羅 強，張 明，劉 巧，羅 璠

（西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041）

屎腸球菌（Enterococcus faecium）是革蘭氏陽性球菌，屬腸球菌屬，廣泛存在于傳統(tǒng)乳制品、發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵香腸等發(fā)酵食品中[1-2]，被認為能夠賦予發(fā)酵食品特殊風味。由于其抗逆性強的特點，近年來常被作為益生菌用于飼料工業(yè)中。但屎腸球菌在臨床上又是一種條件致病菌，所代謝的有毒物質、存在的多重耐藥性以及所攜帶的毒力因子可引起呼吸道、泌尿生殖道等多部位感染以及機體受損[3-4]，在公共衛(wèi)生方面存在較大的安全隱患。因此，屎腸球菌作為益生菌的應用存在較大爭議，2004年加拿大禁止了屎腸球菌作為益生菌使用，但美國和我國允許其作為飼用添加劑在飼料中使用，以達到促進動物生長、預防疾病等目的。由于屎腸球菌在使用上的爭議性以及菌株性質的不明確性，在使用之前對其進行菌株性質評價與研究顯得尤為重要。

屎腸球菌SC-Y112是一株分離自四川紅原地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳品的產細菌素乳酸菌。前期研究表明，該菌株具有生長速度快、遺傳代謝性質穩(wěn)定的特點，同時其產生的細菌素具有廣譜抗菌性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌等常見病原菌具有優(yōu)良的抑菌能力[5]，具備進一步研究與開發(fā)的價值和潛力。本研究通過模擬腸胃液環(huán)境耐受實驗、膽鹽耐受實驗、抗氧化活性測定、溶血活性測定、明膠液化實驗、有害代謝物質檢測、耐藥性評價及腸球菌毒力基因檢測對屎腸球菌SC-Y112的益生性質與安全性質進行分析評價，以期探明菌株性質，為食品及飼用添加劑菌株的開發(fā)與研究提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

屎腸球菌Enterococcus faeciumSC-Y112分離自四川紅原傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳；屎腸球菌Enterococcus faecium467分離自傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜；強溶血性金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusF19分離自發(fā)酵香腸；質控菌株大腸桿菌Escherichia coli8099、釀膿鏈球菌Streptococcus pyogenesATCC 25923購于成都鵬世達實驗用品有限公司，并由青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室保藏。

DNA Marker II、DP302型細菌基因組DNA提取試劑盒、2×TaqMasterMix聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）預混酶 天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白酶（酶活力＞250 U/mg） 丹麥BioFroxx公司；胃蛋白酶（酶活力1∶10 000） 美國Sigma公司；牛膽鹽 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；直接藍71、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 福州飛凈生物科技有限公司；溴甲酚紫、VC 上海源葉生物科技有限公司；A015-1-2型總抗氧化能力檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；藥敏紙片 杭州微生物試劑有限公司；MRS培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。腸球菌屬毒力基因PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

吲哚試劑：稱取0.1 g的對二甲氨苯甲醛，用5 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液溶解，然后再緩慢加入2 mL濃鹽酸?，F(xiàn)用現(xiàn)配，并避光保存。

生物胺檢測培養(yǎng)基[6]：蛋白胨5 g、酵母粉5 g、牛肉膏5 g、氯化鈉2.5 g、葡萄糖0.5 g、吐溫-80 1 mL、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、硫酸鐵0.04 g、檸檬酸銨2 g、磷酸氫二鉀2 g、碳酸鈣0.1 g、VB10.01 g、吡哆醛-5-磷酸0.05 g、溴甲酚紫0.06 g、蒸餾水1 000 mL，調pH值至5.3～5.5，115 ℃滅菌30 min，分別在生物胺檢測培養(yǎng)基中加入10 g/L的對應前體氨基酸（酪氨酸、組氨酸、鳥氨酸、賴氨酸）制成改良氨基脫羧酶檢測培養(yǎng)基。

明膠培養(yǎng)基：氯化鈉5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、明膠120 g、蒸餾水1 000 mL，調至pH 7.2～7.4，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

GI54DW高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 蘇州培英實驗設備有限公司；R40-IIB2超凈工作臺 中國青島海爾有限公司；精密型pH計上海精密科學儀器有限公司；2500凝膠成像系統(tǒng) 中國天能公司；高速冷凍離心機 美國賽默飛世爾科技有限公司；PCR儀、164-5050基礎電源電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

取保藏菌液以2%（以培養(yǎng)基體積計，后同）接種量接入5 mL滅菌MRS培養(yǎng)基，37 ℃靜置活化10 h備用。

1.3.2 模擬胃腸液耐受實驗

參照《中國藥典》[7]中提及的方法配制pH 2.0的模擬胃液和pH 6.8的模擬腸液。模擬胃液：取1 mol/L稀鹽酸溶液16.4 mL于容器中，加蒸餾水800 mL，加入10 g胃蛋白酶，混勻后轉移至容量瓶，定容至1 000 mL，過0.22 μm濾膜除菌備用，pH值約為2.0。模擬腸液：取磷酸二氫鉀6.8 g，加500 mL蒸餾水溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至6.8；另取胰蛋白酶10 g，加適量蒸餾水溶解，將兩溶液混合后轉移至容量瓶，定容至1 000 mL，過0.22 μm濾膜除菌備用。

取10 mL活化后的屎腸球菌SC-Y112菌懸液，6 000 r/min離心10 min后棄上清液，用無菌生理鹽水洗滌兩次，在菌體中加入10 mL模擬胃液（模擬腸液），漩渦混勻后于37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，在0 h和3 h（模擬腸液為4 h）采用平板計數(shù)法測定模擬胃液及模擬腸液處理前后的活菌數(shù)量，根據公式（1）計算菌株存活率。

式中：N1代表經過模擬胃液（模擬腸液）處理后乳酸菌活菌數(shù)/（CFU/mL）；N0代表模擬胃液（模擬腸液）處理前的乳酸菌活菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.3 膽鹽耐受實驗

取活化后的屎腸球菌SC-Y112菌懸液，以2%接種量分別接種到膽鹽質量濃度為0.1、0.3、0.5、1.0 g/100 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)3 h后，采用MRS平板菌落計數(shù)法測定樣品中的菌體數(shù)目。以不加膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基作對照，存活率按照公式（1）計算，此時N1為處理組的乳酸菌活菌數(shù)/（CFU/mL）；N0為對照組的乳酸菌活菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.4 抗氧化活性測定

通過DPPH自由基清除率以及總抗氧化能力評價屎腸球菌SC-Y112的抗氧化活性。乳酸菌無細胞上清液的制備：取10 mL活化后培養(yǎng)24 h的屎腸球菌SC-Y112菌懸液，4 000 r/min、4 ℃離心10 min，取離心后的上清液過0.22 μm濾膜獲得乳酸菌無細胞上清液，4 ℃保存?zhèn)溆肹8]。

總抗氧化能力的測定參照總抗氧化能力檢測試劑盒說明書進行操作。DPPH自由基清除率測定：取150 μL乳酸菌無細胞上清液與150 μL DPPH-甲醇溶液（0.2 mmol/L）于96 孔酶標板上混合，避光室溫反應30 min后，于517 nm波長處測吸光度（A2），以體積分數(shù)70%甲醇溶液代替DPPH-甲醇溶液的反應體系為樣品空白組（A3），以體積分數(shù)70%甲醇溶液代替無細胞上清液的反應體系為控制組（A1），以1 mmol/L VC溶液或MRS培養(yǎng)基代替無細胞上清液的反應體系分別作為陽性或陰性對照組。所有樣品測定3 次，DPPH自由基清除率按式（2）計算。

1.3.5 溶血活性測定

取活化后的屎腸球菌SC-Y112菌懸液，劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，倒置培養(yǎng)48 h，觀察記錄菌落周圍是否有溶血的透明圈，以具有強溶血性質的金黃色葡萄球菌F19作為陽性對照。若菌落周圍由于紅細胞的不完全破裂形成草綠色環(huán)，則為α溶血；若菌落周圍由于紅細胞的完全破裂形成界限分明、完全透明的溶血環(huán)，則為β溶血；若菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化，為γ溶血，即不溶血[9]。

1.3.6 明膠液化實驗

取活化后的屎腸球菌SC-Y112菌懸液，穿刺接種于含有5 mL明膠培養(yǎng)基的環(huán)氧樹脂管中，37 ℃下培養(yǎng)24～48 h后，取出置于4 ℃冰箱中放置2 h以使剩余明膠完全凝固，同時設置陰性對照組（以無菌生理鹽水代替實驗菌）和陽性對照組（以金黃色葡萄球菌F19代替實驗菌），觀察管內融化情況，出現(xiàn)明膠融化現(xiàn)象的試管判定為溶明膠的陽性反應[10]。

1.3.7 有害代謝物質檢測

乳酸菌產生物胺實驗：取活化后的屎腸球菌SC-Y112菌懸液，分別在添加了前體氨基酸（酪氨酸、組氨酸、鳥氨酸、賴氨酸）的改良氨基脫羧酶檢測平板和未添加前體氨基酸的檢測平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)并觀察顏色變化，顏色變?yōu)樽仙臑殛栃越Y果，顏色未變的為陰性結果[11]。

乳酸菌偶氮還原實驗：取活化后的屎腸球菌SC-Y112菌懸液，劃線接種于含有直接藍71（終質量濃度5 mg/L）的MRS平板上，37 ℃培養(yǎng)72 h，觀察是否有水解圈產生，有水解圈出現(xiàn)即為陽性。

吲哚實驗：取實驗菌株以2%接種量接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，滴加吲哚試劑，液面出現(xiàn)玫瑰紅色則為陽性結果，否則為陰性結果。實驗以大腸桿菌8099為陽性對照，以不接種菌液的蛋白胨水培養(yǎng)基為空白對照。

1.3.8 耐藥性評價

參照美國臨床實驗室標準化委員會（Clinical Laboratory Standard Institute，CLSI）推薦使用的紙片擴散（Kirby-Bauer，K-B）法[12]測量8 種抗生素對屎腸球菌SC-Y112的抑菌圈直徑，對耐藥性進行判定，藥敏實驗判定標準見表1。

表1 藥敏紙片含藥量及抗性判定標準Table 1 Standards for determination of drug contents and resistance of drug sensitive paper

實驗菌株過夜活化，4 000 r/min離心10 min后去上清液，菌體重懸于適量無菌生理鹽水中，調整菌體濁度為0.5 個麥氏單位。用無菌棉簽均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基表面，用滅菌鑷子取藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)18～24 h后取出，用游標卡尺測定抑菌圈直徑。使用Streptococcus pyogenesATCC 25923作為質控菌株，質控菌株抑菌圈直徑在CLSI規(guī)定范圍內實驗結果有效。

1.3.9 腸球菌毒力基因檢測

菌株過夜活化，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，擴增Asa1、Asa373、ace、efaA、cylA、esp、hyl、gelE、sprE、fsrA、fsrB和fsrC共12 種腸球菌毒力基因，其中明膠酶E及其啟動子和調節(jié)基因根據GenBank中公布的明膠酶E毒力基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物。引物序列及退火溫度信息參照表2。PCR擴增反應體系（25 μL）：DNA模板1 μL、2×TaqMasterMix PCR預混酶12.5 μL、上/下游引物各1 μL、ddH2O 9.5 μL。每組實驗采用ddH2O代替DNA模板作為陰性對照。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，相應溫度退火（表2）30 s，72 ℃延伸45 s，30 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保溫備用。PCR擴增產物經質量分數(shù)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的位置出現(xiàn)條帶即為含有該毒力基因，以本實驗室前期鑒定的攜帶hyl毒力基因的Enterococcus faecium467作為陽性對照。

表2 腸球菌毒力基因PCR擴增引物序列及反應條件Table 2 Primer sequences and reaction conditions used for polymerase chain reaction amplification of Enterococcus virulence genes

1.4 數(shù)據處理與分析

實驗數(shù)據以3 次重復的平均值±標準差表示，使用Graphpad prism 8.0軟件進行數(shù)據分析與繪圖。

2 結果與分析

2.1 屎腸球菌SC-Y112的模擬胃腸液耐受實驗分析結果

胃腸道環(huán)境是機體的“生物屏障”，益生菌需在胃腸道環(huán)境下存活才能在體內發(fā)揮其益生功能，胃液pH值會隨著胃酸的分泌和消耗在1.5～5.0之間波動，胃液中還含有各種酶類，食物通過胃的時間一般為1～3 h[18]。小腸液呈弱堿性，且含有膽汁酸和酶（主要是胰蛋白酶），食物通過小腸的時間約為1.5 h。胃腸液中存在的酶和酸堿環(huán)境對乳酸菌有著較強的抑制作用。

表3展示了屎腸球菌SC-Y112對模擬胃腸液的耐受性：屎腸球菌SC-Y112在pH 2.0的模擬胃液中培養(yǎng)3 h的存活率為（73.66±4.37）%，展現(xiàn)出較高的耐受性；在pH 6.8的模擬腸液中培養(yǎng)4 h后，存活率為（119.63±3.71）%，菌株數(shù)量明顯升高，這可能是由于模擬腸液pH值呈中性，生長環(huán)境溫和，導致菌株數(shù)量的升高，該結果與李曉飛[19]的研究結果相一致。同時，李素霞[20]指出，產細菌素屎腸球菌分泌的抗菌蛋白可能與模擬腸液中的胰蛋白酶結合，從而消除部分胰蛋白酶對屎腸球菌的抑制作用，導致菌株快速增殖?？傮w而言，屎腸球菌SC-Y112對機體生理濃度范圍內的模擬胃腸液具有良好的耐受能力，認為其具備在體內發(fā)揮其益生性質的潛力。

表3 屎腸球菌SC-Y112的耐模擬胃腸液測定結果Table 3 Resistance of Enterococcus faecium SC-Y112 to simulated gastrointestinal fluid

2.2 屎腸球菌SC-Y112的耐膽鹽實驗分析結果

通過胃液后存活的菌株將在小腸的前部遇到膽鹽，因此，對膽鹽具有抗性是菌株能夠在腸道中生長、存活、發(fā)揮益生功效的一個重要指標，腸道中膽汁的質量濃度一般在0.1～0.3 g/100 mL范圍內波動[21]。

實驗進行了4 種不同膽鹽質量濃度處理，結果如圖1所示，不同質量濃度膽鹽對屎腸球菌SC-Y112具有不同程度的抑制作用，菌株在0.1 g/100 mL膽鹽質量濃度下長勢良好，經過3 h培養(yǎng)后，存活率達到99%以上；在膽鹽質量濃度為0.3 g/100 mL時存活率仍達到56.38%，進一步提升膽鹽質量濃度至0.5 g/100 mL，其存活率降至25.73%；當膽鹽質量濃度升至1.0 g/100 mL時，通過平板菌落計數(shù)未發(fā)現(xiàn)活菌存在，表現(xiàn)出對菌株的強抑制作用。張芬[22]發(fā)現(xiàn)了一株嬰兒源屎腸球菌，其在1.0 g/100 mL膽鹽質量濃度下存活率達75.06%，展現(xiàn)出對高濃度膽鹽的強耐受性，這可能是菌株來源與所處環(huán)境差異導致的?？傮w來說，屎腸球菌SC-Y112能在機體正常生理膽鹽質量濃度下保持較高的存活率，具備良好的膽鹽耐受能力。

圖1 屎腸球菌SC-Y112的耐膽鹽測定結果Fig.1 Bile salt tolerance of Enterococcus faecium SC-Y112

2.3 屎腸球菌SC-Y112的抗氧化活性分析結果

氧化是生物界中普遍存在的化學反應，氧化的過程總是伴隨著自由基的產生，過量的自由基易造成機體的氧化損傷，導致糖尿病、心血管疾病等[23]，而乳酸菌在代謝過程中產生的一些活性物質使乳酸菌具有一定的抗氧化活性，具有強抗氧化活性的乳酸菌株不僅能抑制機體自由基的形成，緩解機體氧化損傷，同時也能提高菌株耐受氧脅迫能力，利于其自身在腸道內存活[24]。

以1 mmol/L VC和MRS培養(yǎng)基作為對照，通過DPPH自由基清除率和總抗氧化能力評價了屎腸球菌SC-Y112的抗氧化活性，結果如表4所示。屎腸球菌SC-Y112發(fā)酵24 h上清液對DPPH自由基的清除率達到（37.68±2.16）%，其總抗氧化能力達到（35.21±0.09）U/mL，1 mmol/L VC和MRS培養(yǎng)基的總抗氧化能力分別為（98.55±3.14）U/mL和（3.36±1.47）U/mL。吳貝等[25]對一株益生性屎腸球菌DPPH自由基清除能力進行評估，其發(fā)酵24 h上清液DPPH自由基清除率達56.5%，具備良好的抗氧化活性。綜合兩類測定方法，屎腸球菌SC-Y112發(fā)酵24 h上清液總抗氧化能力的VC當量為（0.36±0.04）mmol/L，具備一定的抗氧化能力。

表4 屎腸球菌SC-Y112發(fā)酵液的抗氧化活性測定結果Table 4 Antioxidant activity of the fermentation supernatant of Enterococcus faecium SC-Y112

2.4 屎腸球菌SC-Y112的溶血活性分析結果

對乳酸菌株進行溶血現(xiàn)象的測定是乳酸菌安全性評價的重要指標之一。溶血實驗結果如圖2所示，實驗菌株劃線于哥倫比亞血瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)48 h后，陽性對照金黃色葡萄球菌F19菌落周圍出現(xiàn)透明圈，表現(xiàn)出明顯的β溶血。屎腸球菌SC-Y112菌落周圍既無透明圈也無草綠色環(huán)，屬于沒有毒性的γ溶血，即不溶血。這表明屎腸球菌SC-Y112在溶血作用方面是安全的，實驗結果與Charyyev等[26]對屎腸球菌Enterococcus faeciumYT52所進行的溶血實驗結果一致。

圖2 屎腸球菌SC-Y112的溶血實驗結果Fig.2 Hemolysis test results for Enterococcus faecium SC-Y112

2.5 屎腸球菌SC-Y112的明膠液化分析結果

明膠酶是腸球菌合成的一種分泌蛋白酶，由毒力基因gelE編碼，被認為是通過參與細胞膜形成，或降解機體中的膠原蛋白、纖維蛋白等重要物質而發(fā)揮毒性作用[27]，為防止可能的安全隱患，對屎腸球菌SC-Y112進行了明膠液化的評價。實驗結果顯示：屎腸球菌SC-Y112實驗組與無菌生理鹽水代替菌液的陰性對照組均未出現(xiàn)明膠液化現(xiàn)象。陽性對照中，金黃色葡萄球菌F19實驗組出現(xiàn)了明膠液化情況。明膠液化表型常與gelE等明膠酶相關基因共同檢測，以明確菌株致病性。李岱霞等[28]通過檢測375 株腸球菌的明膠酶相關調控基因，與其明膠液化表型作比對，發(fā)現(xiàn)兩者一致性較高，這也表明明膠液化實驗結果能夠在一定程度上評價腸球菌屬的安全性質。

2.6 屎腸球菌SC-Y112的有害代謝物質分析結果

部分乳酸菌株可能代謝產生氨基酸脫羧酶、偶氮還原酶、色氨酸酶等有害酶，這些代謝產物可能對機體健康與穩(wěn)定帶來潛在的安全隱患。實驗對屎腸球菌SC-Y112的有害代謝產物進行檢測，屎腸球菌SC-Y112無偶氮還原現(xiàn)象（圖3中未展示），如圖3所示，大腸桿菌8099賴氨酸脫羧酶檢測平板中出現(xiàn)紫紅色現(xiàn)象，且在吲哚實驗中出現(xiàn)玫瑰紅色，均呈陽性結果；屎腸球菌SC-Y112經4 種氨基酸脫羧酶檢測培養(yǎng)基培養(yǎng)后，無紫紅色產生，表明菌株無氨基脫羧酶活性，不產生酪胺、組胺、腐胺和尸胺4 種生物胺（圖3僅以酪胺為例，組胺、腐胺和尸胺結果未展示），且不代謝色氨酸產生有害物質吲哚。Ino?lu等[29]從奶酪中分離得到28 株腸球菌，其中只檢測到2 株不產酪胺，本實驗中，發(fā)酵乳源屎腸球菌SC-Y112也未檢測到酪氨酸脫羧酶的產生，這可能是菌株不攜帶編碼酪氨酸脫羧酶基因，也有可能是由于菌株未能夠表達相關基因，后續(xù)研究將考慮檢測氨基酸脫羧酶等相關調控基因，進一步確定菌株代謝產物的安全性質。本實驗結果初步表明菌株具有一定的代謝產物安全性。

圖3 屎腸球菌SC-Y112的有毒代謝產物檢測結果Fig.3 Results of the detection of toxic metabolites of Enterococcus faecium SC-Y112

2.7 屎腸球菌SC-Y112的耐藥性評價結果

選取了8 種常見抗生素進行菌株的耐藥性質評價，質控菌株抑菌圈直徑均在允許范圍內，實驗菌株耐藥結果如表5所示，萬古霉素對屎腸球菌SC-Y112的抑菌圈直徑達到（22.40±0.43）mm，達到敏感級別，但對青霉素等其他7 種抗生素具有耐藥性。目前針對益生菌作為飼用添加劑的耐藥性質具有兩種不同觀點：一方面認為耐藥菌株攜帶的耐藥基因可能轉移至動物體內其他致病菌從而造成嚴重的耐藥性；另一方面認為，耐藥性較強的菌株在腸道定植后，能夠較好地耐受后期服用的抗生素等藥物，從而能夠更長久地發(fā)揮其益生性質。周娟娟等[30]通過對142 株腸球菌屬乳酸菌進行耐藥性檢測，發(fā)現(xiàn)屎腸球菌對大部分抗菌藥物具有耐藥性，本實驗選取的屎腸球菌SC-Y112也表現(xiàn)出多重耐藥性，關于腸球菌的使用安全性還需要進行更為細致和深入的研究。萬古霉素屬于糖肽類抗生素，普遍被認為是治療腸球菌感染的最后一道防線[31]，Maia等[32]通過對103 株食源性屎腸球菌進行耐藥性檢測，結果發(fā)現(xiàn)所有菌株均對萬古霉素敏感，本次研究結果證明屎腸球菌SC-Y112也對其具有高度敏感性。此外，菌株是否攜帶耐藥基因及可能存在的其他耐藥因素仍需進一步實驗研究。

表5 屎腸球菌SC-Y112的抗生素敏感性實驗結果Table 5 Antibiotic sensitivity of Enterococcus faecium SC-Y112

2.8 屎腸球菌SC-Y112的腸球菌毒力基因檢測結果

腸球菌的致病性與毒力基因密切相關[33]，本研究對屎腸球菌SC-Y112的12 種常見毒力因子基因進行了檢測，包括聚集物質、腸球菌表面蛋白、腸球菌心內膜炎抗原A、膠原蛋白黏附素、溶血素、透明質酸酶和明膠酶E及相關調控基因。

毒力基因PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖4所示，陽性對照菌Enterococcus faecium467在預估位置擴增得到hyl（276 bp），屎腸球菌SC-Y112在各泳道均無目的條帶檢出，表明該菌不攜帶這些主要的腸球菌毒力基因，其中溶血素基因cylA檢測結果與不溶血表型相一致，明膠酶相關基因的檢測結果與明膠溶解實驗中不溶解明膠的表型結果一致。王送林[34]通過對40 株屎腸球菌進行毒力基因檢測，發(fā)現(xiàn)有52.5%的菌株不攜帶任何毒力基因，在檢測出毒力基因的屎腸球菌中，攜帶hyl和asa1毒力基因的菌株占據了絕大部分。Amaral等[35]通過對3 株屎腸球菌進行了多種毒力基因檢測，均未檢測到毒力基因存在。在本實驗中，在屎腸球菌SC-Y112中同樣未檢測出任何常見毒力基因，初步認為其具備一定的安全性，但更多不常見的毒力基因攜帶情況，仍需要進一步檢測。

圖4 屎腸球菌SC-Y112毒力基因的電泳圖Fig.4 Electropherograms of Enterococcus faecium SC-Y112 virulence gene

3 結 論

本研究通過模擬腸胃液環(huán)境耐受實驗、抗氧化活性測定、溶血活性測定、明膠液化實驗、有害代謝物質檢測、耐藥性評價及腸球菌毒力基因檢測，對屎腸球菌SC-Y112的體外益生性質與安全性質進行分析評價。結果發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌SC-Y112對模擬胃腸液耐受性強，在模擬胃液中培養(yǎng)3 h的存活率達到73.66%，在質量濃度0.3 g/100 mL的膽鹽培養(yǎng)下存活率達56.38%，其發(fā)酵24 h上清液總抗氧化活力達35.21 U/mL，菌株不代謝產生酪胺、組胺、腐胺和尸胺4 種生物胺，不產吲哚以及偶氮還原酶等有害物質，無溶血現(xiàn)象，不溶解明膠，不攜帶12 種常見腸球菌毒力基因，對萬古霉素敏感，表明屎腸球菌SC-Y112具有一定的益生性以及相對安全性。本研究結果結合該菌株的抑菌特性，可為菌株的開發(fā)與利用提供理論參考。