譚 文，張欽俊，萬鵬宇，劉學(xué)波，段 翔

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

蛋清是一種以水作為分散介質(zhì)，以蛋白質(zhì)作為分散相的膠體物質(zhì)。雞蛋清中的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78.3%～88.6%，蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.8%～11.6%，其余為極少的脂質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)等。蛋清中的蛋白質(zhì)有40余種，含有人體必需的8 種氨基酸，人體消化吸收率在98%以上，是食品中最理想的蛋白質(zhì)資源之一[1-2]。同時(shí)，蛋清蛋白具有優(yōu)良的起泡性，因而被廣泛應(yīng)用于蛋糕、餅干、冰淇淋等食品中，是食品加工行業(yè)中重要的原輔料[3]。與植物蛋白發(fā)泡粉相比，蛋清蛋白發(fā)泡粉具有發(fā)泡性能強(qiáng)、無異味、使用范圍廣等諸多優(yōu)勢(shì)。近年來，隨著消費(fèi)者對(duì)高品質(zhì)食品的需求逐漸提高，開發(fā)具有高起泡性的蛋清蛋白粉從而改善食品品質(zhì)具有重要意義。

蛋清蛋白優(yōu)良的起泡性來自于其良好的兩親性，這使其在打發(fā)過程中分子結(jié)構(gòu)重新排布并快速分布于水相-氣相界面，使親水、疏水基團(tuán)分別趨向水相與氣相，包裹空氣并維持泡沫的穩(wěn)定性。因此，適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)改性對(duì)于蛋白質(zhì)的發(fā)泡以及泡沫穩(wěn)定性具有積極作用[4]。但是，受限于蛋清液的熱敏性與易受外來添加物污染等缺點(diǎn)，傳統(tǒng)高溫高壓等物理場(chǎng)干預(yù)以及需要引入外來物質(zhì)的化學(xué)接枝等蛋白質(zhì)改性方法難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化[5]。因此，探究綠色安全、操作便捷的蛋白改性方法對(duì)提升蛋清蛋白的起泡特性具有重要的實(shí)際意義。球磨處理是一種新型綠色快捷的加工技術(shù)，在食品加工中的應(yīng)用日趨廣泛[6]。球磨處理過程中，碰撞、摩擦和剪切產(chǎn)生綜合作用，促使蛋白分子結(jié)構(gòu)改變而影響其功能特性[7]。Sun Chanchan等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與天然乳清蛋白相比，經(jīng)過球磨處理的乳清蛋白濃縮物具有更好的表面疏水性和泡沫穩(wěn)定性。Yu Cuiping等[9]發(fā)現(xiàn)球磨工藝可通過改變貽貝蛋白的結(jié)構(gòu)使更多酶切位點(diǎn)暴露，從而提高其消化率。Liu Bohui等[10]認(rèn)為，適當(dāng)?shù)那蚰スに嚳筛淖兇蠖狗蛛x蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，提高大豆分離蛋白的凝膠性和持水性。上述研究為闡明球磨工藝對(duì)食品蛋白理化和加工性能的影響提供了參考。然而，蛋清蛋白在球磨過程中結(jié)構(gòu)和起泡能力的變化仍鮮有報(bào)道。因此，本研究旨在探究球磨工藝對(duì)蛋清蛋白起泡特性的影響，并探討其作用機(jī)制，為蛋清蛋白起泡特性的改良與高起泡性蛋清蛋白粉的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋為市售；5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)（5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司；氫氧化鈉、無水磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQM-2L球磨機(jī)以及直徑分別為10、7、5 mm的瑪瑙研磨球 長沙米琪儀器設(shè)備有限公司；LS55熒光分光光度計(jì) 美國PE公司；Q2000差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國Waters公司；Vetex70傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司；UV-1200紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Mastersizer 2000激光粒度儀 英國馬爾文公司；DFA100動(dòng)態(tài)泡沫分析儀 德國Krüss公司；S-3400N掃描電子顯微鏡、MSP-IS離子發(fā)射儀 日本日立有限公司。

1.3 方法

1.3.1 球磨處理蛋清蛋白樣品的制備

取新鮮雞蛋清洗，打蛋、分蛋取蛋清，收集蛋清液并將其凍干。將凍干的蛋清蛋白粉末置于剛玉研磨杯中，加入總質(zhì)量與樣品質(zhì)量相當(dāng)?shù)闹睆椒謩e為10、7、5 mm（個(gè)數(shù)比1∶2∶4）的瑪瑙研磨球，在室溫避光條件下使用YXQM-2L球磨機(jī)以100 r/min分別研磨0、20、40 min和60 min后，將蛋清蛋白粉儲(chǔ)存在－20 ℃待進(jìn)一步分析。

1.3.2 游離巰基含量的測(cè)定

參考Li Huijing等[11]的方法，將40 mg DTNB溶解在10 mL TGE緩沖液（10.4 g Tris、6.9 g Gly和1.2 g乙二胺四乙酸二鈉溶解在1 000 mL去離子水（pH 8.0）中）中制備Ellman's試劑（加入DTNB后需要重新調(diào)節(jié)pH值至8.0）。將凍干后的蛋白樣品溶解于十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-TGE緩沖液（100 mL TGE緩沖液加入2.5 g SDS）中，使最終的蛋清蛋白質(zhì)量濃度為10 mg/mL，振蕩溶解30 min（每10 min漩渦振蕩一次）。取4 mL蛋清蛋白溶液與0.04 mL Ellman's試劑溶液混合。將混合溶液在室溫下于黑暗條件中振蕩10 min，離心，選取上清液用分光光度計(jì)測(cè)定其在412 nm波長處的吸光度（空白對(duì)照為沒有添加Ellman's試劑和樣品的SDS-TGE緩沖液）。游離巰基含量按式（1）計(jì)算。

式中：A412nm為樣品在412 nm波長處的吸光度；ρ為樣品蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；73.53為106/13 600（13 600是Ellman's試劑的摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·mL））。

1.3.3 表面疏水性的測(cè)定

參照Voutsinas等[12]的ANS探針法測(cè)定蛋白表面疏水性。將蛋清蛋白樣品用10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）分別稀釋至不同質(zhì)量濃度（0.01～0.20 g/100 mL）。取20 μL 8.0 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制的ANS溶液添加至4 mL的蛋白樣品溶液中，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm。以熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)量濃度之間的初始斜率表征蛋白表面疏水性。

1.3.4 水解度的測(cè)定

參照Lamsal等[13]的方法進(jìn)行水解度測(cè)定。在20 mL蒸餾水中溶解100 mg蛋清蛋白，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0。50 ℃恒溫振蕩使溶液充分混合。向混合溶液中加入2 mg蛋白水解酶，定時(shí)測(cè)定溶液pH值，并通過加入0.25 mol/L氫氧化鈉溶液保持pH值恒定，記錄氫氧化鈉溶液的加入量。水解度按式（2）計(jì)算。

式中：V為加入氫氧化鈉溶液的體積/mL；c為氫氧化鈉溶液的濃度（0.25 mol/L）；α為α-氨基基團(tuán)的解離度（50 ℃、pH 8.0下α為0.88）；m是蛋清蛋白的質(zhì)量/g；htot是底物中肽鍵的數(shù)量，雞蛋蛋白的htot為8.38。

1.3.5 Zeta-電位和粒徑的測(cè)定

樣品溶液用10 mmol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋至質(zhì)量濃度為2 mg/mL，利用馬爾文激光粒度儀對(duì)球磨前后的蛋白樣品溶液的Zeta-電位和粒徑進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 熱重分析

通過DSC技術(shù)測(cè)定蛋清蛋白樣品的熱力學(xué)參數(shù)。稱取2 mg左右蛋白樣品置于鋁制樣品盤中，掃描溫度范圍為40～180 ℃，將放置樣品的鋁制樣品盤和作為對(duì)照組的空鋁制樣品盤放入儀器，以5 ℃/min的速率從30 ℃加熱到180 ℃，通過軟件繪制DSC曲線。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜掃描

利用傅里葉變換紅外光譜儀分析蛋清蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。蛋白質(zhì)樣品與溴化鉀以質(zhì)量比1∶200充分混合并磨成粉狀。取適量上述混合粉末，將其壓成薄片，在波數(shù)4 000～400 cm－1范圍內(nèi)，以空氣為背景分析樣品峰強(qiáng)度。使用Omnic軟件包和PeakFit v4.12軟件分析傅里葉變換紅外光譜數(shù)據(jù)。

1.3.8 起泡性分析

參照Kumar等的方法[14]，使用DFA100動(dòng)態(tài)泡沫分析儀分析樣品的起泡性能。稱取蛋白樣品100 mg溶解于50 mL去離子水中制備蛋白溶液，將空氣以0.3 L/min的劑量噴注于pH值為8.8的蛋白溶液中，持續(xù)6 s制備泡沫，分別記錄每個(gè)樣品的最大泡沫體積Vmax以及泡沫由總體積的75%減少到50%所需要的時(shí)間。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次。以最大泡沫體積Vmax與初始液體體積Vs的比值反映其起泡性能，具體按式（3）計(jì)算，以泡沫持久性值（head retention value，HRV）（泡沫由75%減少到50%所需要的時(shí)間）來反映泡沫的穩(wěn)定性。

式中：Vmax為樣品的最大泡沫體積/mL；Vs為樣品的初始液體體積/mL。

1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察

通過掃描電子顯微鏡觀察球磨處理前后的蛋白形態(tài)的變化。將蛋白樣品固定在樣品架上，用MSP-IS離子發(fā)射儀處理樣品。使用5 kV的加速電壓，分別在10k、5k、1k放大倍數(shù)下觀察樣品表面形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)每組數(shù)據(jù)測(cè)定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0軟件中單因素方差分析法進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 球磨處理對(duì)蛋清蛋白游離巰基含量的影響

蛋白的游離巰基在氧化劑存在時(shí)可以被氧化為二硫鍵，后者亦可以在有還原劑或其他作用力存在時(shí)還原為游離巰基[15]。因此，游離巰基含量可以反映蛋白分子結(jié)構(gòu)的變化。蛋清的主要蛋白中，只有卵白蛋白具有游離巰基[16]。雖然球磨處理伴隨著機(jī)械擠壓、摩擦等物理作用以及與空氣的充分接觸作用，但是球磨處理對(duì)蛋清蛋白的游離巰基沒有顯著影響（圖1）。說明球磨處理過程中沒有形成新的二硫鍵，也沒有二硫鍵的斷裂與重排。這可能與本實(shí)驗(yàn)的處理?xiàng)l件相對(duì)溫和有關(guān)（最高球磨時(shí)間為60 min）。

圖1 球磨時(shí)間對(duì)蛋清蛋白游離巰基含量的影響Fig.1 Effect of ball-milling treatment time on free sulfhydryl group content of egg white proteins

2.2 球磨處理對(duì)蛋清蛋白表面疏水性的影響

天然蛋白分子變性時(shí)，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生展開或折疊，使分子疏水基團(tuán)重新分布，表面疏水特性發(fā)生改變。因此，疏水性是反映蛋白分子結(jié)構(gòu)變性程度的直觀指標(biāo)[17]。在蛋清攪拌過程中，蛋白分子會(huì)在氣-液界面吸附，疏水基團(tuán)趨向于氣相[18]。由圖2可知，蛋清蛋白表面疏水性隨球磨時(shí)間的延長而顯著減小，說明球磨處理會(huì)破壞蛋清蛋白的天然結(jié)構(gòu)，促使蛋白結(jié)構(gòu)重新折疊或聚集，導(dǎo)致疏水基團(tuán)更多地被包裹于分子內(nèi)部[19]，從而降低其表面疏水性。通常，蛋白優(yōu)良的起泡性源于其平衡的兩親性，表面疏水基團(tuán)過多，則蛋白溶解性差，難以發(fā)揮加工特性；反之，表面疏水基團(tuán)過少，則不利于蛋白在氣-液界面分布。因此，表面疏水性的變化對(duì)于蛋白起泡特性具有顯著影響。

圖2 球磨時(shí)間對(duì)蛋清蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effect of ball-milling treatment time on surface hydrophobicity of egg white proteins

2.3 球磨處理對(duì)蛋清蛋白水解度的影響

由表1可知，天然蛋清蛋白的水解度很低（2.56%），這是由于天然蛋清蛋白具有較緊密的球狀結(jié)構(gòu)，一定程度上阻礙了酶的接觸與催化作用。隨著球磨時(shí)間的延長，蛋清蛋白的水解度顯著增加；經(jīng)過60 min球磨處理后，蛋白水解度由處理前的2.56%增加至8.24%，這可能是因?yàn)榍蚰ジ淖兞说扒宓鞍椎姆肿咏Y(jié)構(gòu)，使蛋清蛋白暴露出更多的酶切位點(diǎn)，從而對(duì)胰蛋白酶的敏感性增加[20]。通常認(rèn)為天然蛋清蛋白的低水解度是其觸發(fā)體內(nèi)食物過敏反應(yīng)的原因之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，球磨處理后蛋清蛋白水解度顯著增加，有可能導(dǎo)致其致敏性下降。

表1 球磨時(shí)間對(duì)蛋清蛋白水解度、Zeta-電位和粒徑的影響Table 1 Effect of ball-milling treatment time on degree of hydrolysis,zeta potential and particle size of egg white proteins

2.4 球磨處理對(duì)蛋清蛋白Zeta-電位和粒徑的影響

蛋白質(zhì)凈電荷影響泡沫的穩(wěn)定性，蛋白分子表面攜帶的凈電荷越多，分子之間排斥力越大，形成的泡沫穩(wěn)定性越強(qiáng)[21]。因此，Zeta-電位絕對(duì)值越高，泡沫體系越穩(wěn)定[22]。同時(shí)，粒徑能夠反映蛋白質(zhì)分子間的分散和聚集等變化情況，粒徑越小，說明體系中蛋白分子分散性越好。如表1所示，球磨處理0～40 min，蛋清蛋白的Zeta-電位絕對(duì)值沒有顯著變化；當(dāng)球磨時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，蛋清蛋白的Zeta-電位絕對(duì)值顯著下降到9.76 mV。另外，蛋清蛋白粒徑在球磨60 min后達(dá)到最大值228.95 nm。這兩個(gè)結(jié)果共同說明，球磨處理60 min時(shí)，蛋白分子之間表面電荷數(shù)下降，分子膠束之間發(fā)生聚集。該結(jié)論與上述表面疏水性結(jié)果一致，即蛋白分子結(jié)構(gòu)改變，分子之間趨于聚集，將部分表面疏水基團(tuán)包裹于分子內(nèi)部[23]。

2.5 球磨處理對(duì)蛋清蛋白熱力學(xué)性質(zhì)的影響

熱穩(wěn)定性指共聚物在加熱時(shí)抵抗聚集的能力，它是衡量共聚物性質(zhì)的指標(biāo)。變性溫度能夠反映蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，與氨基酸組成和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象相關(guān)，焓變能夠反映蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的有序程度[24]。此外，熱穩(wěn)定性也可以反映蛋白質(zhì)三級(jí)構(gòu)象的有序程度[25-26]。本研究中，蛋清蛋白球磨后變性溫度和熱變性焓（ΔH）的變化如表2所示。隨球磨時(shí)間的延長，變性溫度沒有顯著變化（P＞0.05），表明球磨處理不會(huì)引起蛋清蛋白變性溫度的改變。但是，隨著球磨處理時(shí)間的延長，ΔH顯著下降，說明球磨會(huì)使蛋清蛋白分子結(jié)構(gòu)重排，有序性下降。該特性可能有助于蛋白分子柔性增加，從而更好地在氣-液界面分布。

表2 球磨時(shí)間對(duì)蛋清蛋白熱特性的影響Table 2 Effect of ball-milling treatment time on thermal properties of egg white proteins

2.6 球磨處理對(duì)蛋清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過主鏈上的C＝O和N—H間的氫鍵作用維持，傅里葉變換紅外光譜圖中有酰胺I、II、III 3 組特征吸收譜帶，其波數(shù)分別對(duì)應(yīng)1 700～1 600 cm－1、1 550～1 530 cm－1和1 300～1 260 cm－1。其中，酰胺I帶最常用于分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。據(jù)報(bào)道，紅外光譜各子峰與各二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下：1 615～1 638 cm－1和1 682～1 698 cm－1為β-折疊，1 638～1 645 cm－1為無規(guī)卷曲，1 645～1 662 cm－1為α-螺旋，1 662～1 682 cm－1為β-轉(zhuǎn)角[27]。

由表3可知，隨著球磨時(shí)間的延長，蛋清蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)相對(duì)含量顯著增加，α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量先降低后升高，而β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對(duì)含量先升高后降低。β-折疊和α-螺旋結(jié)構(gòu)占二級(jí)結(jié)構(gòu)的70%左右，這與Sheng Long等[28]的研究結(jié)果一致，表明蛋清蛋白具有較高的有序性和穩(wěn)定性。多數(shù)蛋白變性時(shí)，二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變通常表現(xiàn)為α-螺旋相對(duì)含量下降[29]，β-折疊結(jié)構(gòu)相對(duì)含量有一定上升，這些都表明蛋清蛋白在受到球磨作用后，其疏水性基團(tuán)逐漸減少，而親水性基團(tuán)逐漸增多[30]，這與圖2表面疏水性結(jié)果一致。當(dāng)球磨時(shí)間超過40 min后，α-螺旋相對(duì)含量開始增加，其原因可能是過度球磨處理使蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，這與上述Zeta-電位和粒徑的結(jié)果一致。

表3 不同球磨時(shí)間下蛋清蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 3 Secondary structure contents in egg white proteins with different ball-milling treatment times

2.7 球磨處理對(duì)蛋清蛋白起泡特性的影響

蛋白質(zhì)的起泡特性與其在氣-液兩相界面上形成膜的性質(zhì)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以最大泡沫體積Vmax與初始液體體積Vs的比值反映其起泡性能，以HRV反映其泡沫的穩(wěn)定性。Vmax和HRV結(jié)果如圖3所示，隨著球磨時(shí)間的延長，起泡性沒有顯著變化。其原因可能是，雖然球磨處理降低了蛋白分子的表面疏水性及其在氣-液界面分布的趨勢(shì)，但球磨處理后蛋白分子的柔性增加，有助于調(diào)整分子結(jié)構(gòu)更好地分布于泡沫表面。值得注意的是，隨著球磨時(shí)間的延長，蛋清蛋白的泡沫穩(wěn)定性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在處理40 min時(shí)達(dá)到最大值33.5 s，比對(duì)照組（球磨0 min）的8 s提高了近3 倍。根據(jù)上述分子分子結(jié)構(gòu)分析，其原因是球磨處理40 min時(shí)蛋白分子表現(xiàn)出更好的分子柔性，使更多的蛋白參與泡沫形成過程，增加了氣泡膜的厚度，有助于維持泡沫的形態(tài)而阻止其破裂或聚集。反之，過度球磨處理（60 min）致使蛋白泡沫穩(wěn)定性下降，根據(jù)以上對(duì)分子結(jié)構(gòu)的分析，這是過度球磨處理引起蛋白分子表面電位下降，分子膠束間排斥力降低，從而使泡沫容易發(fā)生聚集所致。

圖3 球磨時(shí)間對(duì)蛋清蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of ball-milling treatment time on foaming capacity and foam stability of egg white proteins

2.8 球磨處理對(duì)蛋清蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

通過掃描電子顯微鏡觀察球磨前后蛋清蛋白微觀結(jié)構(gòu)的變化。如圖4所示，對(duì)照組的樣品呈現(xiàn)出海綿狀結(jié)構(gòu)，含有大量孔隙，這種多孔結(jié)構(gòu)是由冷凍干燥過程中冰晶升華形成的[31]。經(jīng)過球磨處理后，蛋白質(zhì)樣品坍縮成具有不規(guī)則、剛性結(jié)構(gòu)的粗顆粒，且隨著球磨時(shí)間的延長，碎片化和絮狀加劇。這是由于球磨中壓平、聚集和斷裂的作用縮小了蛋白質(zhì)之間的間隙[12]。

圖4 球磨處理0 min（A）、20 min（B）、40 min（C）和60 min（D）的蛋清蛋白掃描電子顯微鏡結(jié)果Fig.4 Scanning electron micrographs of egg white proteins subjected to ball-milling treatment for 0 (A), 20 (B), 40 (C) and 60 min (D)

3 結(jié) 論

球磨處理改變了蛋清蛋白結(jié)構(gòu)，其能夠降低蛋清蛋白表面疏水性，降低Zeta-電位絕對(duì)值，增大水解度及粒徑；此外，球磨處理改變了蛋清蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)，雖對(duì)蛋清起泡性無顯著影響，但對(duì)泡沫穩(wěn)定性有顯著影響。綜上，球磨處理具備綠色安全、無添加物、能耗低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。