]，多數(shù)抑菌活性物質(zhì)通過影響細胞膜完整性而發(fā)揮作用。周祺等[31]發(fā)現(xiàn)450 mg/mL的ε-PL能破壞腸球菌細胞膜的完整性。藍蔚青等[32]研究發(fā)現(xiàn)1.0 mg/mL的ε-PL能夠破壞腐生葡萄球菌細胞膜結(jié)構(gòu)，改變膜通透性，使電導(dǎo)率增加。Shima等[33]研究發(fā)現(xiàn)陽離子多價態(tài)ε-PL結(jié)合細胞膜上陰離子分子后，致使細胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致能量供應(yīng)中斷，影響其正常的生理活動，最終導(dǎo)致細胞死亡。本實驗發(fā)現(xiàn)200 mg/L的ε-PL處理嚴重破壞了A.alternata細胞膜（圖4）、線粒體（圖6）的完整性，改變膜通透性，增大菌絲體電導(dǎo)率（圖5）。寧亞維等[34]發(fā)現(xiàn)ε-PL可以通過增加金黃色葡萄球菌細胞膜滲透性，改變細胞膜跨膜質(zhì)子梯度，進入胞內(nèi)降解或抑制蛋白質(zhì)合成，從而發(fā)揮抑菌作用。Ye Ruosong等[35]發(fā)現(xiàn)ε-PL可以通過活性氧氧化應(yīng)激以及基因調(diào)控等途徑發(fā)揮抑菌作用。

微生物在生長過程中會產(chǎn)生生物堿、類萜、酚類、抗菌物質(zhì)、色素等一系列次級代謝產(chǎn)物[36]。次級代謝產(chǎn)物雖然不是維持生命活動的必需物質(zhì)，但其具有重要的生物學(xué)功能，有利于微生物在激烈的競爭環(huán)境中生存，并且可能會通過產(chǎn)生一些有毒的次級代謝產(chǎn)物來保證自身的安全[37]。本實驗對A.alternata生長過程中產(chǎn)生的黑色素含量進行測定，發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度的ε-PL處理均能顯著促進A.alternata產(chǎn)生黑色素，與2.1.1節(jié)猜測一致。黑色素能提高微生物抗重金屬毒害、抗紫外線損害的能力[38]，還能結(jié)合和隔離非特異性肽和化合物[37]，產(chǎn)生物理屏障，保護真菌孢子，增強其抗氧化能力，從而提高其生存能力[39]。黑色素是目前唯一確定的可以保護生物體免受輻射傷害的天然聚合物，可以有效清除羥自由基、活性氧自由基[40]。對AOH、AME、ALT、Ten 4 種毒素質(zhì)量濃度進行測定，發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度的ε-PL處理對AOH、AME、ALT 3 種毒素的生成起促進作用，而對Ten起抑制作用。作為非寄主選擇性毒素，AOH、AME、ALT屬于苯并吡喃酮衍生物[41-42]，該類化合物的形成途徑是1 個乙酰輔酶A和6 個丙二酰輔酶A通過頭尾醛醇縮合反應(yīng)，首先形成芳香環(huán)即AOH，AOH與S-腺苷甲氨硫酸反應(yīng)生成AME，AME在一定條件下發(fā)生蒽醌重排，降解產(chǎn)物就是其他二苯并吡喃酮衍生物[43]。而Ten具有環(huán)形四肽結(jié)構(gòu)，其合成機制仍不明確[44]，Solhaug等[45]研究發(fā)現(xiàn)AOH能造成細胞周期停滯和細胞凋亡；閆璐等[46]研究發(fā)現(xiàn)AME可作用于細胞線粒體，誘導(dǎo)細胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)AME導(dǎo)致細胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔打開，使線粒體內(nèi)膜跨膜電位下降[47]。Ten能抑制光合磷酸化[48]，其中AOH和AME之間存在協(xié)同作用，能夠增加DNA斷裂的速率[44]。真菌產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物是為了適應(yīng)不同的環(huán)境[49]，提高自身的生存能力。真菌次級代謝產(chǎn)物也易受外界環(huán)境的影響，如溫度、水分含量、pH值、光照等[50]。Sonja等[51]研究發(fā)現(xiàn)A.alternata產(chǎn)生的AOH和鏈格孢菌毒素易受白光刺激。Brzonkalik等[52]研究發(fā)現(xiàn)A.alternata的產(chǎn)毒性能受氮源的調(diào)控，且有機氮源比無機氮源更有利于AOH和AME的產(chǎn)生。寧華[53]研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中高濃度的優(yōu)良氮源（蛋白胨）對發(fā)酵產(chǎn)生黑色素十分重要。其次，真菌次級代謝產(chǎn)物的合成還受到環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶通路的調(diào)控[54]。同時，不同非寄主選擇性毒素的合成還因菌株、培養(yǎng)基成分、光照條件等而存在差異，另外真菌生長過程中大部分毒素是分泌到周圍的環(huán)境中，姜冬梅等[55]研究發(fā)現(xiàn)番茄交鏈孢毒素能向病斑外延組織擴散，蔣黎艷[56]發(fā)現(xiàn)柑橘感染產(chǎn)毒鏈格孢霉菌后產(chǎn)生的毒素會從病斑部位擴散到周圍健康部位進而積累，因此本實驗僅通過測定菌絲中的毒素并不能完全說明ε-PL處理改變了毒素的合成能力，尚需在對毒素含量進行系統(tǒng)準(zhǔn)確測定的基礎(chǔ)上進一步闡明ε-PL處理對毒素合成的調(diào)控機制。

綜上，ε-PL能夠顯著抑制A.alternata菌絲生長，并有效控制梨果實黑斑病的擴展，且其作用效果存在濃度依賴性。同時ε-PL處理嚴重破壞了A.alternata細胞膜完整性，增加了細胞膜透性，并破壞線粒體的完整性。ε-PL處理能顯著促進A.alternata黑色素生成。ε-PL處理對A.alternata毒素產(chǎn)生的作用存在差異，其促進了AME、AOH、ALT的合成，但對Ten的合成具有抑制作用。