劉宜嵩,王壬,2,鈕成拓,2,鄭飛云,2,王金晶,2,李崎,2,劉春鳳,2*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214222) 2(江南大學(xué),釀酒科學(xué)與工程研究室,江蘇 無(wú)錫,214222)

熒光探針可針對(duì)特定的目標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)生熒光信號(hào),并達(dá)到分析檢測(cè)的目的。作為一種重要檢測(cè)手段,熒光探針的應(yīng)用范圍已擴(kuò)展至化學(xué)、環(huán)境以及生命科學(xué)等,并隨著學(xué)科間的交叉不斷拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。本文主要針對(duì)熒光探針在高通量篩選技術(shù)上的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)的綜述,分析了這一技術(shù)的特點(diǎn)以及存在的問(wèn)題,為這類快速且高效的篩選技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考依據(jù),對(duì)高通量篩選技術(shù)的發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。

1 熒光探針簡(jiǎn)介

18世紀(jì)中期,STOKES首次提出“熒光”的概念,對(duì)第一個(gè)定義明確的小分子熒光團(tuán)奎寧的發(fā)光過(guò)程進(jìn)行了解釋。1856年,PERKIN成功合成了熒光染料類化合物苯胺紫,拉開(kāi)了人工合成熒光染料的序幕[1]。1962年,SHIMOMURE等[2]從多管水母屬中分離得到了綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP),GFP作為最早被開(kāi)發(fā)的一類熒光探針在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[2]。在隨后的發(fā)展過(guò)程中,熒光探針從GFP向有機(jī)小分子熒光探針擴(kuò)展,第1個(gè)有機(jī)小分子熒光探針可追溯至20世紀(jì)80年代,學(xué)者們對(duì)熒光探針給出的準(zhǔn)確的定義為：熒光探針是一種分子器件,能夠選擇性的與客體分子通過(guò)化學(xué)或者物理之間的相互作用,產(chǎn)生熒光信號(hào),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定量與定性檢測(cè)客體分子的目的。隨著熒光探針檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展,針對(duì)不同種物質(zhì)具有功能特異性的熒光探針不斷涌現(xiàn),在近50年的發(fā)展過(guò)程中,熒光探針已被應(yīng)用于生物細(xì)胞成像、環(huán)境分析、食品科學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。近年來(lái)各類新型熒光探針的出現(xiàn)不斷拓寬這一技術(shù)的適用范圍,可檢測(cè)的物質(zhì)越來(lái)越廣泛,如金屬離子[3]、CO[4-6]、H2S[7]和甲醛[8]等。然而,各領(lǐng)域始終存在對(duì)可利用的新型熒光探針的需求,因此,設(shè)計(jì)并合成新型高效的熒光探針勢(shì)在必行。

1.1 熒光探針的組成

熒光探針一般由3個(gè)部分構(gòu)成：熒光基團(tuán)、識(shí)別基團(tuán)和連接基團(tuán),也有一些非典型結(jié)構(gòu)的熒光探針無(wú)連接基團(tuán)部分。

熒光基團(tuán)可以釋放出熒光信號(hào),實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)。熒光基團(tuán)的性質(zhì)決定了探針的靈敏度與準(zhǔn)確性,常用的熒光基團(tuán)包括：香豆素類、奈酰亞胺類、羅丹明類、熒光素類、苯并雙噻二唑類和氟硼二吡咯類等[9](圖1)。

圖1 常見(jiàn)熒光團(tuán)結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of common fluorophores

識(shí)別基團(tuán)對(duì)待測(cè)物質(zhì)具有特異性識(shí)別功能,識(shí)別效果決定了探針的選擇性和特異性。一般情況下,識(shí)別基團(tuán)與待測(cè)物可通過(guò)弱作用力或化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行結(jié)合,作用力包括范德華力、氫鍵、親疏水作用等,化學(xué)反應(yīng)可以是加成反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)等[5]。

熒光探針與目標(biāo)物相結(jié)合后將識(shí)別信息經(jīng)連接基團(tuán)傳遞給熒光基團(tuán),不同種熒光探針連接基團(tuán)形式多樣,最常見(jiàn)方式是利用共價(jià)鍵的形式將熒光基團(tuán)與識(shí)別基團(tuán)連接起來(lái)。

1.2 熒光探針的作用機(jī)理

熒光探針的作用機(jī)理如圖2所示。隨著研究的不斷深入,有關(guān)熒光探針作用機(jī)理的研究已經(jīng)有了很大進(jìn)展,主要包括以下幾種：

圖2 熒光探針機(jī)理示意圖Fig.2 Schematic diagram of fluorescent probe mechanism

(1)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(intramolecular charge transfer,ICT)[10]。ICT通過(guò)改變電子吸收能力、電子給體或是Π-共軛程度來(lái)與目標(biāo)物相互作用,導(dǎo)致吸收光譜變化,實(shí)現(xiàn)發(fā)射峰紅移或是藍(lán)移,這是目前熒光探針最常依據(jù)的原理。依據(jù)ICT設(shè)計(jì)的熒光探針也適用于黏度大的檢測(cè)環(huán)境。

(2)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(photoinduced electron transfer,PET)[11]。電子給體與受體之間通過(guò)橋梁連接,探針受光激發(fā)后,激發(fā)態(tài)的電子給體與電子受體之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致熒光猝滅發(fā)生；當(dāng)識(shí)別基團(tuán)與待測(cè)物結(jié)合后,會(huì)減弱識(shí)別位點(diǎn)供電子能力,阻斷PET效應(yīng),使熒光信號(hào)得以恢復(fù)。這一機(jī)理用于設(shè)計(jì)開(kāi)關(guān)型熒光探針。

(3)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)[12]。FRET包括一對(duì)熒光團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移,分別為能量供體和受體,當(dāng)能量的吸收與發(fā)射有一部分重疊且距離≤10 nm時(shí),就會(huì)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。FRET常用于設(shè)計(jì)比率型熒光探針。

(4)聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aggregation-induced emission,AIE)[13]。傳統(tǒng)的熒光染料在高濃度時(shí)會(huì)導(dǎo)致發(fā)光猝滅,而AIE分子在聚集狀態(tài)時(shí),由于分子的空間位阻作用,非輻射躍遷被阻斷,進(jìn)而引發(fā)聚集誘導(dǎo)發(fā)光。依據(jù)AIE設(shè)計(jì)的熒光探針可以解決熒光團(tuán)濃度過(guò)高而導(dǎo)致聚集猝滅的情況。

(5)激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(excited-state intramolecular proton transfer,EIPT)[14]。依據(jù)這一機(jī)理的熒光探針受到光、熱或電激發(fā)后,分子內(nèi)質(zhì)子受體和給體間發(fā)生質(zhì)子的轉(zhuǎn)移。這一類型的熒光探針由于斯托克斯位移較大,可避免在激發(fā)過(guò)程產(chǎn)生自重吸收和內(nèi)部過(guò)濾,但對(duì)環(huán)境十分敏感,需要提供疏水的膠束環(huán)境,如大量的有機(jī)溶劑。

1.3 熒光探針的分類

目前沒(méi)有統(tǒng)一的方法將熒光探針進(jìn)行分類,熒光探針的分類有多種形式,如按照材料、發(fā)射峰特性、發(fā)射波長(zhǎng)以及反應(yīng)類型等進(jìn)行分類。雖然目前分類較多,但這些分類方法相互交叉,對(duì)熒光探針的設(shè)計(jì)與制備有一定指導(dǎo)意義。

根據(jù)材料的不同可以分為：綠色熒光蛋白、納米材料以及有機(jī)小分子熒光探針。有機(jī)小分子熒光探針是近年來(lái)應(yīng)用最為廣泛的熒光探針,因其原理清晰、制備較易且成像效果好等優(yōu)點(diǎn)備受青睞。

另一種常見(jiàn)的分類方式是將熒光探針?lè)譃楸嚷市秃蛷?qiáng)度型。強(qiáng)度型熒光探針在檢測(cè)過(guò)程中有單個(gè)發(fā)射峰且有猝滅型和增強(qiáng)型2種類型[9]。比率型熒光探針利用2個(gè)發(fā)射峰的比值變化定量檢測(cè)目標(biāo)物,由于具有自校特點(diǎn)常應(yīng)用于擾動(dòng)較大的環(huán)境。

其他分類方式：根據(jù)發(fā)射波長(zhǎng)的不同分為可見(jiàn)光熒光探針和近紅外(near infrared,NIR)熒光探針；根據(jù)和目標(biāo)物反應(yīng)類型的不同分為反應(yīng)型和配位型；根據(jù)熒光探針吸收光子數(shù)目不同分為單光子熒光探針、雙光子熒光探針和多光子熒光探針；根據(jù)用途的不同分為pH熒光探針、金屬離子熒光探針和核酸熒光探針等；根據(jù)檢測(cè)樣品種類不同分為生物類和非生物類熒光探針。

2 熒光探針在高通量篩選技術(shù)上的應(yīng)用

高通量篩選技術(shù)(high-throughput screening,HTS)自20世紀(jì)90年代初次問(wèn)世以來(lái)得到迅猛發(fā)展。針對(duì)大量待測(cè)物的檢測(cè)和篩選,更高的篩選通量、更高的篩選效率以及小型化的檢測(cè)方法節(jié)約了許多時(shí)間和成本,極大地提高了科研效率。熒光探針以能夠與靶向目標(biāo)物結(jié)合并發(fā)生熒光性質(zhì)的改變?yōu)楹诵?在高通量篩選技術(shù)上的應(yīng)用越發(fā)誘人,并隨著熒光探針技術(shù)的發(fā)展在各領(lǐng)域有著一定的應(yīng)用潛力。

2.1 高通量篩選目的菌株

快速高效的高通量篩選系統(tǒng)可以一次性獲得大量信息,菌株的選育離不開(kāi)高通量篩選技術(shù)。例如,熒光探針在高通量篩選含脂質(zhì)酵母方面應(yīng)用比較廣泛。SITEPU等[15]為篩選含脂質(zhì)的酵母樣品,對(duì)已有的尼羅紅熒光探針檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn),改進(jìn)重點(diǎn)圍繞提高細(xì)胞膜通透性等方面,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明尼羅紅檢測(cè)胞內(nèi)脂質(zhì)的效率得到了提升,適當(dāng)降低尼羅紅的濃度也不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果,整套高通量篩選方法具有高效且低成本的特點(diǎn)。ROSTRON等[16]也將尼羅紅熒光分析法應(yīng)用于生物技術(shù)工業(yè)中快速篩選轉(zhuǎn)基因菌株,在研究中驗(yàn)證了其在低脂非油脂裂殖酵母野生型和缺失型菌株中脂質(zhì)含量檢測(cè)方面的應(yīng)用效果。近期也有研究將改進(jìn)的高通量尼羅紅熒光測(cè)定法用于快速篩選含脂質(zhì)酵母,將固體培養(yǎng)和熒光檢測(cè)相結(jié)合,使得整個(gè)篩選過(guò)程更簡(jiǎn)便、更高效[17]。除使用尼羅紅作為熒光探針外,CHOI等[18]開(kāi)發(fā)了親脂性熒光染料,用于對(duì)細(xì)胞內(nèi)的聚3-羥基丁酸酯進(jìn)行定量分析,可以染色活菌落,從而可以有效選擇聚3-羥基丁酸酯陽(yáng)性細(xì)胞,且熒光強(qiáng)度保持時(shí)間比尼羅紅更長(zhǎng),間接提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

尼羅紅熒光探針是典型的親脂性熒光探針,在胞內(nèi)脂質(zhì)檢測(cè)及含脂質(zhì)酵母篩選的過(guò)程中經(jīng)歷了熒光分析方法的優(yōu)化、溶劑的選擇、細(xì)胞預(yù)處理方式以及探針引入方式的探究等諸多階段。這也為其他熒光探針在高通量篩選方案優(yōu)化方面提供了一定的參考,如當(dāng)研究對(duì)象為胞內(nèi)物質(zhì)時(shí),可能遇到諸如探針的特異性、其他物質(zhì)的干擾以及熒光強(qiáng)度較弱等問(wèn)題,此時(shí)可參照上述研究中的策略進(jìn)行方法的調(diào)整和優(yōu)化。值得注意的是,選擇尼羅紅這一經(jīng)典熒光團(tuán)設(shè)計(jì)脂質(zhì)熒光探針,具有優(yōu)良性能的熒光團(tuán)若加以適當(dāng)?shù)难苌幚?可以提高與目標(biāo)物質(zhì)的特異性結(jié)合效率并展示出良好的熒光效果,將為熒光探針的選擇提供一條便捷的路徑。

除了對(duì)產(chǎn)脂質(zhì)酵母進(jìn)行篩選的應(yīng)用外,也有研究對(duì)高產(chǎn)聚蘋(píng)果酸酵母進(jìn)行高通量篩選,合成了以羅丹明為熒光團(tuán)的熒光探針,該熒光探針的熒光信號(hào)與聚蘋(píng)果酸含量之間具有良好的定量關(guān)系,可用于評(píng)價(jià)發(fā)酵液中聚蘋(píng)果酸的含量[19]。

熒光探針以其較高的靈敏度、反應(yīng)迅速以及便捷的操作在高通量篩選目的菌株上扮演重要角色,但國(guó)內(nèi)外的研究多集中在產(chǎn)脂質(zhì)酵母的篩選,不僅很少涉及其他性狀的酵母,而且也沒(méi)有其他微生物的應(yīng)用實(shí)例。據(jù)熒光探針設(shè)計(jì)方面的報(bào)道來(lái)看,各種類型的熒光探針,尤其是針對(duì)某種化合物的小分子熒光探針已經(jīng)有了比較成熟的制備理論和有效性驗(yàn)證,如硫醇、H2S、CO以及甲醛等[4-5,7,20]。因此可適當(dāng)拓展高通量篩選目的菌株的實(shí)際應(yīng)用范圍。

2.2 高通量篩選抗生素

pH熒光探針是熒光探針技術(shù)的重要應(yīng)用之一,利用pH熒光探針可以對(duì)抗生素藥物進(jìn)行高通量篩選?；趐H熒光探針篩選抗生素的研究思路為：細(xì)菌的生長(zhǎng)會(huì)使菌液酸化,pH熒光探針的熒光信號(hào)會(huì)隨著菌液的酸化而減弱,抗生素的加入則會(huì)使熒光信號(hào)減弱的程度降低。有學(xué)者依據(jù)該實(shí)驗(yàn)思路成功地制備了pH熒光探針,并在高通量篩選抗生素上進(jìn)行了應(yīng)用,PAN等[21]的研究主要集中在探針的水溶性上，SI等[22]開(kāi)發(fā)的熒光探針具有價(jià)格低廉、易于合成、高穩(wěn)定性、無(wú)毒且易于與基質(zhì)相結(jié)合的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)的熒光探針適用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞酸化以及抗生素高通量篩選。

以上兩者的研究更注重探針的實(shí)際應(yīng)用,也有研究注重于探針設(shè)計(jì),并展示出探針在高通量篩選抗生素上的應(yīng)用潛力。葉文等[23]制備了可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)pH的聚合物pH熒光探針并組合在微型反應(yīng)器上,在高通量篩選抗生素方面具有應(yīng)用價(jià)值。OTA等[24]開(kāi)發(fā)了一種基于FRET的核酸探針,該探針被源自液滴中細(xì)菌的核糖核酸酶裂解,導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增加,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該檢測(cè)方法具有高通量篩選抗生素的潛力[24]。

細(xì)菌菌液濃度通常用OD值表示,而熒光探針技術(shù)則具有較高的靈敏度,可在細(xì)菌生長(zhǎng)至平衡期時(shí)更好地體現(xiàn)細(xì)胞代謝的變化,熒光探針展示出其在高通量篩選過(guò)程中的“高質(zhì)量”。熒光探針在高通量篩選抗生素應(yīng)用的同時(shí)揭示了通過(guò)pH變化來(lái)篩選目標(biāo)物的巨大潛力,例如將細(xì)菌的新陳代謝活動(dòng)作為它們對(duì)抗菌藥物敏感性的指標(biāo),可篩選新的生長(zhǎng)抑制劑。

2.3 高通量篩選酶抑制劑

熒光探針在高通量篩選酶抑制劑方面有著廣泛的應(yīng)用。其原理與篩選抗生素類似,都是通過(guò)監(jiān)測(cè)外源物質(zhì)的引入對(duì)熒光信號(hào)的影響來(lái)實(shí)現(xiàn)篩選的目的。首先設(shè)計(jì)并制備一種與目標(biāo)酶進(jìn)行特異性結(jié)合的熒光探針,篩選過(guò)程中對(duì)熒光有抑制或增強(qiáng)作用的化合物則為酶抑制劑,也可以使用適當(dāng)?shù)暮瘮?shù)對(duì)抑制率進(jìn)行表達(dá)。

LI等[25]開(kāi)發(fā)了一種熒光探針來(lái)檢測(cè)內(nèi)源性細(xì)菌青霉素G?；D(zhuǎn)移酶(penicillin G acylases,PGA),使用基于新型熒光探針的高通量篩選技術(shù),發(fā)現(xiàn)齊墩果酸是潛在的PGA天然抑制劑,精確測(cè)定各種細(xì)菌的內(nèi)源PGA活性也為高通量篩選產(chǎn)PGA菌株提供依據(jù)。XU等[26]合成了2種谷氨酰胺酶(glutaminase,GLS)熒光探針,對(duì)構(gòu)建的含有三唑基的化合物文庫(kù)進(jìn)行交叉篩選,結(jié)果表明引入三唑基團(tuán)可以抑制GLS活性。此外,也有研究報(bào)道了利用熒光探針高通量篩選15-脂氧合酶、單?；视椭久浮-乙?；D(zhuǎn)移酶2以及胱硫醚β-合酶抑制劑的應(yīng)用[27-29]。總之,抑制劑和熒光探針之間競(jìng)爭(zhēng)酶的作用位點(diǎn),將熒光信號(hào)的變化作為篩選的依據(jù),與通過(guò)測(cè)定酶活力來(lái)篩選抑制劑相比優(yōu)勢(shì)明顯。值得注意的是,制備的熒光探針可以針對(duì)特定的一種酶或多種酶,其他類型的熒光探針也是如此,設(shè)計(jì)出針對(duì)某一種特定物質(zhì)的熒光探針實(shí)際上是有難度的,需要考慮熒光基團(tuán)與待測(cè)物的專一性,根據(jù)研究目的也可以設(shè)計(jì)某一類帶有相同的基團(tuán)的熒光探針。

有部分研究側(cè)重目標(biāo)酶熒光探針的設(shè)計(jì),涉及的酶包括金屬蛋白酶-整聯(lián)蛋白15、囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體2以及膜蛋白,研究重點(diǎn)闡述了熒光探針的合成原理、合成路線以及功能表征,展示出在高通量篩選酶抑制劑上的應(yīng)用前景[30-32]。制備理論的形成是突破性的一步,但還需要實(shí)際應(yīng)用來(lái)考察技術(shù)的實(shí)用性。

2.4 其他高通量篩選技術(shù)上的應(yīng)用

除高通量篩選目的菌株、酶抑制劑和抗生素外,熒光探針技術(shù)在其他高通量篩選技術(shù)方面也有一定應(yīng)用。ZHANG等[33]報(bào)道了一種新的膽固醇熒光探針,當(dāng)以高通量形式使用熒光探針時(shí),可在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)對(duì)膽固醇有影響的化學(xué)物質(zhì),這種膽固醇熒光探針提供了一種安全、靈敏且可重現(xiàn)的策略。ZHENG等[34]開(kāi)發(fā)了熒光高通量篩選方法測(cè)定脂肪酶的酯交換活性,用酶標(biāo)儀在96孔微孔板中可檢測(cè)熒光物質(zhì)濃度,日篩選樣品量可達(dá)9 200個(gè)。兩者的研究都是在已具備一定高通量篩選技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的方法優(yōu)化,熒光探針則為優(yōu)化方案中的關(guān)鍵。在驗(yàn)證過(guò)程中發(fā)現(xiàn),熒光探針篩選方法不僅與傳統(tǒng)篩選方法結(jié)果趨于一致,更重要的是檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單、靈敏度高、試劑廉價(jià)且對(duì)儀器要求低。

此外,高通量自動(dòng)流動(dòng)方法測(cè)定透析濃縮液中的痕量鋁、高通量篩選環(huán)境樣品中的甲狀腺激素破壞性化合物以及高通量篩選動(dòng)物毒液等,都展示出熒光探針在高通量篩選技術(shù)上良好的應(yīng)用效果[35-37]。國(guó)內(nèi)的研究則主要集中在醫(yī)藥方面的應(yīng)用。蘭小紅等[38]使用3種熒光探針建立了腎保護(hù)活性物質(zhì)的篩選方法,運(yùn)用高通量方法先對(duì)化學(xué)組分進(jìn)行篩選,再結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用得到具體的目標(biāo)物質(zhì),所建立的方法穩(wěn)定且可靠。吳雪莉等[39]對(duì)中成藥消渴安中二肽基肽酶-4抑制劑進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)丹酚酸C等對(duì)二肽基肽酶-4具有抑制作用,為了得到具體的物質(zhì),同樣需要結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方式,為篩選藥物中藥效物質(zhì)提供了實(shí)例,同時(shí)也是熒光探針在高通量篩選酶抑制劑方面的應(yīng)用。

3 結(jié)論與展望

熒光檢測(cè)技術(shù)是高通量篩選重要的方法之一,發(fā)展高通量篩選技術(shù)符合現(xiàn)代對(duì)科研效率的要求,熒光探針依靠與目標(biāo)物特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的轉(zhuǎn)變,極大地提高了篩選效率。目前已有多種熒光探針的設(shè)計(jì)方案被報(bào)道,尤其是有機(jī)小分子熒光探針具有廣闊的應(yīng)用前景。通過(guò)對(duì)近年來(lái)將熒光探針技術(shù)應(yīng)用于高通量篩選的研究進(jìn)行整理,可以投入實(shí)際應(yīng)用的熒光探針主要包括以下特點(diǎn)：(1)無(wú)需繁瑣的合成路線,有機(jī)小分子熒光探針在這一點(diǎn)上有一定優(yōu)勢(shì)；(2)熒光探針作用于目標(biāo)物時(shí)具備良好的相容性,熒光信號(hào)作為篩選依據(jù)靈敏度高且有效；(3)特異性強(qiáng),尤其對(duì)于檢測(cè)環(huán)境復(fù)雜或是體系中存在與目標(biāo)物官能團(tuán)相同的物質(zhì),低選擇性會(huì)使高通量篩選效率降低。

隨著熒光探針技術(shù)的不斷發(fā)展,學(xué)者們將熒光探針技術(shù)投入到高通量篩選的實(shí)際應(yīng)用上來(lái),但在應(yīng)用過(guò)程中還存在一定的問(wèn)題：(1)其他物質(zhì)會(huì)對(duì)反應(yīng)型熒光探針的作用效果造成干擾,提高選擇性,實(shí)現(xiàn)熒光探針與目標(biāo)物的特異性結(jié)合仍是亟待解決的問(wèn)題；(2)熒光探針的設(shè)計(jì)與制備需要進(jìn)行大量的理論研究和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),且常涉及到學(xué)科交叉,為了獲得合適的熒光探針一般需要對(duì)多種熒光探針進(jìn)行試驗(yàn),方法應(yīng)用高效但前期準(zhǔn)備工作量大；(3)除具備實(shí)驗(yàn)條件可自行制備熒光探針的研究外,目前一些將熒光探針應(yīng)用至高通量篩選技術(shù)上的研究需要從已成功制備的熒光探針中進(jìn)行篩選,識(shí)別基團(tuán)作為主要的選擇依據(jù)常會(huì)伴隨著特異性、靈敏度以及可視化等問(wèn)題,一定程度上制約了技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)程。

在食品發(fā)酵領(lǐng)域,利用熒光探針可對(duì)微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)等進(jìn)行檢測(cè),判斷熒光信號(hào)的強(qiáng)弱可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的菌株的高通量篩選,在篩選優(yōu)良菌株方面具有應(yīng)用潛力。在食品檢測(cè)分析領(lǐng)域,熒光探針可作為一種環(huán)境友好型檢測(cè)方法,避免使用大量的有機(jī)溶劑,減少對(duì)人體和環(huán)境的潛在不利影響,綠色檢測(cè)方法的應(yīng)用可在真正意義上做到從源頭杜絕食品污染。熒光探針檢測(cè)方法步驟簡(jiǎn)便且檢測(cè)效率高,具有快速性、準(zhǔn)確性及科學(xué)性等突出特點(diǎn),滿足當(dāng)下食品安全檢測(cè)需求,為食品中有毒有害物質(zhì)的檢測(cè)提供了有效方法。此外,熒光探針是一種功能性較強(qiáng)的檢測(cè)分析工具,快速檢測(cè)試劑盒的研發(fā)則可以提高實(shí)際應(yīng)用的效率,實(shí)現(xiàn)在食品加工、保藏、貯運(yùn)以及市場(chǎng)監(jiān)控等方面的高效快速檢測(cè)。本文為熒光探針應(yīng)用至高通量篩選領(lǐng)域提供了一定線索,特別是對(duì)探針選擇以及篩選思路的構(gòu)建進(jìn)行了分析和闡述。