石澤棟，蔣雅萍，孫英杰，李富軍，閔德棟，張新華，李曉安

（山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049）

腐爛是導(dǎo)致果蔬采后損失的重要因素。生產(chǎn)上通常采用化學(xué)殺菌劑來(lái)殺滅腐爛致病菌，以降低和減少果蔬腐爛。然而，傳統(tǒng)的果蔬化學(xué)殺菌劑具有農(nóng)藥殘留，過(guò)量使用時(shí)會(huì)給人們身體健康和生態(tài)環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重的威脅。隨著人們對(duì)身體健康和環(huán)境安全的日益關(guān)注，化學(xué)殺菌劑在越來(lái)越多的國(guó)家中受到限制[1]。因此，開(kāi)發(fā)綠色、環(huán)保、低毒甚至無(wú)毒的非化學(xué)殺菌劑，以延長(zhǎng)水果和蔬菜的貯藏期，是果蔬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需求[2]。植物精油具有廣譜殺菌、生物降解、安全無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，具備作為綠色果蔬殺菌劑的特性，在果蔬中進(jìn)一步應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)和潛力明顯[3]。

牛至是唇形科牛至屬植物，具有清熱、化濕、祛暑、解表、理氣、抑菌殺菌的功效，在世界范圍內(nèi)被用作醫(yī)藥和保健品的原料。牛至精油主要是從牛至植物的根、莖、葉中提取純化得到的黃紅色或棕紅色精油，有效成分主要是香芹酚和百里酚[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，牛至精油不僅對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌等有很好的抑制作用，而且對(duì)霉菌也能起到很強(qiáng)的抑制作用[6]。此外，牛至精油還具有很強(qiáng)的抗氧化能力，將牛至精油應(yīng)用到果蔬的殺菌保鮮中，有望起到良好的抑菌效果[7-8]。

目前，常見(jiàn)的植物精油處理果蔬的方式主要有涂抹[9]、噴灑[10]和熏蒸[11]。這些技術(shù)具有使用效果好、見(jiàn)效快的優(yōu)點(diǎn)。但多數(shù)植物精油具有特殊的氣味，同時(shí)，因直接使用時(shí)揮發(fā)較快，殺菌效果不持久。微膠囊技術(shù)可以將液態(tài)的植物精油固態(tài)化，既能降低環(huán)境因素對(duì)芯材的影響，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，還能將芯材緩慢釋放，延長(zhǎng)牛至精油的作用時(shí)間，起到持續(xù)殺菌的效果[12-13]。這些結(jié)果都為植物精油微膠囊化在果蔬貯藏保鮮和殺菌中的應(yīng)用提供了新的方法和思路[14]。

本實(shí)驗(yàn)以牛至精油為芯材，以明膠、阿拉伯膠為壁材，采用復(fù)凝聚法，通過(guò)工藝優(yōu)化制備了牛至精油微膠囊，并對(duì)其理化特征和緩釋性能進(jìn)行了表征，最后評(píng)估了牛至精油微膠囊在杏保鮮過(guò)程中的抑菌效果，以期為植物精油在果蔬抑菌保鮮中的應(yīng)用，以及開(kāi)發(fā)綠色環(huán)保的植物精油微膠囊保鮮殺菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏（Armeniaca vulgarisLam.）（品種為‘鄒平水杏'，采收時(shí)可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥12%，硬度平均值1.4 kg/cm2，果實(shí)表面積超過(guò)80%開(kāi)始轉(zhuǎn)黃）采自山東省淄博市張店區(qū)。

明膠、阿拉伯膠（化學(xué)純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛至精油（純度98%） 上海源葉生物科技有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（食品級(jí)，100 U/g）江蘇一鳴生物股份有限公司；冰乙酸（分析純） 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氫氧化鈉（分析純） 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水硫酸鈉（分析純） 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2102PCS紫外分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；MULtiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技（上海）有限公司；SG-540 4C數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 上海碩光電子科技有限公司；FJ200-S數(shù)顯高速分散機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；PB-10 pH計(jì) 上海摩速科學(xué)器材有限公司；FD-1A-80冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；THZ-98AB恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；MS2000激光粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；Sirion200掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） FEI（美國(guó)）有限公司；570傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國(guó)熱電尼高力儀器有限公司；STA-449F3熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）儀 德國(guó)耐馳公司；Q2000差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國(guó)TA公司。

1.3 方法

1.3.1 牛至精油最大吸收波長(zhǎng)確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用無(wú)水乙醇將牛至精油稀釋至一定濃度，在200～1 000 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，以無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，測(cè)定牛至精油的最大吸收波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛至精油在277 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，該波長(zhǎng)可用于測(cè)定微膠囊的包埋率。

用無(wú)水乙醇將牛至精油分別稀釋至不同濃度梯度（0.2、0.4、0.6、1.0、1.2 μL/mL），在牛至精油最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其不同濃度時(shí)的吸光度，以無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.426 1x－0.000 9，R2＝0.999 5。

1.3.2 牛至精油微膠囊的制備及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2 .1 牛至精油微膠囊的制備流程

采用復(fù)合凝聚法制備牛至精油微膠囊。將明膠和阿拉伯膠分別溶解，然后混合均勻，在混合溶液中加入適量的牛至精油，1 000 r/min離心3 min，用體積分?jǐn)?shù)10%的冰乙酸溶液調(diào)pH值至4.0，繼續(xù)攪拌反應(yīng)30 min后取出，冰水浴降溫至10 ℃左右，用10 g/100 mL的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至6.0，設(shè)置反應(yīng)溫度為50 ℃，加入一定量的固化劑——谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，繼續(xù)攪拌固化3 h，靜置抽濾，得到濕囊產(chǎn)物。將微膠囊濕囊平鋪在培養(yǎng)皿中，在冰箱中預(yù)冷24 h，然后冷凍干燥24 h，得到固態(tài)微膠囊。

1.3.2 .2 單因素及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以牛至精油為芯材，以明膠、阿拉伯膠為壁材，壁材質(zhì)量比（明膠、阿拉伯膠質(zhì)量比）分別為1∶2、1∶1、3∶2、4∶2、5∶2，芯材與壁材質(zhì)量比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，反應(yīng)溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，反應(yīng)時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min，固化時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，固化劑與明膠質(zhì)量比為1∶4，測(cè)定牛至精油微膠囊包埋率的大小。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取壁材質(zhì)量比A、芯材與壁材質(zhì)量比B、反應(yīng)溫度C、反應(yīng)時(shí)間D4 個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化牛至精油微膠囊的制備工藝參數(shù)，因素水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for orthogonal array design

1.3.3 牛至精油微膠囊的理化特性測(cè)定

1.3.3 .1 包埋率和載油率測(cè)定

微膠囊的包埋率定義為微膠囊中的芯材與原始乳液中的芯材質(zhì)量的比值。微膠囊的載油率定義為微膠囊中芯材與壁材質(zhì)量的比值。按照公式（1）、（2）分別計(jì)算包埋率和載油率。

式中：V1為微膠囊總油的體積/mL；V2為微膠囊表面油體積/mL；m為微膠囊粉末的質(zhì)量/g；ρ為牛至精油的密度/（g/mL）。

微膠囊總油含量的測(cè)定：稱取0.1 g凍干的牛至精油微膠囊粉末，用10 mL無(wú)水乙醇充分浸泡，用超聲細(xì)胞破碎儀在20 ℃和功率為200 W條件下對(duì)混合物進(jìn)行超聲處理10 min，然后靜置2 h，過(guò)濾，將濾液補(bǔ)足至20 mL，并在277 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，根據(jù)1.3.1節(jié)中標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算微膠囊總油含量。

微膠囊表面油含量的測(cè)定：稱取0.1 g凍干的牛至精油微膠囊粉末，用10 mL無(wú)水乙醇快速洗滌，然后過(guò)濾得到濾液，最后將濾液補(bǔ)足至20 mL，并在277 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。根據(jù)1.3.1節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算表面油含量。

1.3.3 .2 粒徑測(cè)定

參照Bae等[15]的方法，以蒸餾水為分散劑，使用激光粒度儀測(cè)定微膠囊的粒徑，儀器設(shè)定分散劑折射率1.33、樣品折射率1.59、樣品吸收率0%、分析模型為通用型。

1.3.3 .3 傅里葉變換紅外光譜分析

參照Z(yǔ)hang Dongliang等[16]的方法，采用FTIR儀對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。取適量的樣品，加入溴化鉀粉末進(jìn)行充分研磨，然后用壓片機(jī)壓成透明片狀，置于FTIR儀中，在波長(zhǎng)500～4 000 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，分辨率為0.09 cm－1。

1.3.3 .4 掃描電子顯微鏡觀察

參照Tu Xiaofang等[17]的方法，在樣品臺(tái)上貼一層導(dǎo)電膠帶，將凍干后的微膠囊粉末均勻地撒在上面，然后吹走過(guò)多的粉末，噴金處理，用SEM觀察和拍照。

1.3.3 .5 熱重分析

參照Martelli-Tosi等[18]的方法，采用TGA儀測(cè)定樣品的熱釋放曲線。設(shè)置參數(shù)：初始溫度25 ℃、終止溫度500 ℃、升溫速率20 ℃/min、載氣為氮?dú)?、流?0 mL/min。

1.3.3 .6 差示掃描量熱分析

參照Arfat等[19]的方法，使用DSC儀測(cè)定樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（glass transition temperature，Tg）。將樣品加到DSC樣品盒中，以空白盒作為參考，設(shè)置初始溫度0 ℃、終止溫度100 ℃、升溫速率10 ℃/min。

1.3.4 牛至精油微膠囊釋放性能研究

分別在光照（自然光）或避光（25 ℃、有氧）、4 ℃或25 ℃（避光、有氧）以及有氧或無(wú)氧（25 ℃、避光）條件下，將相同質(zhì)量的牛至精油微膠囊貯藏30 d，每5 d測(cè)定一次牛至精油的釋放率，每組測(cè)定重復(fù)3 次。牛至精油的釋放率按公式（3）計(jì)算。

式中：V1為初始微膠囊牛至精油體積/mL；Vt為第t天微膠囊牛至精油體積/mL。

1.3.5 牛至精油微膠囊在杏貯藏保鮮中的抑菌效果研究

1.3.5 .1 杏果實(shí)的處理

選擇大小、顏色均一、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的杏果實(shí)，隨機(jī)分為3 個(gè)處理組和1 個(gè)對(duì)照組，每組一共360 個(gè)果實(shí)（平均放入6 個(gè)塑料桶，并編號(hào)1～6）。對(duì)于3 個(gè)處理組，分別加入2%（以果實(shí)質(zhì)量計(jì)，下同）、4%、8%的凍干牛至精油微膠囊粉末（將凍干的牛至精油微膠囊粉末放入無(wú)紡布做成的透氣小布袋中，置于杏果實(shí)底部），對(duì)照組加入不含牛至精油的空殼微膠囊。最后，將所有塑料桶口用塑料薄膜（每平方厘米內(nèi)預(yù)先打一個(gè)直徑為0.1 mm的孔）密封，然后室溫下放置。其中，每組編號(hào)1～3的用于定期取樣測(cè)定菌落總數(shù)和相關(guān)酶的活力；編號(hào)4～6的用于計(jì)算果實(shí)腐爛率。

1.3.5 .2 菌落總數(shù)和霉菌總數(shù)的測(cè)定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》，采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落總數(shù)[20]；參照GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》，采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算霉菌總數(shù)[21]。

1.3.5 .3 杏果實(shí)腐爛率的測(cè)定

參照Min Dedong等[22]的方法，每隔5 d測(cè)定一次杏果實(shí)的腐爛率，目測(cè)果實(shí)表皮有明顯的霉變、軟腐或病斑，即為腐爛果實(shí)，并根據(jù)公式（4）計(jì)算腐爛率。

1.3.5 .4 杏果實(shí)病害相關(guān)酶活力的測(cè)定

在定期取樣測(cè)定菌落總數(shù)和霉菌總數(shù)后，取樣用液氮冷凍后存放于－80 ℃冰箱中，以備確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)后測(cè)定酶活力。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力參照Liu Hongxia等[23]的方法，該反應(yīng)體系包括0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液、0.1 mol/L鄰苯二酚和0.5 mL酶提取物，實(shí)驗(yàn)測(cè)定吸光度的波長(zhǎng)為420 nm。過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活力測(cè)定參照Luo Zisheng等[24]的方法并稍加改動(dòng)，將0.2 mL酶提取物添加到4.4 mL磷酸鹽緩沖液（100 mmol/L磷酸鈉、pH 6.8 0.4 mL愈創(chuàng)木酚、0.2 mL H2O2）中，并記錄在470 nm波長(zhǎng)處的吸光度。一個(gè)PPO、POD活力單位（U）被定義為每克新鮮杏果實(shí)在相應(yīng)波長(zhǎng)處每分鐘吸光度變化0.01。

L-苯丙氨酸氨解酶（L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活力參照Luo Zisheng等[24]的方法并稍加修改。反應(yīng)體系包含0.2 mol/L的硼酸鈉緩沖液、20 mmol/L的L-苯丙氨酸和0.5 mL的酶提取物。37 ℃下孵育1 h后，在290 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。一個(gè)PAL活力單位（U）被定義為每克鮮果實(shí)反應(yīng)體系每小時(shí)吸光度變化0.01。

β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）和幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）活力參照Cao Jiankang等[25]的方法，對(duì)于GLU，將50 μL的酶提取物與25 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%褐藻多糖混合，在37 ℃孵育40 min。然后加入200 μL 3,5-二硝基水楊酸鹽，在100 ℃沸水中加熱3 min，終止反應(yīng)。在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。一個(gè)GLU活力單位（U）定義為每秒每克鮮果實(shí)酶分解褐藻多糖產(chǎn)生10－9mol葡萄糖。對(duì)于CHI測(cè)定，將0.5 mL的酶提取物與0.5 mL的膠質(zhì)幾丁質(zhì)混合，并在37 ℃下孵育1 h，然后在10 000×g下離心10 min。然后將上清液（1 mL）與0.1 mL的3 g/100 mL蝸牛酶混合，在37 ℃下孵育1 h。通過(guò)添加0.2 mL的0.6 mol/L四硼酸鉀溶液并煮沸5 min，終止反應(yīng)。冷卻后，將溶液與2 mL的體積分?jǐn)?shù)4%的4-二甲基氨基苯甲醛混合，并在37 ℃下溫育10 min。在585 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。一個(gè)CHI活力單位（U）被定義為每秒每克鮮果實(shí)分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生10－9mol的N-乙酰基-D-葡糖胺。

過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活力參照Luo Zisheng等[26]的方法稍加修改。將樣品在裝有pH 7.8 50 mmol/L磷酸鈉緩沖液的研缽中勻漿。反應(yīng)體系包含1.5 mL的50 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.8）、1 mL蒸餾水、0.3 mL 0.1 mol/L H2O2和0.2 mL的酶提取物。一個(gè)CAT活力單位（U）定義為每克鮮果實(shí)在240 nm波長(zhǎng)處每分鐘吸光度變化0.1。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用Origin 9.0軟件作圖，采用Excel 2010軟件和SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。通過(guò)ANOVA進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較程序進(jìn)行顯著性差異分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，各單因素條件下，當(dāng)壁材質(zhì)量比為1∶1、芯材與壁材質(zhì)量比為1∶1、反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時(shí)間為30 min、固化時(shí)間為3 h時(shí)，牛至精油微膠囊的包埋率分別達(dá)到最高。

圖1 不同因素對(duì)牛至精油微膠囊包埋率的影響Fig.1 Effects of different variables on the microencapsulation rate of OEO-MPs

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行了正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，影響包埋率的4 個(gè)因素從大到小依次為芯材與壁材質(zhì)量比＞壁材質(zhì)量比＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間，最終確定最佳的工藝條件組合為A2B2C1D2。對(duì)最優(yōu)的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3 次，結(jié)果均與最優(yōu)工藝條件的組合相同。由此確定最優(yōu)工藝條件為：芯材與壁材質(zhì)量比1∶1、壁材質(zhì)量比1∶1、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時(shí)間30 min。在此工藝條件下，制備了牛至精油微膠囊，對(duì)此精油進(jìn)行表征，并利用其對(duì)杏進(jìn)行貯藏期實(shí)驗(yàn)。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

2.2 牛至精油微膠囊的理化特性與緩釋性能

2.2.1 牛至精油微膠囊的包埋率、載油率、粒徑分布及傅里葉變換紅外光譜

通過(guò)最優(yōu)工藝條件制備的牛至精油微膠囊，其包埋率為83.65%，載油率為74.36%。如圖2A所示，牛至精油微膠囊粒徑分布均勻，平均為147 μm。粒徑分布均勻可能與兩個(gè)因素有關(guān)：一個(gè)是機(jī)械強(qiáng)度，高剪切力可以促進(jìn)牛至精油的乳化，形成較小的膠束，最后形成均勻的乳液[27]；另一個(gè)是溶液的pH值，因?yàn)槲⒛z囊制備過(guò)程中pH值的變化可能導(dǎo)致阿拉伯樹(shù)膠的Zeta-電位發(fā)生變化，當(dāng)帶電陰離子的數(shù)量增加時(shí)，微膠囊之間的排斥力會(huì)增加，微膠囊之間聚集程度降低，從而形成較小的顆粒。

明膠、阿拉伯膠、牛至精油和牛至精油微膠囊的FTIR圖如圖2B所示。明膠的特征吸收峰有氨基N—H伸縮振動(dòng)峰（3 446.33 cm－1）、烷基C—H（2 959.11 cm－1）伸縮振動(dòng)峰、酰胺鍵中C—N伸縮振動(dòng)峰（1 284.85 cm－1）、酰胺羰基C＝O伸縮振動(dòng)峰（1 630.41 cm－1）。當(dāng)pH值低于明膠等電點(diǎn)時(shí)，氨基與氫離子結(jié)合使溶液中—NH4+的數(shù)目多于—COO－，此時(shí)，明膠總體帶正電[28]；C—N伸縮振動(dòng)峰與C＝O伸縮振動(dòng)峰與典型的酰胺I譜帶（1 600～1 700 cm－1）吻合，這也是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)成分中最敏感的光譜區(qū)域。阿拉伯膠的特征吸收峰有烷基C—H伸縮振動(dòng)峰（2 934.66 cm－1）、羧基不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰（1 617.84 cm－1）、羧基對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰（1 422.76 cm－1）。牛至精油的特征吸收峰包括黃酮類物質(zhì)—OCH2的伸縮振動(dòng)吸收峰（2 960 cm－1）、酸酐振動(dòng)吸收峰（1 722 cm－1）、醚類物質(zhì)的振動(dòng)吸收峰（1 252 cm－1）[29]。牛至精油微膠囊的特征吸收峰只有黃酮類物質(zhì)—OCH2的伸縮振動(dòng)吸收峰（2 961 cm－1）和醚類物質(zhì)的振動(dòng)吸收峰（1 255 cm－1），說(shuō)明制備的微膠囊中含有牛至精油；而牛至精油的酸酐振動(dòng)吸收峰未出現(xiàn)，說(shuō)明微膠囊并不是壁材與芯材的簡(jiǎn)單物理混合物，并且形成的微膠囊中未發(fā)現(xiàn)新的特征吸收峰，說(shuō)明在復(fù)凝聚反應(yīng)過(guò)程中未形成新的化學(xué)鍵；此外，牛至精油微膠囊中明膠的氨基吸收峰（3 446 cm－1）和阿拉伯膠的羧基吸收峰（1 617、1 422 cm－1）消失。上述結(jié)果表明，壁材之間發(fā)生相互作用，并將芯材進(jìn)行了包埋，且在該反應(yīng)過(guò)程中未改變壁材和芯材的化學(xué)性質(zhì)。

圖2 牛至精油微膠囊的粒徑分布（A）和FTIR（B）圖Fig.2 Particle size distribution (A) and FTIR spectrum (B) of OEO-MPs

2.2.2 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

通過(guò)SEM觀察冷凍干燥后微膠囊的表面形態(tài)，結(jié)果如圖3所示?？瞻孜⒛z囊（圖3A）表面有凹陷，且成片狀聚集，這可能是因?yàn)樵诶鋬龈稍镞^(guò)程中微膠囊內(nèi)部水分揮發(fā)，壁材發(fā)生皺縮凹陷，最終形成片狀[30]。牛至精油微膠囊（圖3B）表面同樣具有褶皺，這與空白微膠囊表面的凹陷原因相同；與空白微膠囊不同的是，牛至精油微膠囊的囊壁結(jié)構(gòu)比較完整，表面光滑且沒(méi)有產(chǎn)生空洞和破裂。這可能是由于加入了谷氨酰胺酶作為固化劑：谷氨酰胺酶通過(guò)與果膠分子間形成共價(jià)鍵，催化蛋白質(zhì)分子交聯(lián)，從而維持微膠囊的形態(tài)[31]。這說(shuō)明微膠囊化對(duì)芯材產(chǎn)生了良好的保護(hù)作用。

圖3 空白微膠囊（A）和牛至精油微膠囊（B）的SEM圖Fig.3 SEM of blank MPs (A) and OEO-MPs (B)

2.2.3 熱重分析結(jié)果

TG分析是指在程序控制溫度下測(cè)量待測(cè)樣品的質(zhì)量與溫度變化關(guān)系的一種熱分析技術(shù)，用來(lái)研究材料的熱穩(wěn)定性及推測(cè)在此過(guò)程中組分的物理化學(xué)變化。對(duì)牛至精油的TG分析表明，在120 ℃左右時(shí)，牛至精油開(kāi)始發(fā)生分解，直到260 ℃左右，其質(zhì)量損失約98.91%，幾乎全部損失，充分體現(xiàn)了芯材易揮發(fā)的特點(diǎn)。相比而言，壁材則具有較高的穩(wěn)定性，明膠和阿拉伯膠在210 ℃左右時(shí)，質(zhì)量損失分別約為8%和5%，當(dāng)溫度達(dá)到500 ℃左右時(shí)，明膠質(zhì)量剩余21.43%，阿拉伯膠剩余28.54%（圖4A）。

圖4 不同微膠囊的TGA曲線（A）和牛至精油微膠囊的DSC曲線（B）Fig.4 TGA curves of different microcapsules (A) and DSC curve of OEO-MPs (B)

牛至精油微膠囊和空白微膠囊的熱分解過(guò)程主要分為4 個(gè)階段：第一階段（25～100 ℃），此時(shí)兩者的質(zhì)量損失約3%，這是微膠囊中的水分的蒸發(fā)所導(dǎo)致的[32]；第二階段（100～200 ℃），空白微膠囊的質(zhì)量損失約3%，而牛至精油微膠囊的質(zhì)量損失約20%，而純牛至精油損失約41%，這證明了壁材對(duì)芯材起到了很好的保護(hù)作用；微膠囊的熱分解主要發(fā)生在第三階段（200～350 ℃），此階段中，空白微膠囊和牛至精油微膠囊的質(zhì)量損失分別約42%、40%，這可能是因?yàn)槊髂z和阿拉伯膠之間由于靜電相互作用形成的共價(jià)鍵遭到破壞，芯材被不斷分解釋放，且根據(jù)以前的報(bào)道，明膠在275～375 ℃發(fā)生分解，壁材也在逐漸分解[33]；第四階段（350～500 ℃），兩者的質(zhì)量損失約為18%，該階段芯材已經(jīng)完全被釋放，基本上都是壁材的分解。上述結(jié)果表明，由于壁材的保護(hù)，大大降低了精油的分解速率，牛至精油微膠囊表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性。

2.2.4 差示掃描量熱分析結(jié)果

溫度對(duì)微膠囊的穩(wěn)定性有顯著影響，溫度的改變會(huì)影響壁材和芯材的性質(zhì)。隨著溫度的升高，微膠囊狀態(tài)一般分為4 個(gè)階段：玻璃態(tài)、黏彈態(tài)、高彈態(tài)和黏流態(tài)。Tg是玻璃態(tài)向高彈態(tài)轉(zhuǎn)變時(shí)的材臨界溫度。當(dāng)聚合物處于玻璃態(tài)時(shí)，運(yùn)動(dòng)程度最小，貯藏穩(wěn)定性也最高。在貯藏過(guò)程中，當(dāng)微膠囊溫度高于Tg時(shí)，壁材和芯材的性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變，迅速?gòu)牟ＡB(tài)轉(zhuǎn)變成黏彈態(tài)，再轉(zhuǎn)變?yōu)楦邚棏B(tài)直至黏流態(tài)，此過(guò)程會(huì)導(dǎo)致芯材的快速釋放。如圖4B所示，牛至精油微膠囊的Tg是48.04 ℃，高于正常室溫（25 ℃）。這表明在常溫條件下，牛至精油微膠囊比較穩(wěn)定。

2.3 牛至精油微膠囊貯藏穩(wěn)定性

本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步研究了溫度、光照、氧氣對(duì)牛至精油微膠囊穩(wěn)定性的影響。在貯藏30 d時(shí)，在4 ℃和25 ℃條件下，牛至精油微膠囊的精油釋放率分別為11.1%和18.3%，這表明貯藏溫度越高，芯材的保留率越低（圖5A）；在避光和光照條件下，貯藏30 d時(shí)，其釋放率分別為16.5%和21.0%（圖5B）；在無(wú)氧和有氧的條件下，貯藏30 d時(shí)，其釋放率分別為21.1%和25.0%（圖5C）。因此，牛至精油微膠囊適宜在低溫、避光、無(wú)氧的環(huán)境下貯藏。

圖5 溫度（A）、光照（B）、氧氣（C）對(duì)牛至精油微膠囊釋放性能的影響Fig.5 Effects of temperature (A), light (B) and oxygen (C) on the release performance of OEO-MPs

2.4 牛至精油微膠囊對(duì)杏貯藏保鮮的殺菌效果

2.4.1 杏果實(shí)微生物總數(shù)及腐爛率

如表3所示，在貯藏20 d的過(guò)程中，微生物總數(shù)隨時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。在貯藏時(shí)間相同的條件下，4%、8%牛至精油微膠囊處理組的菌落總數(shù)和霉菌總數(shù)均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），這表明牛至精油微膠囊具有明顯的抑菌效果。這是因?yàn)榕Ｖ辆偷挠行С煞帧闱鄯雍桶倮锓訒?huì)與細(xì)菌細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層作用，從而使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能紊亂[34]。在貯藏期內(nèi)，3 個(gè)處理組在菌落總數(shù)上也有顯著差異（P＜0.05），添加量為4%的牛至精油微膠囊表現(xiàn)出更顯著的抑菌效果。

表3 牛至精油微膠囊對(duì)杏果實(shí)微生物總數(shù)和腐爛率的影響Table 3 Effects of OEO-MPs on the total number of microorganisms and decay incidence in apricot fruit

微生物是引起果蔬腐爛的重要因素，其中根霉、灰霉等霉菌是導(dǎo)致杏在采收后發(fā)生軟腐病、褐腐病的主要原因。本課題組前期的研究表明，牛至精油可以有效抑制灰霉、青霉等的生長(zhǎng)[35]。在處理第5天時(shí)，3 個(gè)處理組均未出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，而對(duì)照組中的果實(shí)發(fā)生腐爛，這表明了微膠囊能夠延長(zhǎng)杏的貯藏期。其中，在相同貯藏時(shí)間內(nèi)，添加量為4%牛至精油微膠囊處理的果實(shí)腐爛率最低，這與其抑菌效果相一致。與4%牛至精油處理的果實(shí)相比，添加量為8%的牛至精油微膠囊處理并沒(méi)有進(jìn)一步減輕果實(shí)的腐爛率。因此推測(cè)這可能與微膠囊過(guò)量使用誘發(fā)果實(shí)藥害有關(guān)。因此，添加量為4%微膠囊處理能夠抑制微生物的增長(zhǎng)，降低腐爛率，延長(zhǎng)杏的貯藏時(shí)間。

2.4.2 杏果實(shí)病害相關(guān)酶活力

POD、PPO、CAT、PAL、GLU和CHI是果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的病害相關(guān)酶，它們的活性與果實(shí)的抗病性密切相關(guān)。POD、GLU和CHI都屬于病程相關(guān)（pathogenesis-related，PR）家族蛋白，而PR家族蛋白可以直接降解病原體的細(xì)胞壁或通過(guò)間接釋放防御反應(yīng)寡糖引發(fā)劑來(lái)降解細(xì)胞壁[36]。

在篩選出牛至精油微膠囊添加量為4%時(shí)具有最優(yōu)抑菌效果的基礎(chǔ)上，以加入不含牛至精油的空殼微膠囊為對(duì)照，進(jìn)一步分析了4%牛至精油微膠囊處理對(duì)果實(shí)病害相關(guān)酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。4%牛至精油微膠囊明顯提高了POD、GLU、CHI活力。PPO負(fù)責(zé)將酚類化合物氧化為鄰奎寧，導(dǎo)致水果和蔬菜褐變[37]。在貯藏第6天時(shí)，兩組PPO活力達(dá)到最大值，且牛至精油微膠囊處理組的PPO活力明顯低于對(duì)照組，證明4%牛至精油微膠囊可以降低杏的PPO活力。CAT參與活性氧的代謝，PAL是木質(zhì)素、單寧等的主要合成酶[38]，相比對(duì)照組，4%牛至精油微膠囊明顯提高了兩種酶的活力。因此，4%牛至精油微膠囊能夠提高POD、CAT、PAL、GLU和CHI活力，降低PPO活力，從而誘導(dǎo)杏果實(shí)的防御機(jī)制，增強(qiáng)杏果實(shí)在貯藏期間的抗病能力。

圖6 添加量4%牛至精油微膠囊對(duì)杏果實(shí)貯藏期病害相關(guān)酶活性的影響Fig.6 Effects of 4% OEO-MPs on disease-related enzyme activities in apricot fruit during shelf life

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)合凝聚法成功制備了以明膠和阿拉伯膠為壁材的牛至精油微膠囊，表征了其理化特性和緩釋性能，并評(píng)估了其在杏果實(shí)貯藏過(guò)程中的殺菌效果和對(duì)抗病相關(guān)酶活性的影響。結(jié)果表明，牛至精油微膠囊制備的最佳工藝條件為：芯材與壁材質(zhì)量比1∶1、壁材質(zhì)量比1∶1、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時(shí)間30 min。最優(yōu)工藝條件下制備的牛至精油微膠囊包埋率為83.65%，載油率為74.36%，平均粒徑為147 μm。TGA、DSC、貯藏穩(wěn)定性分析和SEM觀察結(jié)果表明，牛至精油微膠囊具有良好的熱穩(wěn)定性、規(guī)則的表面結(jié)構(gòu)，在低溫、避光和無(wú)氧條件下具有良好的緩釋性能。在杏貯藏期間，添加量為2%、4%、8%的牛至精油微膠囊均具有明顯的抑菌效果，其中，添加量為4%時(shí)，牛至精油微膠囊顯著減少了杏果實(shí)貨架期間表面的微生物總數(shù)，提高了杏貯藏期內(nèi)POD、CAT、PAL、GLU和CHI活性，降低了PPO活性，從而降低了杏果實(shí)的腐爛率。因此，將牛至精油固態(tài)化可以更方便、有效地應(yīng)用于杏果實(shí)的殺菌和保鮮，并起到長(zhǎng)效殺菌的效果。該結(jié)果為今后基于植物精油的綠色果蔬殺菌保鮮劑的開(kāi)發(fā)提供了參考。