周靖垚， 張建國(guó)

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093)

真核細(xì)胞的單膜細(xì)胞器過(guò)氧化物酶體的形成和吞噬是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[1-2]。與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等單膜細(xì)胞器單獨(dú)能合成蛋白質(zhì)不同，過(guò)氧化物酶體則需從細(xì)胞質(zhì)中獲取基質(zhì)蛋白和膜蛋白。過(guò)氧化物酶體的最大直徑為1 μm[3]，不僅在多種代謝途徑中發(fā)揮重要作用，而且其功能和形態(tài)會(huì)根據(jù)外部環(huán)境和自身需求的改變而變化[4-6]。過(guò)氧化物酶體最具代表性的功能為脂肪酸β-氧化和過(guò)氧化氫的酶解[5]。過(guò)氧化物酶體的必需基因pex編碼的過(guò)氧化物酶蛋白(Peroxins，不包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子)與過(guò)氧化物酶體的生成密切相關(guān)。由于人細(xì)胞中過(guò)氧化物酶體的pex基因會(huì)發(fā)生突變從而引起多種疾病，如過(guò)氧化物酶體生成障礙(PBDs)[7-9]。酵母具有過(guò)氧化物酶體含量高、穩(wěn)定性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)是研究過(guò)氧化物酶體的良好模型。因此，以酵母為模型進(jìn)行過(guò)氧化物酶體突變體研究對(duì)多種與過(guò)氧化物酶體相關(guān)疾病的預(yù)防和治療有重要意義。目前已鑒定的36個(gè)pex基因(表1)的功能大致分為三類：基質(zhì)蛋白導(dǎo)入、過(guò)氧化物酶體生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體的大小或豐度[3-4,7]。酵母的大多數(shù)過(guò)氧化物酶體突變體，如pex1、pex2、pex6、pex8、pex13、pex14等，仍含有過(guò)氧化物酶體殘留物[5,8，10]。這是由于部分過(guò)氧化物酶體膜(含有膜蛋白PMP)被運(yùn)輸?shù)竭^(guò)氧化物酶體中，形成殘?bào)w。而pex3突變體和pex19突變體沒(méi)有過(guò)氧化物酶體膜殘留[11]，并且回補(bǔ)pex3和pex19后細(xì)胞可重新生成功能化的過(guò)氧化物酶體[12-13]。這說(shuō)明細(xì)胞不僅通過(guò)生長(zhǎng)和分裂的方式增加過(guò)氧化物酶體數(shù)量，還可通過(guò)自身從頭合成的方式形成新的過(guò)氧化物酶體。因此，pex3和pex19被確定為過(guò)氧化物酶體膜早期合成的關(guān)鍵基因?；谶^(guò)氧化物酶體的形成取得了大量研究成果，本文總結(jié)了過(guò)氧化物酶體的起源和細(xì)胞生成過(guò)氧化物酶體的研究進(jìn)展，初步闡述過(guò)氧化物酶體的形成機(jī)制，為預(yù)防和治療與過(guò)氧化物酶體相關(guān)的疾病提供參考。

表1 pex基因在過(guò)氧化物酶體的作用

1 過(guò)氧化物酶體起源

傳統(tǒng)意義上認(rèn)為過(guò)氧化物酶體起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum，ER)和線粒體(Mitochondrion)，并逐步發(fā)展為成熟的過(guò)氧化物酶體[14]。過(guò)氧化物酶體的形成過(guò)程先由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)芽生，再以小泡形式運(yùn)送至高爾基復(fù)合體進(jìn)行加工和分選，最后在高爾基的反面(成熟面)以分泌泡的形式釋放而成。Agrawal等[15]和Novikoff等[16]在過(guò)氧化物酶體附著于豚鼠腎小管細(xì)胞中的某個(gè)特定區(qū)域發(fā)現(xiàn)了光滑的ER莖狀結(jié)構(gòu)，其實(shí)是囊泡狀的過(guò)氧化物酶體與ER相連，證實(shí)過(guò)氧化物酶體生成與ER有關(guān)。在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有多種過(guò)氧化物酶體膜蛋白(PMP)通過(guò)ER運(yùn)至過(guò)氧化物酶體[17]。大多數(shù)過(guò)氧化物酶體膜脂質(zhì)在ER中合成，由ER轉(zhuǎn)運(yùn)或者通過(guò)泡囊運(yùn)輸至過(guò)氧化物酶體[18-19]。David等[20]提出過(guò)氧化物酶體膜通過(guò)ER上含PMP的囊泡出芽，并且ER形狀也影響過(guò)氧化物酶體繁殖，pex30位于與過(guò)氧化物酶體緊密關(guān)聯(lián)的ER亞結(jié)構(gòu)中。 在ER亞結(jié)構(gòu)域中建立與過(guò)氧化物酶體的接觸位點(diǎn)，過(guò)氧化物酶體增殖依賴于管狀的完整性，因此ER亞結(jié)構(gòu)的形狀也會(huì)影響過(guò)氧化物酶體繁殖。ER亞結(jié)構(gòu)會(huì)逐步形成新的過(guò)氧化物酶體。畢赤酵母在只有少量葡萄糖或甘油的培養(yǎng)基中，只會(huì)產(chǎn)生幾個(gè)體積很小的過(guò)氧化物酶體。當(dāng)碳源轉(zhuǎn)為甲基營(yíng)養(yǎng)物時(shí)，過(guò)氧化物酶體會(huì)進(jìn)一步組裝、分裂并且成為占有80%細(xì)胞體積的細(xì)胞器。過(guò)氧化物酶體作為受體接受過(guò)氧化物酶體分裂和組裝過(guò)程的PMP和內(nèi)容物，使過(guò)氧化物酶體成熟并能代謝甲基營(yíng)養(yǎng)物(圖1)。由圖1可見(jiàn)，前過(guò)氧化物酶體囊泡從ER出芽，協(xié)同線粒體相關(guān)蛋白(DRP)和線粒體動(dòng)力樣蛋白(DLP)等相關(guān)因子，它們提供動(dòng)力等作用，在pex3、pex19共同作用下形成過(guò)氧化物酶體。畢赤酵母在利用甲醇發(fā)酵過(guò)程中，與基質(zhì)蛋白導(dǎo)入作用相關(guān)的基因進(jìn)行作用，過(guò)氧化物酶體變大，并進(jìn)行甲醇代謝。

圖1 畢赤酵母過(guò)氧化物酶體的成熟過(guò)程Fig.1 Maturation of peroxisome in Pichia pastoris

2 過(guò)氧化物酶體生成方式

過(guò)氧化物酶體的生成方式有以下兩種模型。第一種模型為過(guò)氧化物酶體通過(guò)ER生成，并發(fā)展為成熟的過(guò)氧化物酶體[21]，稱為從頭合成方式；第二種模型為細(xì)胞內(nèi)現(xiàn)存的過(guò)氧化物酶體吸收由ER提供的脂質(zhì)等物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)再進(jìn)行分裂[22]，稱為分裂方式。

2.1 從頭合成方式

基于解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)，研究者首次提出通過(guò)ER從頭合成過(guò)氧化物酶體的方式是由囊泡運(yùn)輸系統(tǒng)完成的[21]。當(dāng)過(guò)氧化物酶體以從頭合成的方式從ER出芽時(shí)，是以前過(guò)氧化物酶體囊泡(Pre-peroxisomal vesicles,ppVs)的狀態(tài)出現(xiàn)的，新產(chǎn)生的ppVs之間互相發(fā)生融合，融合后產(chǎn)生新的過(guò)氧化物酶體囊泡，融合前的囊泡和融合后的囊泡含有不同的蛋白亞群，這個(gè)結(jié)果也在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中得到了驗(yàn)證[23]。這兩類囊泡揭示了蛋白質(zhì)分選機(jī)制的存在。分選機(jī)制通過(guò)控制基質(zhì)蛋白進(jìn)入過(guò)氧化物酶體，直至出芽完成。ER的蛋白質(zhì)組成決定其形成前過(guò)氧化物酶體囊泡的蛋白質(zhì)成分。ER上的蛋白需要蛋白復(fù)合體的幫助先到達(dá)ppVs再由ppVs向過(guò)氧化物酶體進(jìn)行輸送，蛋白復(fù)合體由識(shí)別ER蛋白質(zhì)組分(例如PEX1、PEX5、PEX7)和RING(鋅指型結(jié)構(gòu)域，例如PEX2、PEX10、PEX12組成的泛素化復(fù)合物)構(gòu)成。新產(chǎn)生囊泡融合后形成具備運(yùn)輸能力的過(guò)氧化物酶體。融合過(guò)程中，前過(guò)氧化物酶體囊泡不能與成熟過(guò)氧化物酶體融合，這保證了成熟過(guò)氧化物酶體中有正確的蛋白質(zhì)組分。過(guò)氧化物酶體中AAA型ATPase PEX1/PEX6復(fù)合物負(fù)責(zé)基質(zhì)蛋白進(jìn)入前過(guò)氧化物酶體囊泡[24]。因?yàn)檫@種多途徑運(yùn)輸機(jī)制也參與其他功能性復(fù)合物的組裝[25-26]，途徑多變、功能復(fù)雜，還可能是一種廣泛性的機(jī)制，PEX蛋白是如何影響過(guò)氧化物酶體生物發(fā)生途徑還需要進(jìn)行繼續(xù)研究。可以依靠檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的方法來(lái)進(jìn)行研究，例如采用可視化多色BiFC方法來(lái)比較蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，可視化的方法能夠反映在正常生理環(huán)境下生物發(fā)生途徑中蛋白質(zhì)之間的相互作用并且利用亞細(xì)胞進(jìn)行定位。

缺乏pex3或pex19的馬兜鈴歐格氏霉(Ogataeapolymorpha)的ppVs與ER(pn-ER)之間存在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[27]，這些ppVs在具有pex3或pex19的細(xì)胞中未被檢測(cè)到，表明缺少pex3和ATG1(自噬相關(guān)1)或pex19和ATG1的細(xì)胞也存在ppVs。當(dāng)缺乏pex3的細(xì)胞重新引入pex3并表達(dá)時(shí)，胞內(nèi)的ppVs可以成熟為功能性過(guò)氧化物酶體[28-29]。然而缺乏ppVs的細(xì)胞是如何形成新的過(guò)氧化物酶體，以及細(xì)胞由于缺乏ppVs時(shí)如何強(qiáng)制性地將不對(duì)稱過(guò)氧化物酶體分到子細(xì)胞中從而形成新的過(guò)氧化物酶體等現(xiàn)象還無(wú)法說(shuō)明，需要繼續(xù)研究?；谝陨闲畔?，過(guò)氧化物酶體通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從頭合成過(guò)程分為五步：①將PMP導(dǎo)入ER；②PMP到特定的pn-ER域內(nèi)分選；③包裝PMP和發(fā)芽到囊泡載體中；④攜帶了1組特定的互補(bǔ)PMP囊泡載體進(jìn)行融合；⑤組裝重要的復(fù)合體，然后導(dǎo)入基質(zhì)蛋白(圖2)。

2.2 分裂方式

通過(guò)對(duì)酵母過(guò)氧化物酶體突變體研究證實(shí),過(guò)氧化物酶體也能通過(guò)分裂的方式增殖[23,26-29]。過(guò)氧化物酶體通過(guò)基質(zhì)蛋白和膜組分的加入而體積變大，當(dāng)達(dá)到一定體積時(shí)，過(guò)氧化物酶體進(jìn)行不對(duì)稱分裂，形成兩個(gè)新的過(guò)氧化物酶體[21,30-32]。其中較小的過(guò)氧化物酶體繼續(xù)生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)異質(zhì)化的過(guò)氧化物酶體群[19]。過(guò)氧化物酶體生長(zhǎng)通過(guò)裂變協(xié)調(diào)，再通過(guò)囊泡將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到成熟的過(guò)氧化物酶體中。從頭合成過(guò)程中的囊泡不能與成熟的過(guò)氧化物酶體融合，所以分裂方式所使用的囊泡與從頭合成的囊泡截然不同。

過(guò)氧化物酶體的分裂增殖分為五步[23]：①過(guò)氧化物酶體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，膜加速生長(zhǎng)，體積變大；②過(guò)氧化物酶體膜的一側(cè)突出；③過(guò)氧化物酶體突出膜伸長(zhǎng)；④基質(zhì)蛋白進(jìn)入伸長(zhǎng)的膜；⑤原有的過(guò)氧化物酶體通過(guò)裂解方式形成單個(gè)過(guò)氧化物酶體(圖2)。

圖2 過(guò)氧化物酶體生物發(fā)生過(guò)程示意圖Fig.2 Schematic diagram of peroxisome biogenesis

首先，pex11介導(dǎo)過(guò)氧化物酶體裂變。裂變過(guò)程還需要線粒體相關(guān)蛋白(DRP)和線粒體動(dòng)力樣蛋白(DLP)等相關(guān)因子提供動(dòng)力[33]。裂變中，激活的pex11介導(dǎo)過(guò)氧化物酶體形態(tài)微管化，具備膜錨定功能的動(dòng)力相關(guān)蛋白在膜伸長(zhǎng)的部位富集，然后過(guò)氧化物酶體膜收縮，DRP被招募到細(xì)胞質(zhì)中促進(jìn)膜分裂形成新的過(guò)氧化物酶體。雖然裂變?cè)诜肿铀缴仙形吹玫搅己玫谋碚?，但在酵母中PEX11確實(shí)與FIS1(fission 1)發(fā)生相互作用，進(jìn)行磷酸化調(diào)節(jié)[26,28,34]，并且PEX11的寡聚狀態(tài)(單體與二聚體)對(duì)氧化還原反應(yīng)十分敏感，可以對(duì)成熟的過(guò)氧化物酶體分裂進(jìn)行協(xié)調(diào)[32]。

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，Sc)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris,Pp)和多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)都在同源位置S165/S173/S174出現(xiàn)Pex11磷酸化。在過(guò)氧化物酶體增殖情況下，Sc和Pp的pex11p磷酸化增加[27]。除了這些觀察結(jié)果外，酵母中pex11p的產(chǎn)生通過(guò)pex11基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控并且與過(guò)氧化物酶體生物發(fā)生有著緊密聯(lián)系，但仍不清楚是否以及如何通過(guò)快速信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)pex11p活性。有研究者提出，ScPex11在ER進(jìn)行磷酸化，而其他研究者通過(guò)研究過(guò)氧化物酶體形成中的作用，發(fā)現(xiàn)PpPex11磷酸化與裂變因子的募集有關(guān)[24,28]。除Pex11外，過(guò)氧化物酶體動(dòng)力相關(guān)蛋白DLP1/DRP1及其線粒體裂變因子Mff(mitochondrial fission factor)均已被磷酸化[25-26]。

過(guò)氧化物酶體的從頭合成模型和分裂增殖模型的主要區(qū)別在于，過(guò)氧化物酶體由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生還是通過(guò)自身的裂變產(chǎn)生。雖然這兩種途徑都能形成新的過(guò)氧化物酶體，但它們的不同點(diǎn)在于從頭生成方式動(dòng)力學(xué)較慢，但新產(chǎn)生的過(guò)氧化物酶體包含所有“新”物質(zhì)；而分裂方式動(dòng)力學(xué)更快，但細(xì)胞內(nèi)需要預(yù)先存在過(guò)氧化物酶體。

3過(guò)氧化物酶體兩種生長(zhǎng)機(jī)制的協(xié)調(diào)

考慮到碳源代謝和活性氧在過(guò)氧化物酶體生成中會(huì)有一定作用，會(huì)破壞蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，因此新生成的過(guò)氧化物酶體會(huì)受到細(xì)胞狀態(tài)和環(huán)境的影響。這些蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的破壞影響了過(guò)氧化物酶體起源的研究，導(dǎo)致持續(xù)性地存在差異。例如，過(guò)氧化物酶體從頭合成和分裂方式的共存問(wèn)題[35-37]。多形漢遜酵母pex25、pex11雙缺失菌株阻斷了從頭生成和裂變，不能形成過(guò)氧化物酶[9,38]。雙缺失菌株分別回補(bǔ)pex25、pex11基因并分別恢復(fù)了過(guò)氧化物酶體的從頭合成和裂變方式。說(shuō)明多形漢遜酵母擁有這兩種獨(dú)立的過(guò)氧化物酶體形成方式。這兩種方式分別受到遺傳和環(huán)境擾動(dòng)的影響[39-40]。

4 展 望

隨著研究的深入，酵母過(guò)氧化物酶體的兩種形成機(jī)制已經(jīng)被證實(shí)：從頭合成和分裂方式形成。但是，與過(guò)氧化物酶體形態(tài)和生長(zhǎng)繁殖相關(guān)的蛋白的作用和協(xié)調(diào)關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。目前，多種相似模式系統(tǒng)中的基因和蛋白質(zhì)分析表明跨物種甚至同一物種內(nèi)部的過(guò)氧化物酶體相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的作用均存在差異，可見(jiàn)過(guò)氧化物酶體的形成過(guò)程非常復(fù)雜，尤其內(nèi)部協(xié)調(diào)過(guò)程(包括從頭開(kāi)始)、調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體起始、裂變、輸入、蛋白質(zhì)降解和遺傳的活動(dòng)。近幾年來(lái)，已經(jīng)通過(guò)酵母與其他細(xì)胞合作并產(chǎn)生了關(guān)于過(guò)氧化物酶體動(dòng)力學(xué)過(guò)程的數(shù)據(jù)集[41-43]，有助于建立廣泛的過(guò)氧化物酶體通信的預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)模型。利用網(wǎng)絡(luò)模型建立蛋白質(zhì)相互作用模型，現(xiàn)階段研究者已經(jīng)可以利用酵母雙雜交系統(tǒng)、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR 和 G Protein)方法、雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecular Fluorescent Complimentary, BiFC)等可視化技術(shù)為確立蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)提供了可能。另外，酵母菌的pex基因突變與過(guò)氧化物酶體形態(tài)之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步完善?，F(xiàn)階段的酵母菌過(guò)氧化物酶體研究主要集中在pex基因突變的篩選、過(guò)氧化物酶體形態(tài)的控制、過(guò)氧化物酶體的形成動(dòng)力學(xué)和其形成的關(guān)鍵分子確認(rèn)。近年來(lái)，研究者們對(duì)過(guò)氧化物酶的結(jié)構(gòu)和功能的了解影響了對(duì)過(guò)氧化物酶體蛋白質(zhì)進(jìn)口機(jī)制的組成和結(jié)構(gòu)的看法。但是，對(duì)折疊甚至寡聚狀態(tài)下的蛋白質(zhì)如何跨過(guò)氧化物酶體膜轉(zhuǎn)運(yùn)的詳細(xì)機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。在過(guò)氧化物酶體膜中發(fā)現(xiàn)了足夠大并且可以容納折疊蛋白的蛋白質(zhì)通道[44]，可能為寡聚蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)提供初步思路和今后的研究方向。青霉素的合成過(guò)程涉及4個(gè)基因，其中ACVS(δ-(l-α-aminoadipyl)-l-cysteinyl-d-valine (ACV) synthetase)和IPNS(isopenicillin N synthase)編碼胞質(zhì)蛋白質(zhì)。pex3是過(guò)氧化物酶體定位所需要的基因，Dnm1是細(xì)胞器增殖需要的基因。產(chǎn)黃青霉的4個(gè)合成青霉素基因在多形漢遜酵母中表達(dá)后，成功合成青霉素。pex3突變導(dǎo)致青霉素合成量顯著下降[45]。而且pex11也影響青霉素的生成[46]。將這些發(fā)現(xiàn)綜合到過(guò)氧化物酶體生成的數(shù)學(xué)模型中，可以為生物過(guò)程控制和藥物開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。鑒于現(xiàn)階段建立PEX與酵母過(guò)氧化物酶體的體積之間的數(shù)學(xué)模型仍具有挑戰(zhàn)性，因此，需要發(fā)現(xiàn)更多的與過(guò)氧化物酶體形成相關(guān)的蛋白質(zhì)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展將有助于更精確闡述過(guò)氧化物酶體的形成機(jī)制，為預(yù)防過(guò)氧化物酶體相關(guān)疾病服務(wù)。