朱文豪，周 青，童東昌，張 振，郭垠梅，寧迪敏，黃 振，鄭 飄，田雪飛△

(1.湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

原發(fā)性肝癌(以下簡稱肝癌)是指發(fā)生在肝細胞或肝內(nèi)膽管上皮細胞的惡性腫瘤，是我國最常見的惡性腫瘤之一。肝癌在我國惡性腫瘤發(fā)病率中居第4位，死亡率居第2位，每年大約有60萬人死于肝癌，是導致死亡最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前，臨床上肝癌的治療手段包括手術切除、介入治療、放化療、靶向治療等，但受化療毒副反應大、靶向治療耐藥比例高等因素的影響，整體治療效果并不理想、5年生存率較低。而近年來，中藥已被證實可通過多途徑抑制肝癌細胞生長、增殖，在肝癌治療上效果顯著[2]。研究證實，雷公藤中雷公藤甲素等活性成分能顯著抑制肝癌細胞增殖，可能與抑制Ras蛋白表達有關[3]。本研究通過運用網(wǎng)絡藥理學方法及分子對接技術構建“雷公藤-活性成分-靶點-肝癌”互作網(wǎng)絡，并對結果加以驗證，探討雷公藤有效活性成分治療肝癌的作用機制，進一步為中藥治療肝癌提供方向和思路。研究流程圖見圖1。

圖1 研究流程圖

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫、軟件、分析平臺 本研究所應用的數(shù)據(jù)庫、軟件、分析平臺具體信息見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫、軟件、分析平臺

1.2 方法

1.2.1 雷公藤活性成分及靶點篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索雷公藤的主要活性成分，依據(jù)口服利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18進行活性成分篩選，根據(jù)結果查詢對應靶點，并使用UniProt數(shù)據(jù)庫將查詢所得靶點轉換成geneSymbol。

1.2.2 肝癌靶點篩選 通過DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫以“l(fā)iver cancer”為關鍵詞進行檢索，匯總、并集、去重后獲得肝癌相關靶點。

1.2.3 雷公藤治療肝癌靶點的篩選 利用R語言軟件將雷公藤活性成分相關靶點和肝癌相關靶點進行匹配映射，并繪制韋恩圖，獲得雷公藤潛在治療肝癌靶點。

1.2.4 構建雷公藤治療肝癌靶點PPI網(wǎng)絡 將雷公藤治療肝癌相關靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，構建治療靶點 PPI網(wǎng)絡，“highest confidence”設為“＞0.9”，將結果以TSV格式導出，應用R語言軟件計算靶點互作頻次且繪制柱狀圖。

1.2.5 構建“雷公藤-活性成分-靶點-肝癌”網(wǎng)絡 采用Cytoscape3.8.2軟件構建“雷公藤-活性成分-靶點-肝癌”互作網(wǎng)絡圖。

1.2.6 GO功能分析和KEGG通路富集分析 應用R語言軟件對所獲雷公藤治療肝癌靶點進行GO功能分析和KEGG 通路富集分析(P＜0.05，Q＜0.05)，并將結果以氣泡圖形式輸出。

1.2.7 分子對接 為了從分子水平闡明與化合物的作用模式，我們將活性成分對接至蛋白口袋。從PubChem數(shù)據(jù)庫下載互作網(wǎng)絡中靶點數(shù)排名前5的活性成分mol2格式3D結構，RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載柱狀圖中排名前5的蛋白三維結構，應用Autodock vina進行半柔性對接，選取對接結合能量最低的構象用于對接結合模式分析，并使用PyMOL進行作圖。

2 結果

2.1 雷公藤活性成分、靶點獲取及篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索雷公藤共獲得活性成分144個，根據(jù)上述方法中所設定的條件對雷公藤的有效成分進行篩選，共得到雷公藤的潛在活性成分51個，見表2。將活性成分對應的靶點輸入UniProt數(shù)據(jù)庫，共篩選出121個藥物靶點。

表2 雷公藤活性成分

2.2 肝癌靶點篩選 使用 DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫以“l(fā)iver cancer”為關鍵詞進行檢索，分別獲取 6，16 670，416，63 個靶點，4 個數(shù)據(jù)庫共有17 155個靶點，去重后共有16 707個靶點。

2.3 雷公藤治療肝癌靶點篩選 應用R語言軟件將121個雷公藤活性成分相關靶點和16 707個肝癌相關靶點進行匹配映射，繪制韋恩圖，見圖2，兩者取交集后獲得雷公藤潛在抗肝癌靶點120個。

圖2 雷公藤治療肝癌靶點韋恩圖

2.4 雷公藤治療肝癌靶點PPI網(wǎng)絡構建 應用STRING網(wǎng)站構建治療靶點PPI網(wǎng)絡，互作網(wǎng)絡中共有節(jié)點102個，其中有18個靶點出現(xiàn)離散，邊數(shù)328條，見圖3。應用R語言軟件計算靶點互作頻次且繪制柱狀圖，見圖4。靶點互作頻次較高的有AKT1、VEGFA、CXCL8、JUN、PTGS2，表明雷公藤活性成分與其有較高的結合活性，可作為雷公藤治療肝癌的關鍵靶點。

圖3 雷公藤治療肝癌靶點PPI網(wǎng)絡

圖4 雷公藤治療肝癌靶點互作頻次圖

2.5 “雷公藤-活性成分-靶點-肝癌”網(wǎng)絡模型構建及分析 將雷公藤活性成分與雷公藤潛在治療肝癌靶點輸入Cytoscape3.8.2軟件中，繪制“雷公藤-活性成分-靶點-肝癌”互作網(wǎng)絡圖，見圖5。結果顯示，雷公藤中主要活性成分為山柰酚(kaempferol)、雷公藤甲素(triptolide)、川陳皮素(nobiletin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)和豆甾醇(stigmasterol)，這幾種活性成分可能在肝癌的治療上發(fā)揮主要作用。

圖5 “雷公藤-活性成分-靶點-肝癌”互作網(wǎng)絡圖

2.6 GO功能分析和KEGG通路富集分析 應用R語言軟件對治療靶點進行GO功能分析和KEGG通路富集分析。結果顯示，治療靶點主要涉及酰胺結合、肽結合、DNA結合轉錄因子結合等生物學過程，見圖6，并主要富集于卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、乙型肝炎、流體剪切應力和動脈粥樣硬化等信號通路中，見圖7。提示雷公藤可能通過多個生物學過程、多條通路發(fā)揮抗肝癌作用。其中，氣泡的面積與富集到的靶點數(shù)量呈正相關，氣泡的顏色由藍色轉紅色提示p值由大至小。故紅色氣泡面積越大，表明該信號通路的顯著性越高。

圖6 GO功能分析氣泡圖

圖7 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 分子對接結果 分子對接驗證顯示對接得分大于-5kcal/moL者占100%，即所有靶點與成分的結合活性較好。對接得分見表3，對接得分熱圖見圖8。紅色越深說明活性成分與靶點對接得分越大。部分靶點與成分對接示意圖見圖9，如山柰酚與PTGS2對接得分為-9.2kcal/moL，化合物與氨基酸殘基SER-49形成鍵長為 2.1?、2.3?、1.9?、2.5? 的氫鍵作用，TRP-323形成鍵長為2.0?的氫鍵作用，ASN-34形成鍵長為2.1?、2.3?的氫鍵作用，PRO-153形成鍵長為2.7?的氫鍵作用，GLN-461形成鍵長為2.7?的氫鍵作用，見圖9A；雷公藤甲素與VEGFA對接得分為-7.1kcal/mol，化合物和氨基酸殘基PHE-47形成鍵長為2.0?的氫鍵作用，見圖9B；川陳皮素與PTGS2對接得分為-8.4kcal/mol，化合物和氨基酸殘基TYR-130、ASN-34、HIS-39 分別形成鍵長為 2.7?、2.1?、1.9?的氫鍵作用，見圖9C。

表3 分子對接得分

圖8 分子對接熱圖

圖9 分子對接相互作用示意圖

3 討論

肝癌歸屬于中醫(yī)學“癥瘕”“積聚”“鼓脹”等范疇?！鹅`樞·水脹》中“鼓脹何如？岐伯曰：鼓脹身皆大，大與膚脹等也，色蒼黃，腹筋起，此其候也?！盵4]對肝癌的臨床表現(xiàn)進行了描述，而其病因病機則主要為“虛”“毒”“瘀”[5]。雷公藤為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，現(xiàn)代藥理學作用主要包括抗炎、抗腫瘤及免疫抑制等[6-7]。既往研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤可通過調(diào)控細胞生長周期、血管內(nèi)皮生長因子受體、血管生成、細胞增殖和凋亡等機制發(fā)揮抗腫瘤作用[8-9]。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法進行“雷公藤-活性成分-靶點-肝癌”網(wǎng)絡構建與分析，發(fā)現(xiàn)雷公藤治療肝癌的主要活性成分為山柰酚、雷公藤甲素、川陳皮素、β-谷甾醇、豆甾醇。研究表明，山柰酚可通過促進P62的沉積及誘導凋亡經(jīng)典途徑中NLRP3的合成，從而抑制HepG2肝癌細胞增殖、自噬并誘導其凋亡[10]。雷公藤甲素亦可通過調(diào)控HIF-1α介導的糖酵解途徑[11]、降低肝癌側群細胞成球及成瘤能力[12]抑制肝癌細胞增殖。川陳皮素[13]可顯著抑制肝癌細胞增殖，使細胞停滯在G2/M期，誘導其發(fā)生濃度依賴性凋亡。β-谷甾醇可抑制肝癌細胞生長，并通過線粒體途徑及膜死亡受體途徑誘導細胞凋亡[14]。β-谷甾醇、豆甾醇均可明顯抑制肝癌細胞增殖，使細胞形態(tài)發(fā)生典型凋亡變化[15]。而分子對接結果顯示，山柰酚、雷公藤甲素與關鍵靶點JUN、PTGS2結合活性較好，說明雷公藤可能主要通過山柰酚、雷公藤甲素發(fā)揮抗肝癌作用。

本研究發(fā)現(xiàn)雷公藤治療肝癌的關鍵靶點為AKT1、VEGFA、CXCL8、JUN、PTGS2。研究表明，雷公藤紅素可抑制AKT/c-Met肝癌小鼠AKT/mTORC1/FASN通路及ERK1/2的磷酸化，進而抑制肝癌細胞異常增殖發(fā)揮抗肝癌作用[16]。miR-16-5p[17]、miR-206[18]靶向VEGFA可抑制HepG2肝癌細胞增殖、侵襲、遷移及EMT過程，而USP22[19]可通過上調(diào)VEGFA基因轉錄促進肝癌細胞增殖、腫瘤生長及血管生成擬態(tài)。研究表明，肝癌患者血清中CXCL8呈高表達，CXCL8/CXCR1信號軸可通過激活PI3K/Akt/NF-κB信號通路促進肝癌細胞存活以及發(fā)生侵襲轉移，而細胞免疫治療則可下調(diào)CXCL8、CXCR1/2的過度表達，降低過度分泌CXCL8所致的炎癥反應，發(fā)揮抗癌作用[20]。抑制JNK/c-Jun信號通路可抑制轉錄因子AP-1的活性，從而抑制肝癌細胞的增殖侵襲轉移[21]。研究表明，PTGS2的消融會逆轉T細胞排斥，并使腫瘤對免疫治療敏感[22]，而目前關于雷公藤通過影響PTGS2來發(fā)揮抗肝癌作用的研究未見報道，而PTGS2作為雷公藤發(fā)揮抗肝癌作用的關鍵靶點，值得深究。

本研究顯示，潛在治療靶點主要涉及酰胺結合、肽結合、DNA結合轉錄因子結合等生物學過程，并主要富集于卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、乙型肝炎、流體剪切應力和動脈粥樣硬化等信號通路中。既往研究表明，以氟喹諾酮骨架為酰胺基功能修飾基，以酰胺基為氟喹諾酮C-3位羧基的生物電子等排體設計合成的氟喹諾酮-3-N-酰胺類化合物的抗腫瘤活性均顯著強于母體[23]?？úㄎ魅饬鱿嚓P皰疹病毒感染與卡波西肉瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤發(fā)病相關密切[24]，且卡波西肉瘤相關皰疹病毒K12基因體外可轉化小鼠成纖維細胞系NIH3T3細胞，體內(nèi)可誘導腫瘤的形成[25]。研究表明，我國肝癌的發(fā)生主要與乙肝病毒感染有關，其已成為誘發(fā)肝癌的獨立危險因素[26-27]。

綜上所述，通過網(wǎng)絡藥理學的研究方法及分子對接技術構建“雷公藤-活性成分-靶點-肝癌”互作網(wǎng)絡，對雷公藤多成分、多靶點、多通路進行分析，初步驗證了雷公藤治療肝癌的基本藥理學作用和作用機制，為雷公藤治療肝癌的進一步研究提供思路。然而網(wǎng)絡藥理學研究無論是數(shù)據(jù)挖掘、藥物與靶點相似性算法等，都存在諸多不足，如藥物與靶點關聯(lián)性差，靶點數(shù)據(jù)庫信息不全，相似性算法精度不高等[28-29]。因此，高標準、高精度、高智能化的中藥化學數(shù)據(jù)庫以及靶點預測工具，多成分、多靶點、多途徑的數(shù)據(jù)挖掘技術，并結合體內(nèi)實驗驗證，將是今后中藥網(wǎng)絡藥理學研究發(fā)展的主要方向。