吳鑫，黃新蕎，舒健*，蘇松，周鐵軍

膽管癌是一種具有膽管細(xì)胞分化特征的上皮性腫瘤，分為肝內(nèi)型與肝外型[1]。肝外膽管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma，EHCC)的預(yù)后差，根治性手術(shù)是其治療的主要方式，但術(shù)后3 年復(fù)發(fā)率約為54%[2]，5 年生存率約為40%[3]。對(duì)于晚期或不可切除的患者，局部和全身化療是主要的治療手段[4]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展伴隨著血管生成，血管生成影響膽管癌患者的治療策略及預(yù)后[5]，微血管密度(microvessel density，MVD)是反映新生血管生成量的指標(biāo)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被認(rèn)為是血管生成的關(guān)鍵因子[6]。DWI 為臨床廣泛應(yīng)用的MRI 功能成像技術(shù)，通過(guò)測(cè)量活體組織中水分子的擴(kuò)散能力，可以反映組織學(xué)的細(xì)微結(jié)構(gòu)變化[7]。目前已有DWI 評(píng)估腫瘤血管生成的報(bào)道[8-9]，但在EHCC 的MVD 和VEGF 的研究相對(duì)較少。筆者通過(guò)分析表觀擴(kuò)散系數(shù)(apparent diffusion coefficient，ADC)值與MVD、VEGF、分化程度及腫瘤位置的關(guān)系，探討DWI技術(shù)在EHCC術(shù)前評(píng)估中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2011 年8 月至2017 年12 月88 例行腫瘤切除，經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)且術(shù)前2周行上腹部MRI檢查(包括DWI序列)的EHCC 患者。其中男48 例，女40 例，年齡29～84 歲，平均(57.5±10.3)歲。本研究經(jīng)過(guò)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：KY201963)，免除受試者知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受根治性切除術(shù)或胰十二指腸切除術(shù)且病理明確為EHCC 的患者；(2)檢查前未行手術(shù)或放化療；(3)臨床、病理及術(shù)前MRI資料均完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)非肝外膽管起源的腫瘤；(2)圖像模糊影響ADC值測(cè)量者。

1.2 掃描設(shè)備及參數(shù)

使用飛利浦(Philips Achieva，Holland) 3.0 T 超導(dǎo)MR，體部16通道Torso線圈。所有患者禁食4～8 h，行屏氣訓(xùn)練，屏氣差者采用呼吸觸發(fā)掃描。各成像序列均應(yīng)用敏感性編碼技術(shù)(sensitivity encoding，SENSE)。掃描序列主要包括軸位雙回波化學(xué)位移T1WI、軸位T1 高分辨各向同性容積檢查、軸位呼吸觸發(fā)快速自旋回波脂肪抑制T2WI、軸位DWI、冠狀位T2WI、MR膽胰管成像及3期動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描。DWI序列采用呼吸觸發(fā)單脈沖快速自旋回波-平面回波成像，b值=0、800 s/mm2，TR 取最短(shortest)，TE 70 ms，矩陣128×256，F(xiàn)OV 375 mm×300 mm，層厚7 mm，層間隔1 mm，平均信號(hào)激勵(lì)次數(shù)4 次。掃描范圍：膈頂至十二指腸水平部下緣。

1.3 圖像分析及ADC測(cè)量

圖像由2 名具有5 年以上工作經(jīng)驗(yàn)的放射科醫(yī)師采用雙盲法在飛利浦MR工作站(R2.6.3.1)進(jìn)行后處理。首先通過(guò)各序列明確病灶位置，然后在放大且清晰的DWI (b=800 s/mm2；圖1A)中找出病灶區(qū)域勾畫(huà)ROI，ROI 盡可能包含多的腫瘤實(shí)性部分，注意避開(kāi)鄰近擴(kuò)張膽管、血管及壞死區(qū)域，再將ROI復(fù)制到對(duì)應(yīng)ADC 圖(圖1B)中自動(dòng)計(jì)算出ADC 值，測(cè)量3 次取平均值。兩位醫(yī)師測(cè)量的平均值作為病灶最終的ADC 值。ROI平均面積約77.04 mm2。

1.4 病理資料

根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Carcer，AJCC)，EHCC 可分為高、中、低分化[10]。所有病理標(biāo)本經(jīng)免疫組織化學(xué)染色，使用Weidner 法計(jì)數(shù)MVD[11]。MVD 計(jì)數(shù)：于低倍鏡(×40)下觀察并選取腫瘤血管最密集區(qū)，然后在高倍鏡( ×200)下計(jì)數(shù)3～5 個(gè)血管最高密度區(qū)的微血管數(shù)，取均值表示為MVD。VEGF 表達(dá)分級(jí)：于顯微鏡下(×100)觀察切片并明確陽(yáng)性細(xì)胞分布密集處，然后換高倍鏡(×200)選擇3 個(gè)視野，其中胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色判定為陽(yáng)性細(xì)胞，然后計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞即未表達(dá)(－)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在0～25%即低表達(dá)(+)，25%～50%即中度表達(dá)(++)，＞50%即高表達(dá)(+++)，其中前兩者被視為表達(dá)陰性，后兩者被視為表達(dá)陽(yáng)性。標(biāo)本分析由2 名具有5 年以上工作經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師獨(dú)立完成，對(duì)于定性資料，如有差異經(jīng)討論達(dá)成一致意見(jiàn)；對(duì)于定量資料，則取平均值作為最終值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以Kappa 系數(shù)評(píng)估2 名病理科醫(yī)師觀察VEGF 表達(dá)的一致性。以組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intraclass correlation coefficient，ICC)評(píng)價(jià)2 名病理科醫(yī)師測(cè)量MVD 計(jì)數(shù)的一致性。ADC 值與MVD 的相關(guān)性采用spearman 等級(jí)相關(guān)分析。ADC 值在不同VEGF 表達(dá)、腫瘤位置的差異性檢驗(yàn)采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。ADC 值在不同分化程度間的差異性檢驗(yàn)采用非參數(shù)Kruskal-Wallis H 秩和檢驗(yàn)，并進(jìn)行組間兩兩比較。繪制受試者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線以評(píng)估ADC 值區(qū)分VEGF 表達(dá)、高及低分化組的效能。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

EHCC 典型MR-DW I 表現(xiàn)為不同程度高信號(hào)，而ADC 圖上為低信號(hào)(圖2)。

2 名病理科醫(yī)師觀察VEGF 表達(dá)的Kappa 值=0.814 (P＜0.05)，測(cè)量MVD 計(jì)數(shù)的ICC=0.965 (P＜0.05)，說(shuō)明觀察者間具有較好的一致性。

88 例病灶A(yù)DC 值的中位值為1.308 (0.925～1.951)×10-3mm2/s，平均MVD 為56.49±28.05，兩者間存在顯著負(fù)相關(guān)性(rs=-0.726，P＜0.05)。

VEGF表達(dá)陰性46例，陽(yáng)性42例，不同VEGF表達(dá)EHCC病灶的ADC 值見(jiàn)表1。VEGF 表達(dá)陰性組與陽(yáng)性組的ADC 值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=406.50，P＜0.05)。ADC值＜1.291×10-3mm2/s預(yù)測(cè)VEGF表達(dá)陽(yáng)性的AUC為0.790(圖3)，敏感度、特異度分別為71.43%、78.26%。

圖3 ADC 值預(yù)測(cè)VEGF 陽(yáng)性表達(dá)的ROC 曲線(AUC=0.790) 圖4 ADC 值預(yù)測(cè)高分化肝外膽管癌的ROC 曲線(AUC=0.986) 圖5 ADC值預(yù)測(cè)低分化肝外膽管癌的ROC曲線(AUC=0.998)

88 例EHCC 中，高分化31 例，中分化38 例，低分化19 例，高、中、低分化組ADC 值隨分化程度降低逐漸減小(表1)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=72.51，P＜0.05)，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ADC 值＞1.319×10-3mm2/s 預(yù)測(cè)高分化癌的AUC 為0.986 (圖4)，敏感度、特異度分別為96.77%、89.47%，ADC 值＜1.184×10-3mm2/s 預(yù)測(cè)低分化癌的AUC 為0.998(圖5)，敏感度、特異度分別為100%、97.10%。

表1 不同VEGF表達(dá)、分化程度和腫瘤位置間EHCC的ADC值

88 例EHCC 中，肝門(mén)部膽管癌42 例，遠(yuǎn)端膽管癌46 例，ADC 值在不同腫瘤位置的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=935.50，P＞0.05)。

3 討論

DWI 為MRI 的功能成像技術(shù)，可以通過(guò)非侵入的方式獲取活體組織中水分子的運(yùn)動(dòng)情況，提供有關(guān)病理及生理改變的信息[7]。DWI 的定量ADC 值反映水分子擴(kuò)散受限程度，主要受腫瘤細(xì)胞影響，與腫瘤中的細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān)[12]，原理是腫瘤細(xì)胞增殖旺盛，排列緊密，導(dǎo)致擴(kuò)散受限。除了細(xì)胞密度，細(xì)胞大小、細(xì)胞外成分(如膠原纖維、細(xì)胞外基質(zhì))及一些細(xì)胞內(nèi)因素(如核漿比、胞漿黏滯性)、血流等也會(huì)對(duì)ADC 值產(chǎn)生影響[13-14]。因此，腫瘤微觀結(jié)構(gòu)上的差異可以通過(guò)DWI 信號(hào)及ADC值表現(xiàn)出來(lái)。

血管生成對(duì)膽管癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，大量新生血管為腫瘤提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)支持并排出代謝廢物。MVD、VEGF與肝門(mén)部膽管癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，MVD 值高、VEGF 陽(yáng)性表達(dá)患者的生存率更低[15]。關(guān)于ADC值與血管生成的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外研究對(duì)部分實(shí)體瘤進(jìn)行了分析。Cong等[8]回顧性分析52例食管癌患者，發(fā)現(xiàn)VEGF 表達(dá)與ADC 值之間存在負(fù)相關(guān)(r=-0.321，P＜0.05)，鮑志國(guó)等[9]收集160例乳腺癌患者，發(fā)現(xiàn)ADC 值 與MVD 及VEGF 均 呈 負(fù) 相 關(guān)(r=-0.568，P＜0.05;r=-0.522，P＜0.05)。與上述報(bào)道不同，最近的一篇Meta 分析[12]納入14 篇不同腫瘤ADC 值與VEGF 相關(guān)性分析的研究，發(fā)現(xiàn)部分報(bào)道結(jié)果相互矛盾，所有腫瘤的合并相關(guān)系數(shù)r=0.02，因此認(rèn)為DWI 在檢測(cè)腫瘤血管生成的微觀結(jié)構(gòu)方面不夠敏感，但該分析也指出部分報(bào)道的不同結(jié)果可能是由腫瘤類型的差異引起的，此外，不同掃描儀及DWI 序列可能對(duì)ADC 值有影響，可能導(dǎo)致偏差。由于腫瘤具有異質(zhì)性、復(fù)雜性，不同腫瘤的血管生成可能存在一定差異，這也可能是引起上述結(jié)果相互矛盾的因素，因此不同腫瘤可能需要單獨(dú)分析。本研究納入88 例EHCC 患 者，發(fā) 現(xiàn)ADC 值 與MVD 呈 負(fù) 相 關(guān)(rs=-0.726，P＜0.05)，VEGF 表達(dá)陽(yáng)性組ADC 值明顯低于陰性組(P＜0.05)，結(jié)果與王余等[16]一致。此外，根據(jù)ROC 曲線，本研究得出預(yù)測(cè)VEGF 表達(dá)陽(yáng)性的ADC 診斷閾值為1.291×10-3mm2/s，AUC 為0.790。MVD 值較高及VEGF表達(dá)陽(yáng)性者ADC 值較低可能與以下因素有關(guān)：豐富的新生血管使腫瘤增殖活躍，細(xì)胞排列緊密、密度增加；VEGF 增加腫瘤血管通透性，蛋白質(zhì)和其他大分子從血管進(jìn)入腫瘤間質(zhì)，導(dǎo)致間質(zhì)壓增高[17]；腫瘤血管扭曲、紊亂，直徑不均勻，血管的結(jié)構(gòu)異常使腫瘤血流效率低下，此外，生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞以及腫瘤中的高間質(zhì)液壓力可能會(huì)壓迫血管，導(dǎo)致血管塌陷，從而進(jìn)一步減少流量[17-18]。以上因素均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的水分子擴(kuò)散受限，從而使ADC值減低。

分化程度是影響膽管癌患者總生存時(shí)間的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，低分化癌預(yù)后較中、高分化癌預(yù)后差[19]。隨著分化程度降低，腫瘤惡性程度增加，腫瘤細(xì)胞增殖加快，細(xì)胞密度、核漿比增加，細(xì)胞內(nèi)、外間隙變窄，抑制水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致ADC 值減低。本研究結(jié)果顯示，高、中、低分化組ADC值隨分化程度降低逐漸減小，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與既往研究結(jié)果一致[16,20-21]。此外，ROC曲線顯示，預(yù)測(cè)高及低分化癌的ADC 診斷閾值分別為1.319×10-3mm2/s 和1.184×10-3mm2/s，AUC 分別為0.986、0.998。EHCC 的生長(zhǎng)部位(肝門(mén)部膽管和遠(yuǎn)端膽管)可能對(duì)術(shù)后生存率有一定影響[22]。本研究中肝門(mén)部膽管癌42 例，遠(yuǎn)端膽管癌46 例，分析結(jié)果顯示，ADC 值在不同腫瘤位置的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=935.50，P＞0.05)，提示EHCC 的生物學(xué)行為不一定與其生長(zhǎng)部位有關(guān)。

本研究的局限性：手動(dòng)勾畫(huà)EHCC 病灶的ROI 可能存在誤差；盡管ROI 選擇腫瘤的最大層面，但DWI 圖像與病理切片不一定完全對(duì)應(yīng)；EHCC相對(duì)罕見(jiàn)導(dǎo)致本研究樣本量相對(duì)較小。

綜上所述，MR-DWI有希望判斷EHCC病灶MVD、VEGF的表達(dá)及分化程度，對(duì)治療方案的選擇以及術(shù)前評(píng)估有重要的臨床意義。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無(wú)利益沖突。