焦涵,陳杰,顧璐萍,常翠華,李俊華,董世建,楊嚴俊,蘇宇杰*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 2(國家功能食品工程技術(shù)研究中心(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 3(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 4(榮達禽業(yè)股份有限公司,安徽 廣德,242200)

蛋黃中富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì),具有很高的營養(yǎng)價值,同時還具有優(yōu)良的乳化性、凝膠性等功能特性,是一種具有極高應(yīng)用價值的食品原料[1]。蛋黃卵磷脂是蛋黃中一種重要的功能活性成分,因其具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善神經(jīng)功能、抗氧化等功能[2],在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)應(yīng)用前景廣闊。隨著蛋品精深加工技術(shù)的發(fā)展,對蛋黃卵磷脂的工業(yè)化提取技術(shù)的研究與應(yīng)用不斷深入。然而現(xiàn)有工藝在提取蛋黃中優(yōu)質(zhì)卵磷脂的同時會產(chǎn)生大量的脫脂蛋黃粉副產(chǎn)品,由于在提取過程中使用了酒精等有機溶劑[3-4],脫脂蛋黃粉中的蛋白嚴重變性,其原有功能特性基本喪失,應(yīng)用價值顯著降低,目前大多只能用作動物飼料,造成蛋白資源的極大浪費。如何對提取卵磷脂之后的低值脫脂蛋黃粉副產(chǎn)品進行深入利用,提高原料利用效率和產(chǎn)品附加值成為目前蛋品深加工行業(yè)亟待解決的問題之一。

近年來,許多學(xué)者已從雞蛋黃中分離得到了多種活性多肽,目前已發(fā)現(xiàn)卵黃蛋白活性肽具有抗氧化[5]、降血壓[6]、促進礦物質(zhì)元素吸收[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]等多種生理功能,可廣泛地應(yīng)用于食品、保健品和藥品等相關(guān)領(lǐng)域[9]。然而現(xiàn)有對于卵黃多肽的研究主要集中在其功能性方面[10],而對于卵黃多肽的制備工藝,主要集中在實驗室規(guī)模對酶解工藝的優(yōu)化等方面,并且研究采用的原料多為經(jīng)索氏提取法制備的脫脂蛋黃粉,這種蛋黃粉的變性程度相對較低,性質(zhì)與工業(yè)化提取卵磷脂后剩余的脫脂蛋黃粉相差較大。

本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,采用工業(yè)上提取蛋黃卵磷脂后剩余的變性嚴重的脫脂蛋黃粉為原料,進行卵黃多肽的制備及脫色工藝研究,并對工藝進行優(yōu)化,以期提供一種適合于工業(yè)化生產(chǎn)的卵黃多肽制備與脫色方法,從而使低值脫脂蛋黃粉副產(chǎn)品得到有效利用,提高脫脂蛋黃粉的產(chǎn)品附加值,拓寬蛋黃產(chǎn)品深加工產(chǎn)業(yè)鏈。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：提取蛋黃卵磷脂后剩余的脫脂蛋黃粉(自制)。

中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、95%乙醇、NaOH、鹽酸、H2SO4、CuSO4·5H2O、K2SO4、去離子水、活性炭、硅藻土,所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AB204-N分析天平、pH計,梅特勒-托利多儀器公司；VCX500超聲細胞破碎儀,Sonics公司；DKY-11 恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床,上海社科自動化設(shè)備有限公司；S3500激光粒度分析儀,美國Microtrac公司；UH5300紫外分光光度計,日本日立公司；K9840微量凱氏定氮儀,濟南海能儀器股份有限公司；5430R冷凍離心機,德國Eppendrof公司；SD-1500立式噴霧干燥機,上海沃迪科技有限公司；1260自動氨基酸分析儀,美國Agilent公司；GST-3-1200馬弗爐,上海廣樹機電有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 卵黃多肽制備工藝

卵黃多肽制備工藝如圖1所示。

圖1 工藝流程圖Fig.1 Process flow diagram

1.3.1.1 脫脂蛋黃粉組分測定

脫脂蛋黃粉中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、水分以及灰分含量,分別采用GB 5009.5—2016、GB 5009.6—2016、GB 5009.3—2016、GB 5009.4—2016測定。

1.3.1.2 預(yù)處理

對脫脂蛋黃粉分別進行3種不同方式的預(yù)處理：(1)脫脂蛋黃粉經(jīng)粉碎后過200目篩,再以1∶9(g∶mL)的料液比與去離子水混勻；(2)脫脂蛋黃粉以1∶9(g∶mL)的料液比與去離子水混勻后,300 W超聲處理5 min；(3)脫脂蛋黃粉以1∶9(g∶mL)的料液比與去離子水混勻,90 ℃保溫10 min。以脫脂蛋黃粉不進行預(yù)處理,直接以1∶9(g∶mL)的料液比與去離子水混勻后的樣品作為對照對以上4個體系,調(diào)節(jié)pH值到7.0,以2 000 U/g的酶底比加入中性蛋白酶,50 ℃下攪拌酶解3 h,澄清后通過凱氏定氮法測定卵黃多肽得率,以確定最適預(yù)處理工藝。

1.3.1.3 酶解

對預(yù)處理后的樣品進行酶解,酶解條件參考秦嘉炎等[11]的酶解工藝,并進行優(yōu)化。分別將體系pH值調(diào)節(jié)到7.0、10.0、10.0,用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶進行充分酶解,以2 000 U/g的酶底比分別加入3種蛋白酶,50 ℃下攪拌酶解3 h。通過凱氏定氮法測定卵黃多肽得率,以確定最適酶解用酶。

1.3.1.4 澄清

將酶解后體系中的不溶性雜質(zhì)除去,酶解液中的雜質(zhì)主要是不可被酶解的卵黃高磷蛋白,通過調(diào)節(jié)pH到卵黃高磷蛋白的等電點使其沉淀,然后采用離心、板框過濾等方式進行固液分離。

1.3.1.5 脫色

對脫色的研究采用單因素實驗,對脫色劑的種類、用量、脫色pH、溫度、時間等脫色工藝進行研究。

(1)選用7種不同類型的活性炭(編號1～7)為脫色劑,添加量為20 g/L多肽液,在60 ℃、pH 4.3(澄清后多肽液的pH)條件下脫色2 h,脫色后澄清,測脫色率。

(2)采用(1)中確定的脫色劑,添加量分別設(shè)定為5、10、15、20 g/L多肽液,在60 ℃、pH 4.3條件下脫色2 h,脫色后澄清,測脫色率。

(3)體系pH值分別設(shè)置為3、5、7、9、11,加入(1)中確定的脫色劑,添加量為20 g/L多肽液,60 ℃脫色2 h,脫色后澄清,測脫色率。

(4)脫色溫度分別設(shè)置為30、40、50、60 ℃,加入(1)中確定的脫色劑,添加量為20 g/L多肽液,在pH 4.3的條件下脫色2 h,脫色后澄清,測脫色率。

(5)脫色時間分別設(shè)置為0.5、1、1.5、2 h,加入(1)中確定的脫色劑,添加量20 g/L多肽液,在pH 4.3、60 ℃條件下脫色,脫色后澄清,測脫色率。

通過單因素實驗確定最適脫色條件后,在最適條件下進行驗證實驗,驗證脫色效果。

1.3.1.6 板框二次澄清

為除去添加的脫色劑,利用板框進行二次過濾,以硅藻土為助濾劑循環(huán)過濾,待澄清后收集透過液。

1.3.1.7 脫鹽濃縮

采用100 Da納濾膜,在800 kPa壓力下進行脫鹽濃縮,濃縮至固形物含量為15%時,加入3倍體積水繼續(xù)脫鹽至固形物含量為15%時停止。

1.3.1.8 噴霧干燥

多肽耐熱性較好[12],所以選用常溫立式噴霧干燥,進風(fēng)溫度180～190 ℃,出風(fēng)溫度70～80 ℃。

1.3.2 產(chǎn)品檢測方法

1.3.2.1 卵黃多肽得率測定

采用凱氏定氮法,分別檢測脫脂蛋黃粉和多肽液中的蛋白含量,以公式(1)計算多肽得率。

(1)

式中：V,多肽液的體積,mL；с1,多肽液中的蛋白含量,%；m,脫脂蛋白粉的質(zhì)量,g；с2,脫脂蛋白粉的蛋白含量,%。

1.3.2.2 多肽脫色率測定

參考張毅等[13]的方法,進行修改,取脫色后的多肽液用0.45 μm濾膜過濾,在450 nm波長下,測定濾液吸光值,以公式(2)計算脫色率。

(2)

式中：OD1,脫色前樣品的吸光值；OD2,脫色后樣品的吸光值。

1.3.2.3 多肽回收率測定

采用凱氏定氮法,檢測脫色前后多肽液中的蛋白含量,以公式(3)計算多肽回收率。

(3)

式中：с1,脫色后多肽液中的蛋白含量,%；с2,脫色前多肽液中的蛋白含量,%。

1.3.2.4 多肽液氨基酸組成分析

稱取0.5 mL樣品至水解管中,加入8 mL 6 mol/L HCl溶液,在氮氣保護下酒精噴燈封口,120 ℃水解22 h,加入4.8 mL 10 mol/L NaOH溶液中和,然后用去離子水定容至25 mL,過濾,15 000 r/min離心30 min,取上清液,用0.22 μm濾膜過濾,采用氨基酸分析儀進行分析,按公式(4)計算濾液中人體必需氨基酸的比例。

(4)

1.3.2.5 多肽液肽段分子質(zhì)量分布分析

采用高效液相色譜法,色譜條件：Waters 600高效液相色譜儀(配2487紫外檢測器和M 32工作站),TSKgelG 2000 SW×L 300 mm×7.8 mm,流動相為V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1,檢測波長220 nm,流速0.5 mL/min,柱溫30 ℃。

1.3.2.6 產(chǎn)品水分測定

根據(jù)GB 5009.3—2016測定產(chǎn)品水分。

1.3.2.7 產(chǎn)品灰分測定

根據(jù)GB 5009.4—2016測定產(chǎn)品灰分。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù),所有定量數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料組成成分

對脫脂蛋黃粉進行成分測定,結(jié)果如表1所示。說明提取卵磷脂以后的脫脂蛋黃粉中蛋白質(zhì)純度較高,有利于進行多肽的開發(fā)利用,并且脂質(zhì)含量低,在一定程度上可以減少酶解過程中可能出現(xiàn)的乳化現(xiàn)象,有利于工藝的開發(fā)。

表1 原料成分組成 單位：%

2.2 不同預(yù)處理方法對多肽得率的影響

對脫脂蛋黃粉分別進行200目粉碎、300 W超聲5 min、90 ℃加熱10 min的方式進行預(yù)處理,以不進行預(yù)處理的樣品作為對照,研究預(yù)處理方式對最終多肽得率的影響。由圖2可知,原料經(jīng)200目粉碎處理可以顯著提高卵黃多肽產(chǎn)品的得率,卵黃多肽得率可達72.6%,相比于超聲預(yù)處理和加熱預(yù)處理(卵黃多肽得率分別為56.3%和59.2%),粉碎更適用于作為卵黃多肽生產(chǎn)的預(yù)處理工藝。主要原因是脫脂蛋黃粉在卵磷脂提取過程中,經(jīng)酒精等有機溶劑處理后蛋白嚴重變性,蛋白聚集結(jié)塊,分散性差,不易溶解在水中。粉碎預(yù)處理會使脫脂蛋黃粉均勻地分散在溶液中,更有利于后續(xù)酶解過程中酶和底物蛋白的充分接觸,進而促進了酶解的進行,提高了卵黃多肽得率。

圖2 不同預(yù)處理方式對多肽得率的影響Fig.2 Effects of different pretreatment methods on polypeptide yield

2.3 不同酶種類對卵黃多肽得率的影響

分別用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶對預(yù)處理后的體系進行酶解,圖3表明,中性蛋白酶酶解后卵黃多肽的得率最高為72.6%,另外2種蛋白酶作用后的得率也接近70%,三者差距不大,但是考慮到后續(xù)需要調(diào)節(jié)pH使雜蛋白沉淀,為減少酸堿用量,降低后續(xù)脫鹽處理的工作量,選擇中性蛋白酶進行酶解。

圖3 不同酶對多肽得率的影響Fig.3 Effects of different enzymes on polypeptide yield

2.4 不同澄清工藝的影響

為了除去不溶性雜質(zhì),分別嘗試了離心和板框過濾的方式,結(jié)果表明兩者均可達到固液分離的目的。離心分離的條件為6 500 r/min、10 min,板框過濾的過濾壓力為200 kPa。相比之下,板框過濾更適宜于工業(yè)化大規(guī)模澄清操作,考慮到工業(yè)化效益,選擇采用板框過濾的方式進行澄清。

2.5 不同脫色劑對卵黃多肽脫色效果的影響

實驗選用了7種不同的活性炭脫色劑,1～7號活性炭的粒度依次降低。如圖4所示,7號活性炭的脫色效果較好,脫色率高達69.7%,可能是因為7號活性炭粒度為200目,相比其他活性炭顆粒比表面積大,對有色物質(zhì)吸附效果好。因此選擇7號活性炭作為脫色劑,進行后續(xù)的脫色工藝優(yōu)化。

圖4 不同脫色劑種類對脫色效果的影響Fig.4 Effect of different kinds of decolorizing agents on decolorization

2.6 體系pH值對脫色效果的影響

實驗設(shè)置了pH 3、5、7、9、11五個梯度,結(jié)果表明隨著體系pH值的升高,卵黃多肽脫色率降低(圖5),在pH 3的時候,脫色率最高為88%,表明在酸性條件下活性炭的脫色效率優(yōu)于堿性條件,可能是因為7號活性炭的等電點在6.8,體系pH越低活性炭所帶正電荷越多。多肽液中的呈色物質(zhì)可能是帶負電荷,靜電相互作用力使得體系在酸性條件下脫色效果比較好,這與之前報道的pH對其他多肽脫色的影響規(guī)律一致[14-16]；多肽回收率隨著pH的升高變化趨勢不明顯,可能是因為肽段帶電荷比較少,受pH影響不大[17]。由于多肽液的初始pH值為4.3左右,為簡化操作工藝,可在此pH條件下直接脫色。

圖5 體系pH對脫色效果的影響Fig.5 Effect of system pH on decolorization

2.7 脫色溫度對脫色效果的影響

實驗設(shè)置了30、40、50、60 ℃四個梯度,圖6結(jié)果表明當(dāng)脫色溫度從30 ℃升高到50 ℃時,脫色率由17.5%上升到67.3%,多肽回收率由97.4%下降到了62.7%；溫度繼續(xù)升高兩者變化均不大,因此50 ℃是比較合適的脫色溫度。在30～50 ℃,隨著溫度升高,活性炭對呈色物質(zhì)和多肽的吸收率都會上升,導(dǎo)致脫色率和多肽損失率同時上升,50 ℃可能是活性炭的最適吸附溫度,因此超過50 ℃,二者變化均不明顯。在50 ℃時,脫色率與多肽回收率都超過60%,綜合考慮脫色率與多肽回收率,選擇50 ℃為脫色溫度。

圖6 體系溫度對脫色效果的影響Fig.6 Effect of system temperature on decolorization

2.8 脫色時間對脫色效果的影響

實驗設(shè)置了30、60、90、120 min四個時間梯度,圖7結(jié)果表明,隨著脫色時間延長,脫色率為65%～70%,變化不大,這表明脫色劑添加量為20 g/L時,30 min內(nèi)脫色劑已經(jīng)基本可以飽和吸附,延長吸附時間對脫色劑吸附效果影響不大,多肽回收率也在60%～70%，說明脫色時間對多肽回收率的影響同樣不明顯,因此選擇30 min作為吸附時間,并進一步研究確定脫色劑的添加量。

圖7 脫色時間對脫色效果的影響Fig.7 Effect of system time on decolorization

2.9 脫色劑添加量對脫色效果的影響

實驗設(shè)置了5、10、15、20g/L四個脫色劑添加量梯度,結(jié)果如圖8所示,脫色劑的添加量從5 g/L增加到10 g/L,脫色率明顯上升,添加量超過10 g/L后,脫色率提高不明顯,但是多肽回收率會較大幅度下降。在添加量為10 g/L時,脫色率可以達到72%,而多肽回收率可以達到87%,綜合考慮脫色率和多肽回收率這2個指標(biāo),10 g/L的脫色劑添加量是比較合理的。

圖8 脫色劑添加量對脫色效果的影響Fig.8 Effect of amount of decolorizer added on decolorization

2.10 最適脫色條件下進行的脫色驗證

綜上所述,向多肽液中添加10 g/L的7號活性炭,在50 ℃、pH 4.3的條件下脫色30 min進行驗證,結(jié)果測定脫色率為72.34%,多肽回收率為84.76%,可以滿足卵黃多肽工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

2.11 脫色前后卵黃多肽的氨基酸組成分析

對脫色前后的多肽液進行氨基酸序列分析,探究脫色工藝對多肽樣品氨基酸組成的影響。氨基酸組成是評價多肽營養(yǎng)性的重要指標(biāo)[18],為確定脫色過程對卵黃多肽氨基酸組成的影響,對脫色前后的多肽液氨基酸組成進行分析,結(jié)果如表2所示,活性炭脫色會同時吸附一部分氨基酸,主要是谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸,以及脯氨酸和亮氨酸等非極性氨基酸,這是因為天冬氨酸和谷氨酸的等電點<4.3,而7號活性炭的等電點為6.8,在體系pH值為4.3時,活性炭帶正電荷,而天冬氨酸和谷氨酸帶負電,因此容易被活性炭吸附?；钚蕴勘旧硎欠菢O性吸附劑,所以也會對非極性的氨基酸有比較強的吸附能力。絲氨酸和酪氨酸在酸水解處理中會有不同程度的破壞[19],測定值偏低,色氨酸完全破壞,無法檢測。但是脫色后的多肽液中人體必需氨基酸(除色氨酸)比例達到32.9%,含量豐富,表明卵黃多肽產(chǎn)品具有較高的營養(yǎng)價值。

表2 脫色前后氨基酸的組成與含量 單位：mg/mL

2.12 脫色前后多肽液的肽段分子質(zhì)量分析

對脫色前后的多肽液進行肽段分子質(zhì)量分布分析,結(jié)果見表3。結(jié)果表明脫色前后多肽的主要肽段分子質(zhì)量均集中在180～500 Da區(qū)間,表明卵黃多肽產(chǎn)品中含量最高的是二肽至五肽的小肽,這些小肽段最易被人體吸收[20-22],表明卵黃多肽產(chǎn)品具有良好的體內(nèi)吸收性能。

表3 脫色前后的肽段分子質(zhì)量分布Table 3 Molecular weight distribution of peptides before and after decolorization

2.13 產(chǎn)品水分與灰分測定

對噴霧干燥后的卵黃多肽進行水分測定,結(jié)果見表4,產(chǎn)品水分為(6.3±0.5)%,灰分為(3.9±0.3)%,均符合大豆多肽和膠原蛋白肽的國標(biāo)要求,因此可以滿足普通多肽的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。

表4 產(chǎn)品中的水分和灰分含量 單位：%

3 結(jié)論

本實驗以工業(yè)化提取蛋黃卵磷脂后剩余的低值脫脂蛋黃粉副產(chǎn)品為原料,研究了一種具有工業(yè)化應(yīng)用前景的卵黃多肽生產(chǎn)工藝,結(jié)果顯示,將脫脂蛋黃粉原料粉碎至200目,經(jīng)中性蛋白酶酶解后,經(jīng)板框過濾澄清得到卵黃多肽清液,多肽得率可達到72.6%。選用7號活性炭,在添加量為10 g/L、50 ℃、pH 4.3、吸附30 min的條件下，脫色率可達72.34%,多肽回收率為84.76%。最后的產(chǎn)品分析表明,脫色后產(chǎn)品必需氨基酸占比高達32.9%,氨基酸組成均衡、肽段組成主要為二肽到五肽,是最適合人體吸收的肽段形式。本工藝具備良好的工業(yè)化應(yīng)用前景,產(chǎn)品具有較高的營養(yǎng)價值和較好的人體吸收性能,可實現(xiàn)低值脫脂蛋黃粉副產(chǎn)品的綜合利用,有效提高產(chǎn)品附加值,豐富蛋品精深加工產(chǎn)品種類,拓寬蛋制品深加工的產(chǎn)業(yè)鏈。